柯薩奇病毒A組16型VP1蛋白的原核表達(dá)

王志宏+丁瑩瑩+馮嬌嬌+李連青+潘衛(wèi)+郭存九

[摘要] 目的 構(gòu)建重組質(zhì)?？滤_奇病毒A組16型（coxsackievirus group A type 16，CA16）VP1，并進(jìn)行原核表達(dá)及鑒定。方法 用PCR方法擴(kuò)增CA16 VP1序列，構(gòu)建其重組表達(dá)質(zhì)粒pET21b-CA16 VP1，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌E. coli BL21（DE3）進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)及純化，SDS-PAGE鑒定表達(dá)及純化產(chǎn)物，間接ELISA方法檢測(cè)重組蛋白CA16 VP1的抗原性和有效性。結(jié)果 成功原核表達(dá)并純化了CA16 VP1蛋白，可與小鼠抗CA16病毒血清特異性結(jié)合，與太原市老年人群中部分血清存在高反應(yīng)性。 結(jié)論 CA16 VP1蛋白獲得成功表達(dá)，ELISA檢測(cè)具有良好的抗原性和有效性，為CA16診斷試劑盒的研究奠定基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞] 柯薩奇病毒A組16型；VP1蛋白；原核表達(dá)；酶聯(lián)免疫吸附

[中圖分類(lèi)號(hào)] R373.2；R392-33 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 1673-9701（2014）14-0069-04

手足口?。℉and foot and mouth disease，HFMD）是一種全球性的傳染病，自1957年新西蘭首次報(bào)道以來(lái)[1]，世界各地均有不同程度的流行[2-5]。近年來(lái)，手足口病疫情呈不斷上升的趨勢(shì)，尤其在亞太地區(qū)。2008年，我國(guó)將其列為法定丙類(lèi)傳染病進(jìn)行監(jiān)測(cè)，目前 HFMD的發(fā)病率和死亡率在丙類(lèi)傳染病中仍居首位。引起HFMD的腸道病毒有20多種，其中柯薩奇病毒A組16型（coxsackievirus group A type 16，CA16）和EV71最為常見(jiàn)[6]，其他腸道病毒像CA4、CA5、CA9、CA10、CB2和CB5也可以引起[7]。CA16 基因組全長(zhǎng)7410 bp，其中VP1基因長(zhǎng)891 bp，編碼297個(gè)氨基酸殘基[8]，CA16 VP1含有許多線(xiàn)性中和表位，VP1基因與腸道病毒血清型完全對(duì)應(yīng)，可作為腸道病毒屬內(nèi)不同血清分類(lèi)依據(jù)，也可作為小RNA病毒科分類(lèi)依據(jù)[9]。因此，CA16 VP1基因已成為研究CA16的重要對(duì)象。本實(shí)驗(yàn)旨在構(gòu)建pET21b-CA16 VP1重組表達(dá)質(zhì)粒，在大腸桿菌中原核表達(dá)并純化CA16 VP1重組蛋白，并檢測(cè)其抗原性和有效性，為CA16診斷試劑盒的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌株、細(xì)胞、病毒及試劑

原核表達(dá)載體pET21b購(gòu)自Novagen公司，大腸桿菌（E. coli）BL21（DE3）和Top10菌株購(gòu)自TAKARA公司。CA16病毒和RD細(xì)胞由上海市疾病預(yù)防控制中心提供。限制性核酸內(nèi)切酶BamH I、HindIII和DNA Marker（DL2000）購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；Taq DNA 聚合酶試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司；T4 DNA連接酶（Ligation High kit）購(gòu)自東洋紡（中國(guó)上海）生物科技有限公司；PCR小量膠回收試劑盒購(gòu)自北京天恩澤科技有限公司。金屬螯合親和層析介質(zhì)（Ni-NTA）購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司。重組質(zhì)粒pET32a-CA16 VP1、純化的pET32a蛋白和LD5由第二軍醫(yī)大學(xué)病原生物學(xué)教研室制備并保存，其中LD5為一種新型免疫球蛋白結(jié)合分子（NEIBM），可與Ig的VH3和Vk區(qū)域雙結(jié)合，與IgG有較高的親和力[10-12]。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及血清標(biāo)本

