一種新型的生物素誘導(dǎo)的真核基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)的建立

葉玲玲，劉紅，李世崇，王啟偉，藍(lán)三春，陳昭烈

1 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所，北京 100071

2 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院，北京 100071

生物技術(shù)與方法

一種新型的生物素誘導(dǎo)的真核基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)的建立

葉玲玲1，劉紅1，李世崇1，王啟偉1，藍(lán)三春2，陳昭烈1

1 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所，北京 100071

2 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院，北京 100071

為建立一種適用于生物制藥工業(yè)和基因治療領(lǐng)域的基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)，構(gòu)建枯草芽胞桿菌生物素連接酶 (BS-BirA) 與轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的融合蛋白，以其表達(dá)載體為調(diào)控載體；在弱化的CMV啟動子上游連接BS-BirA特異的操縱子序列，獲得響應(yīng)載體，從而得到響應(yīng)于生物素的真核基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)BS-Biotin-On。以增強(qiáng)型綠色熒光蛋白 (EGFP) 為報(bào)告基因?qū)υ撓到y(tǒng)進(jìn)行考察，結(jié)果表明，與現(xiàn)有的類似調(diào)控系統(tǒng)相比，該系統(tǒng)具有良好的誘導(dǎo)率；可通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)體系中生物素的濃度，實(shí)現(xiàn)對目的基因表達(dá)水平快速、較高效的調(diào)節(jié)。上述結(jié)果表明，BS-Biotin-On系統(tǒng)可能為外源基因的調(diào)控表達(dá)提供新的選擇。

生物素，基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)，誘導(dǎo)率，BirA

基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)能夠在時空上控制目的基因的表達(dá)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究中，例如，功能基因組研究、組織工程、系統(tǒng)生物學(xué)、藥物研發(fā)、基因治療、生物藥物生產(chǎn)和功能材料的設(shè)計(jì)等[1-4]。最初開發(fā)的適用于哺乳動物細(xì)胞的基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)采用的誘導(dǎo)劑分子包括抗生素、免疫抑制劑或激素及其衍生物等，這些調(diào)控系統(tǒng)在培養(yǎng)體系和轉(zhuǎn)基因動物中表現(xiàn)出了良好的調(diào)控效果，但是由于具有生理活性的誘導(dǎo)劑分子具有某些臨床副作用，使得它們在基因治療和生物藥物生產(chǎn)中的應(yīng)用受到了限制[5-6]。新一代的基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)使用臨床上惰性的誘導(dǎo)劑分子，如精氨酸、維生素H (亦稱生物素) 以及光等[7-9]。

Weber等于2007年和2009年分別建立和改造了以生物素為誘導(dǎo)劑的外源基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)，以SEAP為報(bào)告基因驗(yàn)證了該系統(tǒng)在HEK293-T、COS-7和CHO-K1細(xì)胞中的有效性[10-11]。該系統(tǒng)的一個重要組分是來自大腸桿菌Escherichia coli的生物素連接酶BirA，BirA是一種雙功能蛋白，既可在ATP存在下激活生物素并將其與特異的蛋白受體相連接，又可與激活的生物素相結(jié)合，發(fā)生構(gòu)象變化，進(jìn)而結(jié)合位于生物素合成操作元上游的特異操縱子序列 (OBirA)，抑制該操作元的轉(zhuǎn)錄。該系統(tǒng)利用BirA的上述特性，將其與單純皰疹病毒轉(zhuǎn)錄激活因子VP16的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域構(gòu)建成人工轉(zhuǎn)錄激活因子BirA-VP16，獲得的BirA-VP16可在生物素存在下，結(jié)合并激活含有3個拷貝OBirA的最小CMV啟動子，從而激活下游目的基因的轉(zhuǎn)錄 (圖1)。受上述研究啟發(fā)，本文用來自于枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis的生物素連接酶 (BS-BirA) 代替來自大腸桿菌的生物素連接酶 (EC-BirA)，構(gòu)建了BS-BirA與VP16核心轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的4個串聯(lián)重復(fù) (稱VP4) 的融合轉(zhuǎn)錄激活因子，建立了一種新型的以生物素為誘導(dǎo)劑的基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了對目的基因表達(dá)水平快速、較高效的調(diào)節(jié)，為外源基因的調(diào)控表達(dá)提供了新的選擇。

圖1 生物素誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)示意圖[11]Fig. 1 Molecular configuration of the biotin-inducible expression system[11].

