羧酶體結(jié)構(gòu)及其CO2濃縮機(jī)制研究進(jìn)展

張寶燕，田平芳

北京化工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 北京市生物加工過(guò)程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100029

羧酶體結(jié)構(gòu)及其CO2濃縮機(jī)制研究進(jìn)展

張寶燕，田平芳

北京化工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 北京市生物加工過(guò)程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100029

羧酶體 (Carboxysome) 是高效的固碳微體，在CO2濃縮機(jī)制 (CO2-concentrating mechanism，CCM) 中發(fā)揮重要作用。在藍(lán)藻及某些化能自養(yǎng)菌中，羧酶體作為類(lèi)細(xì)胞器包裹1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO) 和碳酸酐酶 (Carbonic anhydrase，CA)，它與無(wú)機(jī)碳轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白共同在胞質(zhì)中積累HCO3–，通過(guò)增加RubisCO周?chē)腃O2濃度來(lái)提高固碳效率。隨著羧酶體結(jié)構(gòu)和功能的闡明，異源表達(dá)羧酶體已成功實(shí)現(xiàn)，并且已鑒定出編碼羧酶體殼蛋白及內(nèi)部組分的基因。首先簡(jiǎn)要介紹羧酶體的發(fā)現(xiàn)和種類(lèi)，然后系統(tǒng)分析其結(jié)構(gòu)及在CCM機(jī)制中的作用，并對(duì)其在代謝工程上的廣闊應(yīng)用前景進(jìn)行了展望。

藍(lán)藻，微體，碳酸酐酶，1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶，CO2濃縮機(jī)制

羧酶體 (Carboxysome) 作為原核細(xì)胞的“細(xì)胞器”，因參與固定CO2及其進(jìn)化生物學(xué)意義而引起了廣泛關(guān)注。亞細(xì)胞組分分化是真核細(xì)胞和原核細(xì)胞的主要區(qū)別之一。真核細(xì)胞中的結(jié)構(gòu)區(qū)域化 (Compartmentalization) 既實(shí)現(xiàn)了代謝途徑的高保真性，提高了酶催化反應(yīng)效率，又降低了代謝物對(duì)細(xì)胞的毒性。原核細(xì)胞只含有一種結(jié)構(gòu)相對(duì)完整的細(xì)胞器，即核糖體。羧酶體標(biāo)志著原核細(xì)胞的功能區(qū)域化，它提高了原核細(xì)胞代謝反應(yīng)的效率，淡化了原核細(xì)胞和真核細(xì)胞之間的嚴(yán)格界限。

無(wú)機(jī)碳進(jìn)入生物圈主要通過(guò)卡爾文循環(huán)(Calvin-Benson-Bassham cycle)。該循環(huán)中，1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶 (RubisCO) 作為限速酶，將CO2固定在核酮糖-1,5-二磷酸(RuBP) 上，生成3-磷酸甘油酸 (3-PGA)。因?yàn)镃O2和O2具有化學(xué)相似性[1]，所以通過(guò)RubisCO催化的固碳反應(yīng)對(duì)O2高度敏感。然而，大氣中O2含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)CO2。為適應(yīng)大氣環(huán)境，自然界進(jìn)化出CO2濃縮機(jī)制 (CO2-concentrating mechanism，CCM) (圖1A和B)，即通過(guò)在細(xì)胞內(nèi)高濃度積累CO2來(lái)提高RubisCO的固碳效率。在CCM中，羧酶體將RubisCO和碳酸酐酶(Carbonic anhydrase，CA) 包裹在半透性外殼中，既阻止了O2進(jìn)入酶的活性位點(diǎn)，又提高了RubisCO周?chē)鶦O2的濃度。

1 羧酶體的發(fā)現(xiàn)