清潔級(jí)BALB/C小鼠，雌性，6周齡，16～18 g，由第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；2013年5月29日～5月30日山西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科95份太原市老年人血清，其中男48例，女47例，平均年齡（61.0±14.0）歲。

1.3 引物的設(shè)計(jì)及合成

根據(jù)CA16 VP1基因（NCBI 登錄號(hào)：AEO12126.1）序列自行設(shè)計(jì)引物，上游P1：5′-GGCCCGGGGATCCGGGTGACCCGATCGCTGAC-3′（下劃線(xiàn)部分為BamH I酶切位點(diǎn)），下游P2：5′-CGCCCGCGGAAGCTTCAGAGTAGTGATTTTGTC-3′（下劃線(xiàn)部分為Hind III酶切位點(diǎn)），擴(kuò)增片段大小為891 bp。引物由上海生工生物有限公司合成。

1.4 CA16 VP1基因的擴(kuò)增

以pET32a-CA16 VP1質(zhì)粒為模板，P1、P2為上下游引物，PCR擴(kuò)增CA16 VP1基因， PCR擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5 min；4℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 40 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃ 延伸10 min。1.2%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

將試劑盒回收的PCR產(chǎn)物和表達(dá)載體pET21b用BamH I和Hind III雙酶切，回收目的基因片段和載體片段，以T4 DNA連接酶16℃連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)E.coliTOP10中，過(guò)夜培養(yǎng)后挑取單克隆菌落，37℃搖菌16 h后提取質(zhì)粒，用BamH I和Hind III雙酶切鑒定。鑒定正確的質(zhì)粒送上海杰李生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.6 重組蛋白的表達(dá)

將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli BL21（DE3）中，挑取單克隆菌落，接種于2 mL LB（100 μg/mL Amp+15μg/ mL Kana）培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)7 h，按1%接種量接種到50 mL LB培養(yǎng)基中，37℃、230 rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；將50 mL過(guò)夜菌液轉(zhuǎn)接至新鮮的450 mL LB中，37℃、230 rpm振蕩培養(yǎng)至A600為0.6，加IPTG 至終濃度為1 mmol/L，誘導(dǎo)4 h，離心收集細(xì)菌沉淀，在冰浴的條件下超聲300次，每次超聲3 s，間隔3 s；離心收集上清和沉淀，進(jìn)行12% SDS-PAGE分析。

1.7 重組蛋白的純化endprint

取重組菌破菌沉淀，加8 mol/L（pH8.0）尿素10 mL重懸，4℃裂解過(guò)夜；離心收集上清用于純化，純化按Qiagen公司Ni-NTA說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。12% SDS-PAGE分析，BandScan軟件分析重組蛋白的純度。

1.8 小鼠抗CA16病毒血清的制備

將RD細(xì)胞接種到培養(yǎng)瓶中，當(dāng)RD細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)80%時(shí)，加入CA16病毒懸液，37℃，5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～5 d，收集細(xì)胞并反復(fù)凍融三次，離心收集病毒懸液并腹腔注射5只BALB/c小鼠，病毒劑量按200 μL/只，共注射3次，每次間隔2周。第3次注射后1周采血，分離血清。

1.9 間接ELISA法檢測(cè)重組蛋白的抗原性及有效性

將重組蛋白pET21b-CA16 VP1和pET32a用100 mmol/L碳酸鹽緩沖液（pH9.6）以1：200稀釋?zhuān)謩e包被于酶標(biāo)板100 μL/孔，37℃孵育2 h，棄上清；10%的脫脂奶粉37℃封閉2h；每孔加入2倍系列稀釋?zhuān)?：20～1：5120）的小鼠抗CA16 病毒血清和太原市老年人血清100 μL，37℃孵育45 min，PBST洗液洗4次；加入1∶2000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的LD5 100 μL，37℃孵育45 min；PBST洗液洗4次，TMB顯色液顯色，于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值（A450）。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)符合偏態(tài)分布，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本的秩和檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，采用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行作圖分析。

2 結(jié)果

2.1 CA16 VP1 基因的擴(kuò)增

以pET32a-CA16 VP1質(zhì)粒為模板，P1、P2為上下游引物，PCR擴(kuò)增CA16 VP1基因，CA16 VP1基因經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見(jiàn)891bp的特異性條帶，大小與理論值相符，見(jiàn)圖1。