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒和細(xì)胞

大腸桿菌DH5α菌株購自蓋寧公司；TOP10感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；枯草芽胞桿菌BS168基因組由本所熊向華惠贈；pcDNA3.1(+) 載體購自Invitrogen公司；pTRE載體由本所熊福銀惠贈；人工轉(zhuǎn)錄因子GVP4表達(dá)載體pc-Hy-GVP4、組成型表達(dá)EGFP基因的pc-Hy-E載體均為本課題組構(gòu)建；HEK293細(xì)胞購自Gibco公司。

1.2 培養(yǎng)基和試劑

常規(guī)DMEM/F12 (1∶1) 液體培養(yǎng)基和無生物素DMEM/F12 (1∶1) [稱為DF (Bio-)] 液體培養(yǎng)基購自北京鈕因華信公司；新生牛血清(NBS) 購自蘭州民海生物工程有限公司；脂質(zhì)體Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司；G418和潮霉素B購自Merck公司；Streptavidin agarose購自Novagen公司；生物素 (Biotin) 購自Amresco公司；兔抗GFP多抗購自南京碧云天生物科技有限公司；DNA序列全合成由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和篩選

HEK293細(xì)胞正常貼壁培養(yǎng)于添加5% (V/V) NBS的DMEM/F12 (1∶1) 培養(yǎng)基中，37 ℃，5% CO2。

轉(zhuǎn)染步驟依脂質(zhì)體說明書、在24孔板中進(jìn)行，共轉(zhuǎn)染的兩種質(zhì)粒摩爾比為1∶1，每孔總計(jì)1 μg，每種轉(zhuǎn)染重復(fù)2孔。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞用含400 μg/mL G418和300 μg/mL 潮霉素B的篩選培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。

1.4 基于BS-BirA、以生物素為誘導(dǎo)劑的基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)BS-Biotin-On的構(gòu)建

1.4.1 BS-Biotin-On系統(tǒng)調(diào)控載體的構(gòu)建

各引物序列見表1。從BS 168基因組中克隆BS-BirA基因，引物為BS-BirA-5和BS-BirA-3，將BS-BirA與酶切自pc-Hy-GVP4載體的VP4片段進(jìn)行重疊PCR，引物為BS-BirA-5和VP-3，獲得的融合轉(zhuǎn)錄激活因子BS-BV連入pcDNA3.1 (+) 載體，得到BS-Biotin-On系統(tǒng)的調(diào)控載體pc-BS-BV。

表1 本文中涉及的核苷酸序列Table 1 Nucleotide sequences involved in this article

1.4.2含不同拷貝數(shù)操縱子的BS-Biotin-On系統(tǒng)響應(yīng)載體的構(gòu)建

通過引物BSOB-5和BSOB-3退火獲得BS-BirA特異的操縱子 (BSOB) 片段，自pTRE質(zhì)?？寺∽钚MV啟動子 (PminCMV)，引物為minCMV-5和minCMV-3，將BSOB和PminCMV依次連入EGFP表達(dá)載體pc-Hy-E野生型CMV啟動子的位置，得到含1個拷貝BSOB的BS-Biotin-On系統(tǒng)的響應(yīng)載體pc-Hy-BSOB-minE。

通過全合成獲得4個串聯(lián)重復(fù)的BSOB序列4BSOB (表1)，經(jīng)NruⅠ/MluⅠ酶切后連入同樣酶切的pc-Hy-minE載體，得到含4個拷貝BSOB的BS-Biotin-On響應(yīng)載體，命名為pc-Hy-4BSOB-minE；該載體再分別經(jīng)Bgl Ⅱ和MfeⅠ酶切后自連，得到含3個和2個拷貝BSOB的BS-Biotin-On響應(yīng)載體，分別命名為pc-Hy-3BSOB-minE和pc-Hy-2BSOB-minE。