1956年首次在鉤狀席藻Phormidium uncinatum中發(fā)現(xiàn)原核細(xì)胞中的羧酶體 (當(dāng)時(shí)稱(chēng)蛋白復(fù)合體)[2]。1973年Shively等[3]通過(guò)差速離心和蔗糖梯度離心，從那不勒斯鹽生硫桿菌Halothiobacillus neapolitanus中分離出這種蛋白復(fù)合體。該復(fù)合體外圍是蛋白質(zhì)外殼，內(nèi)部包含豐富的RubisCO。為紀(jì)念該發(fā)現(xiàn)，Shively將該復(fù)合體命名為羧酶體。隨后，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)很多細(xì)菌都有羧酶體。迄今為止，攜帶羧酶體的細(xì)菌包括全部藍(lán)藻及部分化能自養(yǎng)菌，如藍(lán)藻中的集胞藻屬Synechocystis、原綠球藻屬Prochlorococcus、念珠藻Nostoc punctiforme、聚球藻屬Synechococcus和魚(yú)腥藻Anabaena cylindrica等；化能自養(yǎng)菌中的H. neapolitanus、嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌Acidithiobacillus ferrooxidans和維氏硝化桿菌Nitrobacter winogradskyi等[4]。研究最多的是藍(lán)藻中Synechocystis sp. PCC 6803和細(xì)長(zhǎng)聚球藻Synechococcus elongates PCC 7942及化能自養(yǎng)菌H. neapolitanus。

2 羧酶體的種類(lèi)

根據(jù)所含RubisCO的不同，可將羧酶體分為兩種：α-羧酶體，包含1A型RubisCO；β-羧酶體，包含1B型RubisCO[5-6]?；蛲蛔兒突蚪M分析顯示[7]，編碼羧酶體結(jié)構(gòu)蛋白的基因主要聚集在基因組的同一基因座上，涉及兩個(gè)啟動(dòng)子：cso和ccm (圖1C)。迄今發(fā)現(xiàn)，由cso啟動(dòng)子編碼的α-羧酶體存在于α, β和γ-變形菌及單細(xì)胞的Synechococcus等海洋藍(lán)藻中[8]，以H. neapolitanus為模式生物。由ccm啟動(dòng)子編碼的β-羧酶體則只存在于藍(lán)藻 (包括纖維狀的藍(lán)藻、含異型胞群的藍(lán)藻及其分支類(lèi)型和組合體，但藻青菌UCYN-A除外[10]) 中[9]，以Synechocystis sp. PCC 6803為模式生物。

3 羧酶體的結(jié)構(gòu)

Schmid等[11]通過(guò)低溫電子斷層掃描(Cryo-ET) 和掃描透射電鏡 (STEM) 技術(shù)觀察到羧酶體呈二十面體對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu) (圖2)。此外，Iancu等[12-13]通過(guò)電鏡觀察了3種化能自養(yǎng)菌的羧酶體，發(fā)現(xiàn)除了典型的二十面體形狀外，羧酶體還有其他形狀 (如不規(guī)則型及細(xì)長(zhǎng)型等)。羧酶體內(nèi)部包裹胞內(nèi)大部分RubisCO，外圍是一層選擇滲透性蛋白外殼。選擇滲透性是由外殼上帶電荷的孔隙形成的。這種外殼既能阻止O2進(jìn)入，又能阻止CO2逸出，即在最小化光呼吸的前提下提高了RubisCO周?chē)鶦O2濃度。另外，外殼必須對(duì)HCO3?具有滲透性，并能透過(guò)RubisCO的底物 (RuBP) 和產(chǎn)物 (3-PGA)。

除RubisCO外，羧酶體中還有少量CA，CA催化HCO3?轉(zhuǎn)變?yōu)镃O2。目前已報(bào)道多種CA[14-15]，如CsoSCA、CcaA和CcmM等。CA是羧酶體內(nèi)以HCO3?為光合可利用CO2的最基本酶。

3.1 羧酶體外殼

圖2 電鏡觀察聚球藻屬Synechococcus sp. WH8102羧酶體[7]Fig. 2 Electron microscopy of carboxysomes in Synechococcus sp. WH8102[7].

