嗎啡促乳腺癌細胞轉(zhuǎn)移的YAP相關(guān)信號機制研究

楊遠東，張靈敏，袁 慧，袁 偉

(西安交通大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院麻醉科，陜西西安 710061)

嗎啡促乳腺癌細胞轉(zhuǎn)移的YAP相關(guān)信號機制研究

楊遠東，張靈敏，袁 慧，袁 偉

(西安交通大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院麻醉科，陜西西安 710061)

目的探討YAP相關(guān)的分子信號通路在嗎啡促乳腺癌細胞轉(zhuǎn)移中的作用及機制。方法應(yīng)用RNA干擾技術(shù)降低人乳腺癌BT474細胞中YAP蛋白的表達，體外Transwell細胞轉(zhuǎn)移實驗驗證YAP蛋白被抑制后，嗎啡對乳腺癌細胞轉(zhuǎn)移的刺激作用。采用Western blot技術(shù)檢測嗎啡處理后，乳腺癌細胞中YAP蛋白及磷酸化YAP蛋白的表達；細胞免疫熒光分析嗎啡對YAP蛋白細胞內(nèi)定位的影響。結(jié)果siRNA能有效抑制乳腺癌BT474細胞中YAP蛋白的表達，嗎啡干預(yù)后的乳腺癌BT474細胞轉(zhuǎn)移數(shù)顯著高于對照組(79.4±5.48 vs.32.2±6.42，P=0.000 5)，而當YAP蛋白被抑制后，嗎啡未能增加BT474細胞的轉(zhuǎn)移(29.2±4.08 vs.21.2±2.58，P=0.135 9)；Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，在BT474細胞的培養(yǎng)基中加入嗎啡干預(yù)后后，磷酸化的YAP含量隨著時間的增加而顯著降低，但總YAP蛋白的表達無顯著變化，同時，細胞免疫熒光證實嗎啡能促進BT474細胞中YAP蛋白在細胞核內(nèi)聚集。結(jié)論嗎啡能通過激活細胞中的YAP蛋白從而促進乳腺癌的轉(zhuǎn)移。

嗎啡；乳腺癌；轉(zhuǎn)移；YAP蛋白

阿片受體激動劑具有強大的鎮(zhèn)痛作用，廣泛使用于麻醉的誘導給藥及疼痛治療。其中，最具代表性的藥物即為嗎啡，其能通過與神經(jīng)系統(tǒng)中阿片受體(μ、δ和κ)結(jié)合發(fā)揮鎮(zhèn)靜及鎮(zhèn)痛作用。盡管嗎啡具有一系列的副作用，如成癮、呼吸抑制、免疫抑制等，但臨床上仍把它作為嚴重疼痛的首選用藥，特別是對于癌性疼痛［1］。然而，大量的證據(jù)表明，嗎啡在抑制惡性疼痛的同時，也能促進腫瘤細胞的增殖、轉(zhuǎn)移及侵襲［2-3］。在乳腺癌中，嗎啡一方面能激活血管上皮生長因子受體(VEGFR)增加腫瘤的血管生成［4］，另一方面又能促使乳腺癌細胞中的基質(zhì)降解酶及纖溶酶原激活［5-6］，并最終導致乳腺癌的遠處轉(zhuǎn)移。YAP，全稱為Yes相關(guān)蛋白(Yes-associated protein)，是一種共轉(zhuǎn)錄激活因子，具有調(diào)控其下游多種基因表達的作用。有研究顯示，YAP表達或活性的升高可導致腫瘤細胞內(nèi)VEGFR的激活增加，并促進腫瘤細胞轉(zhuǎn)移及侵襲［7］。因此，我們設(shè)想嗎啡能通過YAP信號分子促進乳腺癌細胞的轉(zhuǎn)移。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑YAP、phospho-YAP(Ser127)抗體購于Cell Signaling公司；GAPDH抗體及YAP-siRNA購于Santa Cruz Biotechnology公司；熒光標記Alexafluor二抗購于Life Technologies；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購于Invitrogen；100 mL/L胎牛血清及RPMI 1640培養(yǎng)基均購于GIBCO公司。

1.2 培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染本實驗中使用的BT474乳腺癌細胞系購于Cell Lines Service Inc.，并使用含100 m L/L胎牛血清及100μg/m L青霉素/鏈霉素(P/S)的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。所有細胞均放置于含50 m L/L CO2的37℃的恒溫培養(yǎng)箱中。利用siRNA轉(zhuǎn)染時，于6孔板中每孔接種105個細胞，加入2 m L培養(yǎng)基，當細胞密度達到80%～90%時使用Lipofectamine 2000作為轉(zhuǎn)染試劑，并在轉(zhuǎn)染48 h后檢測轉(zhuǎn)染效率。