1.4.3基于EC-BirA的EC-Biotin-On系統(tǒng)的構(gòu)建

從大腸桿菌DH5α中克隆EC-BirA基因，引物為EC-BirA-5和EC-BirA-3，與酶切自pc-Hy-GVP4載體的VP4片段一起連入pcDNA3.1(+) 載體，得到融合轉(zhuǎn)錄激活因子EC-BV的表達(dá)載體，命名為pc-EC-BV，此為EC-Biotin-On系統(tǒng)的調(diào)控載體；EC-BirA特異的操縱子 (ECOB) 序列為：5′-CTAATTGTTAACC TTTGAATATAATTGGTTAACAATTTAG-3′，通過全合成獲得3個串聯(lián)重復(fù)的ECOB，5′和3′末端分別為MfeⅠ和MluⅠ酶切位點(diǎn)，雙酶切后連入同樣酶切的pc-Hy-minE載體，得到響應(yīng)于生物素的EGFP誘導(dǎo)表達(dá)載體pc-Hy-3ECOB-minE，此為EC-Biotin-On系統(tǒng)的響應(yīng)載體。

1.5 BS-Biotin-On系統(tǒng)的考察和評價

1.5.1 BS-Biotin-On系統(tǒng)與EC-Biotin-On系統(tǒng)誘導(dǎo)率的比較

向NBS中加入0.5% (V/V) 鏈親和素瓊脂糖珠，室溫孵育15 min，用0.22 μm濾膜過濾除去珠子及除菌，得到去除生物素的NBS [稱為NBS (Bio-)]。

將pc-BS-BV/pc-Hy-3BSOB-minE和pc-ECBV/pc-Hy-3ECOB-minE分別共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，經(jīng)抗生素篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞混合克隆，分別稱為HEK-3BSE和HEK-3ECE。將這兩種細(xì)胞分別接種24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞貼壁后，更換為無生物素和含200 μmol/L生物素兩種培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)3 d，借助流式細(xì)胞儀檢測EGFP熒光強(qiáng)度情況。

1.5.2操縱子數(shù)目對BS-Biotin-On系統(tǒng)效果的影響

將pc-BS-BV和含1?4個拷貝BSOB的EGFP誘導(dǎo)表達(dá)載體pc-Hy-(1-4)BSOB-minE分別共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，經(jīng)篩選得到混合細(xì)胞克隆。以組成型表達(dá)EGPF的載體pc-Hy-E和pc-Hy-BSOB-minE載體單轉(zhuǎn)染的細(xì)胞分別作為陽性對照和陰性對照，考察無生物素和200 μmol/L生物素兩種培養(yǎng)條件下培養(yǎng)3 d后EGFP的相對熒光強(qiáng)度。

1.5.3 Western blotting檢測EGFP蛋白表達(dá)

Western blotting實(shí)驗(yàn)由北京康為世紀(jì)生物科技有限公司完成。GFP抗體稀釋度為1∶5 000，β-actin抗體稀釋度為1∶5 000。

2 結(jié)果與分析

2.1 BS-Biotin-On系統(tǒng)的構(gòu)建

2.1.1 BS-Biotin-On系統(tǒng)調(diào)控載體的構(gòu)建

枯草芽胞桿菌生物素連接酶 (BS-BirA) 基因全長978 bp，克隆自枯草芽胞桿菌BS168基因組 (圖2A)。BS-BirA與VP4 (單純皰疹病毒VP16蛋白核心轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的4個串聯(lián)重復(fù)，長度約150 bp，圖2B) 經(jīng)重疊PCR獲得融合轉(zhuǎn)錄激活因子BS-BV (圖2C)，BS-BV連入pcDNA3.1(+)載體，得到BS-BV的組成型表達(dá)載體pc-BS-BV，為BS-Biotin-On系統(tǒng)的調(diào)控載體 (圖3A)。

2.1.2含不同拷貝數(shù)BSOB的BS-Biotin-On響應(yīng)載體的構(gòu)建

將BS-BirA特異的操縱子BSOB片段 (184 bp，全合成獲得) 和最小CMV啟動子 (PminCMV，約120 bp，圖4) 依次連入EGFP組成型表達(dá)載體pc-Hy-E，代替其野生型CMV啟動子的位置，得到含1個拷貝操縱子的BS-Biotin-On系統(tǒng)響應(yīng)載體pc-Hy-BSOB-minE (圖3B)。