羧酶體外殼由幾千個(gè)小蛋白亞基組成，直徑約800?1 400 ? (埃，光譜線波長(zhǎng)單位)[6]。這些蛋白亞基主要含有兩種結(jié)構(gòu)域：BMC (Bacterialmicrocompartment；Pfam00936) 結(jié)構(gòu)域和構(gòu)域的CcmL/EutN (Pfam03319) 結(jié)構(gòu)域。含有BMC結(jié)蛋白聚集成六聚體，六聚體相互連接構(gòu)成二十面體的平面；而含有CcmL/EutN結(jié)構(gòu)域的蛋白聚集成五聚體，五聚體構(gòu)成二十面體的頂點(diǎn)[15-18]。此外，在六聚體對(duì)稱(chēng)軸心處有不同大小及帶電類(lèi)型的孔隙[19]。研究發(fā)現(xiàn)，孔隙處帶有正電荷，而孔隙周?chē)适杷?。?jù)推測(cè)，這些孔隙可作為HCO3?、RuBP及3-PGA等小分子物質(zhì)的代謝通道。HCO3?等陰離子物質(zhì)能輕易通過(guò)帶正電荷的孔隙，而O2和CO2等不帶電分子則不能穿過(guò)羧酶體 (圖3)。

3.1.1 BMC六聚體面蛋白

圖3 羧酶體外殼蛋白高清結(jié)構(gòu)[26]Fig. 3 High-resolution structures of carboxysome shell proteins[26].

BMC蛋白 (具有共同BMC結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)) 是羧酶體最主要的結(jié)構(gòu)成分，由此聚集成的六聚體呈盤(pán)裝結(jié)構(gòu)，相互連接構(gòu)成羧酶體的平面。在β-羧酶體中，擁有單一BMC結(jié)構(gòu)域的蛋白為CcmK1-4，而CcmO蛋白由兩個(gè)BMC結(jié)構(gòu)串聯(lián)而成[20]。Kerfeld等[16]首次從Synechocystis sp. PCC 6803中確定了β-羧酶體外殼蛋白CcmK2和CcmK4的結(jié)構(gòu)。CcmK2蛋白六聚體面同向排列，構(gòu)成均勻的一層；而由CcmK4蛋白構(gòu)成的分子層，其六聚體的凹凸面交替排列。隨后，Cai等[21]發(fā)現(xiàn)β-羧酶體中的假定蛋白——CcmP，認(rèn)為CcmP是β-羧酶體外殼上的串聯(lián)BMC結(jié)構(gòu)域蛋白，形成雙層蛋白結(jié)構(gòu)，能促進(jìn)大分子代謝物通過(guò)羧酶體。其他細(xì)菌的β-羧酶體中可能有更多BMC蛋白。

在α-羧酶體中，CsoS1A-C蛋白具有單獨(dú)BMC結(jié)構(gòu)域。從H. neapolitanus中分離的羧酶體外殼蛋白CsoS1A[17]和CsoS1C[22]與β-羧酶體中的CcmK2結(jié)構(gòu)類(lèi)似。序列分析顯示，CsoS1A和CsoS1C蛋白僅相差兩個(gè)氨基酸，而CsoS1B蛋白在C端額外延伸出12個(gè)氨基酸。此外，Roberts等[23]從原綠球藻Prochlorococcus marinus MED4中分離出一種新型外殼蛋白CsoS1D。研究顯示，CsoS1D蛋白不由cso操縱子編碼，且具有串聯(lián)的BMC結(jié)構(gòu)域，可能作用于羧酶體外殼的結(jié)構(gòu)或功能。

3.1.2五聚體頂點(diǎn)蛋白

羧酶體外殼看似由六聚體組成，但晶體結(jié)構(gòu)顯示，其外殼上還存在一個(gè)椎形結(jié)構(gòu)域構(gòu)成羧酶體的頂點(diǎn)，即CcmL/EutN結(jié)構(gòu)域。羧酶體中含有CcmL/EutN結(jié)構(gòu)域的五聚體蛋白非常保守，α-羧酶體中有CsoS4A和CsoS4B，而β-羧酶體中只有一種，即CcmL。Tanaka等[6]指出：CsoS4A和CcmL蛋白與六聚體蛋白一樣，具有明顯的凹凸面。CcmL蛋白用其突起的C端與相鄰亞基緊密連接，留下一個(gè)狹窄孔隙，CO2通過(guò)該孔隙穿過(guò)羧酶體。隨后，Cai等[18]發(fā)現(xiàn)，在缺乏CsoS4頂點(diǎn)蛋白的H. neapolitanus突變株中，羧酶體外觀結(jié)構(gòu)看似正常，但不再限制CO2的滲透，也不再具有RubisCO催化優(yōu)勢(shì)。因此，頂點(diǎn)蛋白可能有助于羧酶體行使CO2滲透屏障功能。