2.2 pET21b-CA16 VP1質(zhì)粒的鑒定

重組質(zhì)粒pET21b-CA16 VP1經(jīng)BamH I和Hind III雙酶切，經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，可見(jiàn)約5400 bp的載體片段和891 bp的目的基因片段，與理論值相符，見(jiàn)圖2。

M：DL2000 Marker ；1：未酶切pET21b-CA16 VP1；

2：pET21b-CA16 VP1雙酶切后產(chǎn)物

2.3 CA16 VP1蛋白的表達(dá)

將pET21b-CA16 VP1質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coli BL21（DE3）中誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)12% SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果可見(jiàn)相對(duì)分子質(zhì)量約34KDa的條帶，大小與理論值相符，重組蛋白pET21b-CA16 VP1主要存在于破菌沉淀中，以包涵體形式表達(dá)。經(jīng)BandScan軟件分析，目的蛋白表達(dá)量約占菌體總蛋白的24%，見(jiàn)圖3。

2.4 CA16 VP1蛋白的純化

重組蛋白CA16 VP1經(jīng)Ni-NTA親和層析純化后，12% SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果可見(jiàn)相對(duì)分子質(zhì)量約34KDa的單一蛋白條帶，經(jīng)BandScan軟件分析，重組蛋白的純度達(dá)90%以上。見(jiàn)圖4。

2.5 CA16 VP1的抗原性分析

5只BALB/c小鼠經(jīng)CA16病毒4次免疫后，用間接ELISA方法檢測(cè)純化的重組蛋白CA16 VP1與倍比稀釋的小鼠抗CA16病毒血清的反應(yīng)性，結(jié)果顯示，小鼠抗CA16病毒血清可與純化的重組蛋白特異性結(jié)合，A450值隨小鼠抗CA16病毒血清濃度的稀釋逐漸降低，以1∶20～1∶60稀釋度下降尤為明顯，與pET32a蛋白僅有較弱的結(jié)合，見(jiàn)圖5。

2.6 CA16 VP1的有效性分析

95份太原市老年人血清與重組蛋白CA16 VP1的間接ELISA檢測(cè)，結(jié)果顯示：重組蛋白 CA16 VP1與太原市老年人血清反應(yīng)的A450（中位數(shù)0.912，四分位數(shù)間距0.638）明顯高于對(duì)照組pET32a蛋白與人血清反應(yīng)的A450（中位數(shù)0.486，四分位數(shù)間距0.172），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見(jiàn)圖6。將重組蛋白 CA16 VP1與太原老年人血清反應(yīng)的A450值從高到低依次排列顯示，A450值呈線(xiàn)性分布，出現(xiàn)高、中、低三種A450值，而且有7例血清的A450值明顯高于其他人血清的A450值，見(jiàn)圖7。

3 討論

以往研究認(rèn)為CA16僅引起輕微癥狀[13]，EV71能引起嚴(yán)重的并發(fā)癥及死亡率[14，15]，因此大多數(shù)手足口病的研究主要針對(duì)EV71，CA16常被忽視。然而近幾年研究發(fā)現(xiàn)，感染CA16的患者也能引起嚴(yán)重并發(fā)癥[16]，甚至死亡[17]，CA16日益受到人們的重視。

本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET21b-CA16 VP1，并在大腸桿菌BL21（DE3）中表達(dá)了CA16 VP1蛋白，SDS-PAGE分析顯示，表達(dá)的重組蛋白CA16 VP1主要以包涵體形式存在，之所以出現(xiàn)包涵體是因?yàn)檫@些蛋白在體內(nèi)過(guò)量表達(dá)，以至于沒(méi)有足夠的時(shí)間正確折疊，二硫鍵不能正確地配對(duì)，過(guò)多的蛋白間非特異性結(jié)合，蛋白質(zhì)無(wú)法達(dá)到足夠的溶解度[18]，重組蛋白經(jīng)Ni柱親和層析純化后純度達(dá)90%以上，由于載體蛋白pET21b分子量很小，僅含有27個(gè)氨基酸，因此，選擇pET32a載體蛋白作為陰性對(duì)照。