圖2 BS-BV融合基因的獲得Fig. 2 Procedure to obtain BS-BV fuse-gene. (A) PCR amplification of BS-BirA. 1: DNA marker; 2: PCR product of BS-BirA. (B) Enzyme digestion to obtain VP4 fragment. 1: digestion of pc-Hy-GVP4; 2: DNA marker. (C) Overlapping PCR to obtain BS-BV fuse-gene. 1: PCR product of BS-BV; 2: DNA marker.

圖3 BS-Biotin-On系統(tǒng)質(zhì)粒示意圖Fig. 3 Diagrams of plasmids comprised of BS-Biotin-On systems. (A) Regulatory vector. (B) Response vector.

圖4 PCR擴(kuò)增最小CMV啟動子Fig. 4 PCR amplification of minimal CMV promoter. 1: DNA marker; 2: PCR product of PminCMV.

通過全合成獲得4個串聯(lián)重復(fù)的BSOB序列，連入pc-Hy-minE載體的PminCMV啟動子上游 (圖5A)，得到含4個拷貝BSOB的BS-Biotin-On響應(yīng)載體pc-Hy-4BSOB-minE；該載體再分別經(jīng)BglⅡ和MfeⅠ酶切后 (圖5B) 自連，得到含3個和2個拷貝BSOB的BS-Biotin-On響應(yīng)載體pc-Hy-3BSOB-minE和pc-Hy-2BSOB-minE。

圖5 含不同數(shù)目BSOB的響應(yīng)載體的構(gòu)建Fig. 5 Construction of response vectors with different copies of BSOBs. (A) Construction of response vector with four BSOBs. 1: enzyme digestion to obtain 4BSOB fragment; 2: DNA marker DL5 000; 3: enzyme digestion of pc-minE vector. (B) Construction of response vectors with two and three copies of BSOBs. 1: enzyme digestion to remove two copies of BSOBs; 2: DNA marker DL5 000; 3: enzyme digestion to remove one copy of BSOB.

2.1.3 EC-Biotin-On系統(tǒng)的構(gòu)建

大腸桿菌生物素連接酶 (EC-BirA) 基因全長966 bp，克隆自大腸桿菌DH5α基因組 (圖6)。EC-BirA與VP4片段一起，連入Nhe/ⅠNotⅠ酶切的pcDNA3.1(+) 載體，得到融合基因EC-BV的表達(dá)載體pc-EC-BV，為EC-Biotin-On系統(tǒng)的調(diào)控載體。EC-Biotin-On系統(tǒng)的響應(yīng)載體與BS-Biotin-On系統(tǒng)類似，為了便于比較，本研究構(gòu)建了含3個拷貝ECOB的響應(yīng)載體，3ECOB片段由全合成獲得，連入pc-Hy-minE載體的PminCMV上游，得到的載體命名為pc-Hy-3ECOB-minE。

2.2 BS-Biotin-On系統(tǒng)的考察和評價

2.2.1 BS-Biotin-On系統(tǒng)與EC-Biotin-On系統(tǒng)效果的比較

將pc-BS-BV/pc-Hy-3BSOB-minE和pc-ECBV/pc-Hy-3ECOB-minE分別共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，經(jīng)抗生素篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞混合克隆，分別稱為HEK-3BSE和HEK-3ECE。將這兩種細(xì)胞分別接種24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞貼壁后，更換為無生物素和含200 μmol/L生物素兩種培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)3 d，借助流式細(xì)胞儀檢測EGFP熒光強(qiáng)度情況 (圖7)。結(jié)果表明，含3個拷貝BSOB的BS-Biotin-On系統(tǒng)的誘導(dǎo)率 (誘導(dǎo)后目的基因表達(dá)與本底表達(dá)的比率) 為3.8，顯著高于含3個拷貝ECOB的EC-Biotin-On系統(tǒng) (誘導(dǎo)率為2.8)。

圖6 PCR擴(kuò)增EC-BirA基因Fig. 6 PCR amplification of EC-BirA gene. 1: PCR product of EC-BirA; 2: DNA marker.