由此得知，羧酶體外殼平面由大量嵌合的BMC蛋白組成，頂點(diǎn)由少量特異性五聚體蛋白填充。另外，Samborska和Kimber[24]最近發(fā)現(xiàn)，β-羧酶體外殼可能由雙層BMC蛋白組成。該觀點(diǎn)與羧酶體的厚度一致[25]。而且，隨著α-羧酶體外殼蛋白CsoS1D雙層結(jié)構(gòu)的報(bào)道[23]，Cai等[21]也提出，β-羧酶體中的CcmP蛋白具有雙層結(jié)構(gòu)，這加深了我們對(duì)羧酶體外殼結(jié)構(gòu)的認(rèn)識(shí)。

3.2 羧酶體內(nèi)部結(jié)構(gòu)

α-羧酶體外殼下方有一個(gè)結(jié)合CA CsoSCA的區(qū)域。1989年Zarzycki和Iancu發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞質(zhì)在正常環(huán)境下不含CA，CA的異常表達(dá)會(huì)破壞胞質(zhì)中的HCO3?池，而使CCM機(jī)制短路，所以CA是羧酶體功能模型中的重要因素。另有報(bào)道稱(chēng)RubisCO與外殼緊密相連[9,12]，但連接機(jī)制尚不確定。Menon等[26]提出：RubisCO通過(guò)大亞基與外殼連接，但也有人認(rèn)為是小亞基在發(fā)揮作用[27]。除RubisCO和CsoSCA外，α-羧酶體中還有大量外殼連接蛋白，如假定的結(jié)構(gòu)蛋白CsoS2等。在某些物種中，CsoS2蛋白以一種多肽存在；而在H. neapolitanus中[23]，CsoS2蛋白包含兩種多肽：CsoS2A和CsoS2B。有人猜想[10]，CsoS2蛋白可能是組織蛋白，因CsoS2蛋白和β-羧酶體CcmM蛋白 (如下) 一樣，擁有兩個(gè)功能未知的重復(fù)氨基酸序列，但沒(méi)有證據(jù)證明CsoS2蛋白以相似的機(jī)制組織α-羧酶體。

β-羧酶體也有一個(gè)富含CA CcaA的內(nèi)殼層[25,28-31]，CA負(fù)責(zé)將碳酸氫鹽脫水，轉(zhuǎn)變?yōu)镃O2。β-羧酶體基因簇編碼兩種蛋白：CcmM和CcmN，它們參與羧酶體內(nèi)部的催化或組裝。CcmM蛋白通過(guò)轉(zhuǎn)錄形成2種多肽：C端包含3?5個(gè)RubisCO蛋白小亞基的重復(fù)單位，轉(zhuǎn)錄形成短鏈 (35 kDa，M35)，連接RubisCO；N端是γ-CA的同源物，轉(zhuǎn)錄形成長(zhǎng)鏈 (58 kDa，M58)，連接羧酶體CA CcaA。CcmM與RubisCO的大亞基 (RbcL)、外殼蛋白及CcmN都可相互作用。另外，許多β-藍(lán)藻中的CcmM-58都有CA活性[32]。CcmN蛋白功能未知，但基因簇序列高度保守，其N(xiāo)端主要與羧酶體CcmM (即RubisCO和CA CcaA) 相互作用；C端與羧酶體外殼連接。有報(bào)道稱(chēng)：CcmN蛋白C端多肽對(duì)研究羧酶體的起源具有重要意義[33]。羧酶體蛋白組成如表1所示。