為確定重組蛋白CA16 VP1是否具有抗原性，我們用小鼠抗CA16病毒血清來(lái)檢測(cè)重組蛋白CA16 VP1，結(jié)果表明，重組蛋白CA16 VP1與小鼠抗CA16病毒血清的反應(yīng)明顯高于與pET32a蛋白的反應(yīng)，表明CA16 VP1蛋白具有良好的抗原性和特異性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，在每個(gè)血清稀釋下，5只小鼠抗CA16病毒血清與重組蛋白CA16 VP1反應(yīng)的A450值有高有低，而與pET32a蛋白反應(yīng)的A450值均小于0.5且它們之間的差異很小，表明不同小鼠對(duì)相同CA16病毒產(chǎn)生的抗體不同，小鼠之間存在個(gè)體差異；小鼠抗CA16病毒血清與pET32a蛋白無(wú)結(jié)合反應(yīng)。endprint

為進(jìn)一步了解重組蛋白CA16 VP1能否有效檢測(cè)人群中抗CA16 VP1抗體，我們用表達(dá)的重組蛋白CA16 VP1檢測(cè)太原市老年人血清，結(jié)果表明，重組蛋白CA16 VP1作為抗原能有效檢測(cè)人群中抗CA16 VP1抗體，有7例血清與重組蛋白存在高的結(jié)合反應(yīng)，表明表達(dá)的重組蛋白能夠成為一種臨床檢測(cè)用抗原。由于本次實(shí)驗(yàn)沒(méi)有對(duì)這7例血清進(jìn)行中和實(shí)驗(yàn)來(lái)確定他們是否感染過(guò)CA16病毒，有待我們?cè)诤罄m(xù)的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET21b-CA16 VP1，原核表達(dá)并純化了CA16 VP1重組蛋白，能與小鼠抗CA16病毒血清發(fā)生特異性反應(yīng)，能檢測(cè)出人血清中抗CA16抗體，說(shuō)明其具有良好的抗原性和有效性，本實(shí)驗(yàn)為CA16診斷試劑盒的研究奠定基礎(chǔ)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Sarma N. Hand， foot， and mouth disease： Current scenario and Indian perspective[J]. Indian J Dermatol Venereol Leprol，2013，79（2）：165-175.

[2] Wu Y，Yeo A，Phoon MC， et al. The largest outbreak of hand，foot and mouth disease in Singapore in 2008： The role of enterovirus 71 and coxsackievirus A strains[J]. Int J Infect Dis，2010，14（12）：e1076-1081.

[3] Bendig JW， Fleming DM. Epidemiological， virological， and clinical features of an epidemic of hand， foot， and mouth disease in England and Wales[J]. Commun Dis Rep CDR Rev，1996，6（6）：R81-86.

[4] Kobayashi M， Makino T， Hanaoka N， et al. Clinical manifestations of coxsackievirus A6 infection associated with a major outbreak of hand， foot， and mouth disease in Japan[J]. Jpn J Infect Dis，2013，66（3）：260-261.

[5] Puenpa J， Theamboonlers A， Korkong S， et al. Molecular characterization and complete genome analysis of human enterovirus 71 and coxsackievirus A16 from children with hand， foot and mouth disease in Thailand during 2008-2011[J]. Arch Virol，2011，156（11）：2007-2013.

[6] Zhu Z， Zhu S， Guo X， et al. Retrospective seroepidemiology indicated that human enterovirus 71 and coxsackievirus A16 circulated wildly in central and southern China before large-scale outbreaks from 2008[J]. Virol J，2010， 7：300.

[7] Ang LW， Koh BK， Chan KP，et al. Epidemiology and control of hand， foot and mouth disease in Singapore， 2001-2007[J]. Ann Acad Med Singapore，2009，38（2）：106-112.

[8] 金奇. 醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)[M]. 北京：科學(xué)出版社，2001：579-602.

[9] Oberste MS，Maher，Kilpatrick DR， et al. Molecular evolution of the human enteroviruses： Correlation of serotype with VP1 sequence and application to picornavirus classification[J]. J Virol，1999，73（3）：1941-1948.

[10] Cao J，Chen Q，Zhang H，et al. Novel evolved immunoglobulin （Ig）-binding molecules enhance the detection of IgM against hepatitis C virus[J]. PLoS One，2011， 6（4）：e18477.

[11] Jiang SH，Wang JF，Xu R， et al. Alternate arrangement of PpL B3 domain and SpA D domain creates synergistic double-site binding to VH3 and Vkappa regions of fab[J].DNA Cell Biol，2008，27（8）：423-431.endprint

[12] Qiuli Chen， Lan Li， Wenting Liao， et al. Characterization of tat antibody responses in Chinese individuals infected with HIV-1[J]. PLoS One，2013，8（4）：e60825.