2.2.2操縱子數(shù)目對BS-Biotin-On系統(tǒng)效果的影響

將pc-BS-BV和含1?4個拷貝BSOB的EGFP誘導(dǎo)表達(dá)載體pc-Hy-(1-4)BSOB-minE分別共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，經(jīng)篩選得到混合細(xì)胞克隆。以組成型表達(dá)EGPF的載體pc-Hy-E和pc-Hy-BSOB-minE載體單轉(zhuǎn)染的細(xì)胞分別作為陽性對照和陰性對照，考察無生物素和

200 μmol/L生物素兩種培養(yǎng)條件下培養(yǎng)3 d后EGFP的相對熒光強(qiáng)度 (圖8)。結(jié)果表明，含1?4個拷貝BSOB的BS-Biotin-On系統(tǒng)的誘導(dǎo)率逐漸升高，依次為1.5、2.1、4.1和6.2；同時，隨著BSOB拷貝數(shù)的增加，無生物素時的EGFP背景表達(dá)略有升高，相對熒光強(qiáng)度由93.69升高至128.95，但均與pc-Hy-BSOB-minE單轉(zhuǎn)染情況下的EGFP表達(dá)無明顯差別。含4個拷貝BSOB的響應(yīng)載體經(jīng)誘導(dǎo)后的EGFP相對熒光強(qiáng)度與野生型CMV啟動子驅(qū)動的EGFP (pc-Hy-E)表達(dá)強(qiáng)度接近。另外，pc-Hy-E轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在不同的生物素濃度條件下的EGFP相對熒光強(qiáng)度接近，表明生物素存在與否對EGFP的表達(dá)水平無顯著影響。

從背景表達(dá)和誘導(dǎo)強(qiáng)度兩方面綜合考慮，在目前考察的BSOB拷貝數(shù)中，認(rèn)為含4個拷貝BSOB的響應(yīng)載體效果最好。

圖7 BS-Biotin-On系統(tǒng)和EC-Biotin-On系統(tǒng)誘導(dǎo)率的比較Fig. 7 Comparison of induction ratio between BS-Biotin-On and EC-Biotin-On systems. *statistically different with the control.

2.2.3 BS-Biotin-On系統(tǒng)的誘導(dǎo)動力學(xué)

選取調(diào)控質(zhì)粒和含4個拷貝BSOB的EGFP誘導(dǎo)表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞 (稱為HEK-4BSE) 為研究對象，進(jìn)一步考察在不同濃度的生物素存在下BS-Biotin-On系統(tǒng)的響應(yīng)情況，以及EGFP熒光強(qiáng)度隨誘導(dǎo)劑存在時間的變化情況。將HEK-4BSE培養(yǎng)于含不同濃度生物素的培養(yǎng)體系中，3 d后檢測EGFP熒光強(qiáng)度(圖9A)，結(jié)果顯示，隨著生物素濃度的增加，EGFP表達(dá)顯著升高，在生物素濃度為10?100 μmol/L時達(dá)到最高，當(dāng)生物素濃度高于500 μmol/L后，進(jìn)一步增加生物素濃度，EGFP表達(dá)略有降低。在200 μmol/L生物素存在時，HEK-4BSE細(xì)胞EGFP誘導(dǎo)表達(dá)隨時間變化的動力學(xué)曲線 (圖9B) 顯示，誘導(dǎo)后EGFP表達(dá)水平迅速升高，至48?72 h達(dá)到最高并趨于穩(wěn)定。Western blotting檢測誘導(dǎo)后不同時間EGFP蛋白表達(dá)情況顯示了類似的結(jié)果 (圖9C)。

圖8 不同操縱子數(shù)目對BS-Biotin-On系統(tǒng)效果的影響Fig. 8 Effect of operator number on the efficiency of BS-Biotin-On systems.

圖9 BS-Biotin-On系統(tǒng)的誘導(dǎo)動力學(xué)Fig. 9 Inductive kinetics of BS-Biotin-On system. (A) Response of BS-Biotin-On system to different concentrations of biotin. (B) Time course of induced EGFP intensity. (C) EGFP expression at different time points identified by Western blotting.