表1 α和β-羧酶體蛋白組成Table 1 Protein components of α- and β-carboxysome

4 CCM機(jī)制與羧酶體

CCM機(jī)制由兩步構(gòu)成[34]：第一步由跨膜的碳泵將胞外無(wú)機(jī)碳泵入胞內(nèi)，在胞質(zhì)中積累HCO3?；第二步通過(guò)羧酶體中的CA將HCO3?轉(zhuǎn)化為CO2。羧酶體中的CO2在RubisCO催化下生成3-PGA，3-PGA逸出羧酶體后參與其他代謝。因RubisCO不僅對(duì)CO2親和力低，而且對(duì)O2敏感度高，所以通過(guò)CCM增加RubisCO周?chē)腃O2濃度可有效提高固碳效率。其他現(xiàn)存的CCM機(jī)制包括真核生物體中的淀粉核[35]，及C4光合代謝機(jī)制和景天酸代謝機(jī)制[36]等。

除羧酶體外，在腸道沙門(mén)氏菌Salmonella enterica中還發(fā)現(xiàn)兩種類(lèi)羧酶體微體：包含1,2-丙二醇代謝途徑的Pdu微體[37]和包含乙醇胺代謝途徑的Eut微體[38]。PduU蛋白是報(bào)道的首個(gè)類(lèi)羧酶體外殼蛋白。EutG蛋白將乙醛轉(zhuǎn)化為乙醇，并能促進(jìn)羧酶體中NADH的再循環(huán)。大腸桿菌Escherichia coli中也含有Eut微體[39]。這些類(lèi)羧酶體器官能保存揮發(fā)性代謝物或活性中間產(chǎn)物，如CO2等。BMC蛋白存在于1/5的細(xì)菌中，可以想象自然界中尚有多少不為人知的微體。

5 羧酶體的功能拓展

為研究RubisCO在羧酶體中的作用，Menon等[26]構(gòu)建了一系列RubisCO突變株。研究發(fā)現(xiàn)，缺乏RubisCO的羧酶體能組裝成形狀和組分都正常的空殼。Rae等[20]通過(guò)敲出外殼蛋白CcmK2或CcmO發(fā)現(xiàn)，突變株產(chǎn)生不含外殼的結(jié)構(gòu)。因此，Menon等[26]認(rèn)為羧酶體的外殼特征并不取決于其所包含的酶，并首次指出羧酶體的內(nèi)含物是可以被操縱的。為探究羧酶體結(jié)構(gòu)的可塑性，辛鑫等[40]首先分析其他固碳酶的理化性質(zhì)，將鮑曼不動(dòng)桿菌Acinetobacter baumannii的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(Phosphoenolpyruvate carboxylase，PEPC) 轉(zhuǎn)化原核宿主。結(jié)果顯示，PEPC可以促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，且不會(huì)帶來(lái)生長(zhǎng)負(fù)擔(dān)。因此，在羧酶體內(nèi)引入PEPC，可望構(gòu)建全新羧酶體。

更令人振奮的是哈佛大學(xué)Silver課題組[41]近期發(fā)現(xiàn)，由10個(gè)基因編碼的細(xì)長(zhǎng)聚球藻Synechococcus elongates PCC 7942羧酶體能在大腸中異源表達(dá)。異源表達(dá)的羧酶體與原始宿主中的很相似，純化后發(fā)現(xiàn)其結(jié)構(gòu)良好，不僅包含預(yù)期的分子成分，而且可在體內(nèi)固定CO2?；诖?，Silver研究小組建立了一種基因系統(tǒng)，該系統(tǒng)能夠在不同宿主中產(chǎn)生固碳模塊。這不僅使我們更好地理解了羧酶體的復(fù)雜分子結(jié)構(gòu)，還為構(gòu)建人工羧酶體奠定了基礎(chǔ)。將人工羧酶體作為合成“細(xì)胞器”植入異養(yǎng)生物中，有望賦予其固定CO2的性能，從而將其轉(zhuǎn)變?yōu)樽责B(yǎng)生物。