[13] Chang LY， Lin TY， Huang YC， et al. Comparison of enterovirus 71 and coxsackie-virus A16 clinical illnesses during the Taiwan enterovirus epidemic， 1998[J]. Pediatr Infect Dis J， 1999 ，18（12）：1092-1096.

[14] McMinn PC. An overview of the evolution of enterovirus 71 and its clinical and public health significance[J].FEMS Microbiol Rev， 2002，26（1）：91-107.

[15] Lee TC，Guo HR，Yang YC， et al. Diseases caused by enterovirus 71 infection[J]. Pediatr Infect Dis J， 2009 ，28（10）：904-910.

[16] Xu W，Liu CF，Yan L，et al. Distribution of enteroviruses in hospitalized childrenwith hand， foot and mouth disease and relationship between pathogens and nervous system complications[J]. Virol J，2012，9：8.

[17] Wang CY，Li Lu F，Wu MH， et al. Fatal coxsackievirus A16 infection[J]. Pediatr Infect Dis J，2004，23（3）：275-276.

[18] 井明艷，孫建義. 蛋白質(zhì)的折疊調(diào)控與包涵體的形成[J].浙江大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，30（6）：690-697.

（收稿日期：2014-03-13）endprint

[12] Qiuli Chen， Lan Li， Wenting Liao， et al. Characterization of tat antibody responses in Chinese individuals infected with HIV-1[J]. PLoS One，2013，8（4）：e60825.

[13] Chang LY， Lin TY， Huang YC， et al. Comparison of enterovirus 71 and coxsackie-virus A16 clinical illnesses during the Taiwan enterovirus epidemic， 1998[J]. Pediatr Infect Dis J， 1999 ，18（12）：1092-1096.

[14] McMinn PC. An overview of the evolution of enterovirus 71 and its clinical and public health significance[J].FEMS Microbiol Rev， 2002，26（1）：91-107.

[15] Lee TC，Guo HR，Yang YC， et al. Diseases caused by enterovirus 71 infection[J]. Pediatr Infect Dis J， 2009 ，28（10）：904-910.

[16] Xu W，Liu CF，Yan L，et al. Distribution of enteroviruses in hospitalized childrenwith hand， foot and mouth disease and relationship between pathogens and nervous system complications[J]. Virol J，2012，9：8.

[17] Wang CY，Li Lu F，Wu MH， et al. Fatal coxsackievirus A16 infection[J]. Pediatr Infect Dis J，2004，23（3）：275-276.

[18] 井明艷，孫建義. 蛋白質(zhì)的折疊調(diào)控與包涵體的形成[J].浙江大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，30（6）：690-697.

（收稿日期：2014-03-13）endprint

[12] Qiuli Chen， Lan Li， Wenting Liao， et al. Characterization of tat antibody responses in Chinese individuals infected with HIV-1[J]. PLoS One，2013，8（4）：e60825.

[13] Chang LY， Lin TY， Huang YC， et al. Comparison of enterovirus 71 and coxsackie-virus A16 clinical illnesses during the Taiwan enterovirus epidemic， 1998[J]. Pediatr Infect Dis J， 1999 ，18（12）：1092-1096.

[14] McMinn PC. An overview of the evolution of enterovirus 71 and its clinical and public health significance[J].FEMS Microbiol Rev， 2002，26（1）：91-107.

[15] Lee TC，Guo HR，Yang YC， et al. Diseases caused by enterovirus 71 infection[J]. Pediatr Infect Dis J， 2009 ，28（10）：904-910.

[16] Xu W，Liu CF，Yan L，et al. Distribution of enteroviruses in hospitalized childrenwith hand， foot and mouth disease and relationship between pathogens and nervous system complications[J]. Virol J，2012，9：8.

[17] Wang CY，Li Lu F，Wu MH， et al. Fatal coxsackievirus A16 infection[J]. Pediatr Infect Dis J，2004，23（3）：275-276.

[18] 井明艷，孫建義. 蛋白質(zhì)的折疊調(diào)控與包涵體的形成[J].浙江大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，30（6）：690-697.

（收稿日期：2014-03-13）endprint