3 討論

大腸桿菌生物素連接酶BirA是發(fā)現(xiàn)最早、研究得最清楚的生物素連接酶，含321 Aas，分子量33.5 kDa[12]。EC-BirA能夠結(jié)合位于生物素合成操縱元啟動子上游的特異操縱子序列，抑制生物素合成操縱元的轉(zhuǎn)錄[13-14]。突變實(shí)驗(yàn)表明，EC-BirA的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域位于N-末端，而酶活性和生物素結(jié)合位點(diǎn)位于中間結(jié)構(gòu)域，BirA以兩個單體的形式結(jié)合于一個40 bp不完全對稱的回文序列上[15]。另一個研究得較多的生物素連接酶來自革蘭氏陽性細(xì)菌枯草芽胞桿菌，BS-BirA含325 Aas，分子量為36.2 kDa。該蛋白具有與EC-BirA類似的雙功能特性，是枯草芽胞桿菌生物素操作元的抑制因子，并且具有生物素連接酶活性，能夠補(bǔ)償大腸桿菌的條件致死birA突變[16]。但是，BS-BirA的氨基酸序列與EC-BirA僅有27%的同源性，在與該蛋白的轉(zhuǎn)錄抑制因子功能有關(guān)的3個關(guān)鍵位點(diǎn)中，DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與EC-BirA同源性較低，這與二者相應(yīng)的操縱子序列不同有關(guān)；生物素結(jié)合位點(diǎn)二者一致；ATP結(jié)合位點(diǎn)有所不同(BS-BirA中為GRGRMS，EC-BirA中為GRGRRG)[17]。以上差異可能會造成BS-BirA與EC-BirA在操縱子序列結(jié)合的特異性及對生物素響應(yīng)的靈敏性等方面的不同。

在上述理論的基礎(chǔ)上，本研究以BS-BirA與單純皰疹病毒轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域核心序列的4個串聯(lián)重復(fù)的融合蛋白 (BS-BirA-VP4) 為轉(zhuǎn)錄激活因子，建立了一種響應(yīng)于生物素的誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)——BS-Biotin-On，并比較了其與文獻(xiàn)報(bào)道的基于EC-BirA的生物素誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)在目的基因誘導(dǎo)率方面的差異，結(jié)果表明，同樣在3個拷貝操縱子存在下，BS-Biotin-On系統(tǒng)的誘導(dǎo)率 (3.8) 顯著高于EC-Biotin-On系統(tǒng) (2.8)，且二者EGFP本底表達(dá)強(qiáng)度接近。本研究進(jìn)一步考察了BS-Biotin-On系統(tǒng)中操縱子數(shù)目對誘導(dǎo)效果的影響，在考察的1?4個BSOB數(shù)目范圍內(nèi)，隨著操縱子數(shù)目的增加，誘導(dǎo)率顯著增加，同時，EGFP背景表達(dá)強(qiáng)度也有所升高，但均與單轉(zhuǎn)染pc-Hy-BSOB-minE的陰性對照無顯著差別。對含4個BSOB的BS-Biotin-On系統(tǒng)的進(jìn)一步研究表明，該系統(tǒng)對生物素響應(yīng)靈敏，誘導(dǎo)后6 h EGFP表達(dá)即升高1倍，至48?72 h達(dá)到最高，并且在較低的生物素濃度下 (10 μmol/L)即可達(dá)到較高的誘導(dǎo)率。

與其他類似的研究不同的是，本研究采用EGFP，而不是通常使用的SEAP作為考察誘導(dǎo)表達(dá)效果的報(bào)告基因，其優(yōu)勢在于：1) 可以通過流式細(xì)胞儀來檢測其表達(dá)強(qiáng)度，操作方便快速，結(jié)果可靠，而SEAP的表達(dá)水平則需較繁瑣的ELISA方法來測定；2) 可通過流式細(xì)胞分選技術(shù)從混合細(xì)胞克隆中挑選不同誘導(dǎo)強(qiáng)度的單細(xì)胞，節(jié)省時間和精力，極大地提高建立細(xì)胞系的效率[18-19]。對于EGFP熒光強(qiáng)度與其蛋白表達(dá)水平的關(guān)系，目前還沒有定量的報(bào)道，但從Hicham等[20]的報(bào)道來看，二者應(yīng)不是簡單的正比關(guān)系，本研究中流式細(xì)胞儀檢測的熒光強(qiáng)度與Western blotting獲得的EGFP蛋白水平的對應(yīng)關(guān)系也顯示了類似的結(jié)果，故本研究得到的誘導(dǎo)率與以SEAP為報(bào)告基因的系統(tǒng)的對比還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。