隨著對(duì)羧酶體結(jié)構(gòu)和功能的闡明，很多學(xué)者認(rèn)為羧酶體在本質(zhì)上類(lèi)似于噬菌體，加之其結(jié)構(gòu)的可塑性，認(rèn)為它可作為載體用于表達(dá)外源基因。此外，增加胞內(nèi)羧酶體的拷貝數(shù)可望提高固定CO2能力。Price等[42]將藍(lán)藻CCM機(jī)制中HCO3?轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白：BicA和SbtA分別轉(zhuǎn)入C3植物中，兩種轉(zhuǎn)基因植物的光合作用均提高約28%。Synechocystis sp. PCC 6803是研究光合作用的模式生物，但生長(zhǎng)緩慢、發(fā)酵周期長(zhǎng)的缺點(diǎn)嚴(yán)重影響了在生物能源方面的應(yīng)用價(jià)值?？梢栽O(shè)想，在Synechocystis sp. PCC 6803中構(gòu)建羧酶體表達(dá)載體，增加其拷貝數(shù)，有望增強(qiáng)固定CO2能力，從而提高其生長(zhǎng)速度。

綜上所述，作為原核細(xì)胞的“細(xì)胞器”，羧酶體是當(dāng)今研究熱點(diǎn)，其發(fā)現(xiàn)不僅具有進(jìn)化生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)理論意義，而且在代謝工程(Metabolic engineering) 和合成生物學(xué) (Synthetic biology) 特別是光合分子育種領(lǐng)域具有非常廣闊的應(yīng)用前景。

REFERENCES

[1] Tcherkez GGB, Farquhar GD, Andrews TJ. Despite slow catalysis and confused substrate specificity, all ribulosebisphosphate carboxylases may be nearly perfectly optimized. Proc Natl Acad Sci USA, 2006, 103(19): 7246–7251.

[2] Drews G, Niklowitz W. Cytology of cyanophycea. II. Centroplasm and granular inclusions of Phormidium uncinatum. Arch Microbiol, 1956, 24(2): 147–162.

[3] Shively JM, Ball F, Brown DH, et al. Functional organelles in prokaryotes: polyhedral inclusions (carboxysomes) of Thiobacillus neapolitanus. Science, 1973, 182(4112): 584–586.

[4] Shively JM. Inclusion bodies of prokaryotes. Annu Rev Microbiol, 1974, 28, 167–188.

[5] Badger MR, Bek EJ. Multiple Rubisco forms in proteobacteria: their functional significance in relation to CO2acquisition by the CBB cycle. J Exp Bot, 2008, 59(7): 1525–1541.

[6] Tanaka S, Kerfeld CA, Sawaya MR, et al. Atomic-level models of the bacterial carboxysome shell. Science, 2008, 319(5866): 1083–1086.

[7] Rae BD, Long BM, Whitehead LF, et al. Cyanobacterial carboxysomes: microcompartments that facilitate CO2fixation. J Mol Microb Biotech, 2013, 23(4/5): 300–307.

[8] Rae BD, Forster B, Badger MR, et al. The CO2-concentrating mechanism of Synechococcus WH5701 is composed of native and horizontally-acquired components. Photosynth Res, 2011, 109(1/3): 59–72.

[9] Zarzycki J, Axen SD, Kinney JN, et al. Cyanobacterial-based approaches to improving photosynthesis in plants. J Exp Bot, 2013, 64(3): 787–798.

[10] Tripp HJ, Bench SR, Turk KA, et al. Metabolic streamlining in an open-ocean nitrogen-fixing cyanobacterium. Nature, 2010, 464(7285): 90–94.

[11] Schmid MF, Paredes AM, Khant HA, et al. Structure of Halothiobacillus neapolitanus carboxysomes by cryo-electron tomography. J Mol Biol, 2006, 364(3): 526–535.

[12] Iancu CV, Ding HJ, Morris DM, et al. The structure of isolated Synechococcus strain WH8102 carboxysomes as revealed by electron cryotomography. J Mol Biol, 2007, 372(3): 764–773.

[13] Iancu CV, Morris DM, Dou Z, et al. Organization, structure, and assembly of α-carboxysomes determined by electron cryotomography of intact cells. J Mol Biol, 2010, 396(1): 105–117.

[14] Cannon GC, Heinhorst S, Kerfeld CA. Carboxysomal carbonic anhydrases: Structure and role in microbial CO2fixation. BBA-Proteins Proteom, 2010, 1804(2): 382–392.