對于最適合生物制藥應(yīng)用的外源基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)目前有公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)[21-22]：1) 抑制條件下產(chǎn)物基因的泄漏表達(dá)不應(yīng)影響培養(yǎng)過程；2)在充分誘導(dǎo)條件下的最高表達(dá)水平可與標(biāo)準(zhǔn)組成型啟動子的情況相比；3) 簡潔的基因設(shè)計(jì)，便于改造和篩選生產(chǎn)細(xì)胞系；4) 誘導(dǎo)劑分子應(yīng)是生理上惰性的，是獲批的生產(chǎn)培養(yǎng)基的成分或宿主細(xì)胞代謝的組成部分；5) 系統(tǒng)對誘導(dǎo)劑分子的響應(yīng)足夠迅速。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，本研究建立的BS-Biotin-On系統(tǒng)能夠符合上述標(biāo)準(zhǔn)，可以初步用于工程細(xì)胞系的增殖控制等需要對基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控的工藝。

4 小結(jié)

本研究建立了一種基于枯草芽胞桿菌生物素連接酶、響應(yīng)于生物素的外源基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)，該系統(tǒng)設(shè)計(jì)簡潔、應(yīng)用方便、背景表達(dá)較低、誘導(dǎo)率較高、響應(yīng)迅速，使用的誘導(dǎo)劑生物素為用于生物制藥的生產(chǎn)用培養(yǎng)基的組分之一，絕對無毒，價格低廉，并且對細(xì)胞生長和產(chǎn)物表達(dá)無明顯影響，基于以上優(yōu)點(diǎn)，該系統(tǒng)在基礎(chǔ)研究、生物制藥、基因治療和組織工程等領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價值。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Establishment of a novel biotin-inducible eukaryotic gene regulation system

Lingling Ye1, Hong Liu1, Shichong Li1, Qiwei Wang1, Sanchun Lan2, and Zhaolie Chen1

1 Institute of Biotechnology, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100071, China
2 Affiliated Hospital of Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100071, China

To establish a gene regulation system compatible with biopharmaceutical industry and gene therapy, weconstructed a fusion protein of biotin ligase from Bacillus subtilis (BS-BirA) and the trans-activation domain, and used its expression vector as the regulatory vector. Meanwhile, BS-BirA-specific operators were ligated upstream of attenuated CMV promoter to obtain the response vector. In this way, a novel eukaryotic gene regulation system responsive to biotin was established and named BS-Biotin-On system. BS-Biotin-On system was further investigated with the enhancing green fluorescent protein (EGFP) as the reporter gene. The results showed that our system was superior to the current similar regulation system in its higher induction ratio, and that the expression of interest gene could be tuned in a rapid and efficient manner by changing the biotin concentrations in the cultures. Our results show that the established system may provide a new alternative for the exogenous gene modulation.

biotin, gene regulation system, induction rate, BirA

September 22, 2013; Accepted: October 12, 2013

Zhaolie Chen. Tel: +86-10-66948818; E-mail: chenzl23@sina.com

葉玲玲, 劉紅, 李世崇, 等. 一種新型的生物素誘導(dǎo)的真核基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)的建立. 生物工程學(xué)報(bào), 2014, 30(8): 1256–1265.

Ye LL, Liu H, Li SC, et al. Establishment of a novel biotin-inducible eukaryotic gene regulation system. Chin J Biotech, 2014,30(8): 1256–1265.

Supported by: National Major Special Program of New Drug Research and Development (No. 2011ZX09401-019), National Natural Science foundation of China (No. 81302689).

“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)課題 (No. 2011ZX09401-019)，國家自然科學(xué)基金 (No. 81302689) 資助。