[15] Pena KL, Castel SE, Araujo C de, et al. Structural basis of the oxidative activation of the carboxysomal γ-carbonic anhydrase, CcmM. Proc Natl Acad Sci USA, 2010, 107(6): 2455–2460.

[16] Kerfeld CA, Sawaya MR, Tanaka S, et al. Protein structures forming the shell of primitive bacterial organelles. Science, 2005, 309(5736): 936–938.

[17] Tsai Y, Sawaya MR, Cannon GC, et al. Structural analysis of CsoS1A and the protein shell of the Halothiobacillus neapolitanus carboxysome. PLoS Biol, 2007, 5(6): e144.

[18] Cai F, Menon BB, Cannon GC, et al. The pentameric vertex proteins are necessary for the icosahedral carboxysome shell to function as a CO2leakage barrier. PLoS ONE, 2009, 4(10): e7521.

[19] Kinney JN, Axen SD, Kerfeld CA. Comparative analysis of carboxysome shell proteins. Photosynth Res, 2011, 109(1/3): 21–32.

[20] Rae BD, Long BM, Badger MR, et al. Structural determinants of the outer shell of β-carboxysomes in Synechococcus elongates PCC 7942: roles for CcmK2, K3-K4, CcmO, and CcmL. PLoS ONE, 2012, 7(8): e43871.

[21] Cai F, Sutter M, Cameron JC, et al. The structure of CcmP, a tandem bacterial microcompartment domain protein from the β-carboxysome, forms a subcompartment within a microcompartment. J Biol Chem, 2013, 288(22): 16055–16063.

[22] Tsai Y, Sawaya MR, Yeates TO. Analysis of lattice-translocation disorder in the layered hexagonal structure of carboxysome shell protein CsoS1C. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr,2009, 65(9): 980–988.

[23] Roberts EW, Cai F, Kerfeld CA, et al. Isolation and characterization of the Prochlorococcus carboxysome reveal the presence of the novel shell protein CsoS1D. J Bacteriol, 2012, 194(4): 787–795.

[24] Samborska B, Kimber MS. A dodecameric CcmK2 structure suggests β-carboxysomal shell facets have a double-layered organization. Structure, 2012, 20(8): 1353–1362.

[25] Long BM, Rae BD, Badger MR, et al. Over-expression of the β-carboxysomal CcmM protein in Synechococcus PCC 7942 reveals a tight co-regulation of carboxysomal carbonic anhydrase (CcaA) and M58 content. Photosynth Res, 2011, 109(1/3): 33–45.

[26] Menon BB, Dou Z, Heinhorst S, et al. Halothiobacillus neapolitanus carboxysomes sequester heterologous and chimeric RubisCO species. PLoS ONE, 2008, 3(10): e3570.

[27] Holthuijzen YA, van Breemen JFL, Kuenen JG, et al. Protein composition of the carboxysomes of Thiobacillus neapolitanus. Arch Microbiol, 1986, 144(4): 398–404.

[28] Ludwig M, Sultemeyer D, Price GD. Isolation of ccmKLMN genes from the marine cyanobacterium, Synechococcus sp. PCC 7002 (Cyanophyceae), and evidence that CcmM is essential for carboxysome assembly. J Phycol, 2000, 36(6): 1109–1119.

[29] Cot SSW, So AKC, Espie GS. A multiprotein bicarbonate dehydration complex essential to carboxysome function in cyanobacteria. J Bacteriol, 2008, 190(3): 936–945.

[30] Long BM, Badger MR, Whitney SM, et al. Analysis of carboxysomes from Synechococcus PCC 7942 reveals multiple Rubisco complexes with carboxysomal proteins CcmM and CcaA. J Biol Chem, 2007, 282(40): 29323–29335.

[31] Long BM, Tucker L, Badger MR, et al. Functional cyanobacterial β-carboxysomes have an absolute requirement for both long and short forms of the CcmM protein. Plant Physiol, 2010, 153(1): 285–293.

[32] Espie GS, Kimber MS. Carboxysomes: cyanobacterial RubisCO comes in small packages. Photosynth Res, 2011, 109(1/3): 7–20.

[33] Kinney JN, Salmeen A, Cai F, et al. Elucidating essential role of conserved carboxysomal protein CcmN reveals common feature of bacterial microcompartment assembly. J Biol Chem, 2012, 287(21): 17729–17736.

[34] Yeates TO, Kerfeld CA, Heinhorst S, et al. Protein-based organelles in bacteria: carboxysomes and related microcompartments. Nat Rev Microbiol, 2008, 6(9): 681–691.

[35] Meyer M, Griffiths H. Origins and diversity of eukaryotic CO2-concentrating mechanisms: lessons for the future. J Exp Bot, 2013, 64(3): 769–786.

[36] Sage RF. The evolution of C4 photosynthesis. New Phytol, 2004, 161(2): 341–370.

[37] Crowley CS, Sawaya MR, Bobik TA, et al. Structure of the PduU shell protein from the Pdu microcompartment of Salmonella. Structure, 2008, 16(9): 1324–1332.

[38] Penrod JT, Roth JR. Conserving a volatile metabolite: a role for carboxysome-like organelles in Salmonella enterica. J Bacteriol, 2006, 188(8): 2865–2874.

[39] Tanaka S, Sawaya MR, Yeates TO. Structure and mechanisms of a protein-based organelle in Escherichia coli. Science, 2010, 327(5961): 81–84.

[40] Xin X, Wang ZX, Ge XZ, et al. Cloning and prokaryotic expressin of phosphoenolpyruvate carboxylase. J Beijing Univ Chem Technol: Nat Sci Ed., 2012, 39(5): 98–101 (in Chinese).

辛鑫, 王朝絢, 葛喜珍, 等. 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的克隆與原核表達(dá). 北京化工大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版，2012, 39(5): 98–101.

[41] Bonacci W, Teng PK, Afonso B, et al. Modularity of a carbon-fixing protein organelle. Proc Natl Acad Sci USA, 2012, 109(2): 478–483.

[42] Price GD, Pengelly JJL, Forster B, et al. The cyanobacterial CCM as a source of genes for improving photosynthetic CO2fixation in crop species. J Exp Bot, 2013, 64(3): 753–768.

(本文責(zé)編 陳宏宇)

Progress in structure and CO2-concentrating mechanism of carboxysomes

Baoyan Zhang, and Pingfang Tian

Beijing Key Laboratory of Bioprocess, College of Life Science and Technology, Beijing University of Chemical Technology, Beijing 100029, China

Carboxysomes are extremely efficient microcompartments committed to CO2fixation due to tailored CO2-concentrating mechanism (CCM). In cyanobacteria and some chemoautotrophs, carboxysomes as organelle-like microbodies encapsulate ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase (RuBisCO) and carbonic anhydrase (CA). Together with active inorganic carbon uptake transporters, carboxysomes accumulate HCO3(-) in the cytoplasm, leading to high efficiency of carbon fixation. Based on the elucidation of structures and functionalities, heterologous production ofcarboxysomes has been achieved so far. In fact, the genes encoding either vacant carboxysome shell or only interior components have been characterized. This review summarizes the discovery along with types, showcases molecular structures and roles of carboxysomes in CCM, and presents their broad applications in metabolic engineering.

cyanobacteria, microcompartments, carbonic anhydrase, RubisCO, CO2-concentrating mechanism

November 12, 2013; Accepted: December 10, 2013

Pingfang Tian. Tel: +86-10-89136369; E-mail: tianpf@mail.buct.edu.cn

張寶燕, 田平芳. 羧酶體結(jié)構(gòu)及其CO2濃縮機(jī)制研究進(jìn)展. 生物工程學(xué)報(bào), 2014, 30(8): 1164?1171.

Zhang BY, Tian PF. Progress in structure and CO2-concentrating mechanism of carboxysomes. Chin J Biotech, 2014, 30(8):1164?1171.

Supported by: National Natural Science Foundation of China (Nos. 21076013, 21276014), National Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2012CB725200).

國(guó)家自然科學(xué)基金 (Nos. 21076013, 21276014)，國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃 (973計(jì)劃) (No. 2012CB725200) 資助。