1.3 Western blot檢測收集細胞，RIPA緩沖液裂解細胞提取總蛋白并進行定量，配制SDS-PAGE分離膠及濃縮膠，計算50 ng蛋白溶液上樣體積，常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)膜后孵育一抗及熒光標記的二抗，使用Odyssey紅外成像系統(tǒng)(Infrared Imaging System，Li-Cor Biosciences)檢測膜上的熒光強度并進行分析。

1.4 細胞免疫熒光染色BT474細胞接種在帶培養(yǎng)小室的載玻片上，按實驗?zāi)康倪M行藥物干預(yù)后，除去培養(yǎng)基，PBS漂洗3遍后40 g/L多聚甲醛室溫固定15 min，封閉液(PBS、30 m L/L的羊血清、3 m L/L Triton X-100)封閉1 h后，加入YAP一抗(1∶100稀釋，PBS、15 m L/L的羊血清、3 m L/L Triton X-100)4℃過夜。PBS再次漂洗后加入Alexa Fluor 488-標記的二抗(Invitrogen，1∶500稀釋)，室溫孵育2 h后PBS漂洗3遍，DAPI染色后封片，熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.5 體外細胞轉(zhuǎn)移實驗在8μm孔徑的Transwell小室(購于Corning公司)聚碳酸酯膜的下側(cè)包裹10μL質(zhì)量濃度為0.1 mg/m L的collagen I蛋白，室溫干燥30 min；收集細胞，無血清培養(yǎng)基漂洗2次；下層24孔培養(yǎng)板中每孔加入0.3 m L含有或不含有干預(yù)藥物(嗎啡10μmol/L)的培養(yǎng)基；上層Transwell小室中加入0.3 m L含5×104個細胞的培養(yǎng)基；50 m L/L CO2、37℃恒溫培養(yǎng)16 h；用濕棉簽輕輕擦掉小室膜上側(cè)未遷移的細胞，甲醇固定20 min，1 m L/L結(jié)晶紫染色20 min，用清水洗3遍以上，高倍顯微鏡下隨機5個視野觀察細胞并計數(shù)。

1.6 統(tǒng)計學方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料使用均數(shù)±標準差()表示，兩兩比較采用Student t檢驗，多組間比較采用ANOVA方差檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 YAP-siRNA干擾對BT474細胞中YAP表達的影響為了降低乳腺癌BT474細胞中YAP蛋白的表達，我們利用YAP-siRNA轉(zhuǎn)染細胞，48 h后Western blot檢測空白對照組和干擾組細胞內(nèi)YAP蛋白的表達。結(jié)果顯示，干擾組細胞中YAP的含量明顯低于對照組(P＜0.000 1)，表明了YAP-siRNA的有效性和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染系統(tǒng)的可靠性(圖1)。

圖1 siRNA抑制乳腺癌BT474細胞中YAP蛋白的表達Fig.1 siRNA down-regulated expression of YAP in BT474 cells

2.2 嗎啡促進BT474細胞轉(zhuǎn)移依賴于YAP蛋白表達為了檢驗YAP蛋白對嗎啡促進乳腺癌細胞轉(zhuǎn)移的影響，我們把細胞分為2組，一組為正常的BT474細胞，另一組為siRNA轉(zhuǎn)染后YAP蛋白低表達的乳腺癌細胞，利用體外Transwell細胞轉(zhuǎn)移實驗分別比較嗎啡刺激16 h后細胞的轉(zhuǎn)移數(shù)。單側(cè)ANOVA方差檢驗發(fā)現(xiàn)各組間細胞轉(zhuǎn)移數(shù)存在統(tǒng)計學差異(P＜0.000 1)，在正常的BT474細胞培養(yǎng)基中加入10μmol/L嗎啡后，與未加嗎啡的對照組相比，細胞轉(zhuǎn)移數(shù)明顯增加(79.4±5.48 vs.32.2± 6.42，P=0.000 5，圖2)；而YAP蛋白表達被抑制后的BT474細胞在利用同濃度的嗎啡刺激后，細胞的轉(zhuǎn)移并未出現(xiàn)顯著升高(29.2±4.08 vs.21.2± 2.58，P=0.135 9，圖2)；同時，我們還觀察到BT474細胞的YAP蛋白受抑制后，與未干擾的細胞相比，其本身的轉(zhuǎn)移能力也有所下降，但不具統(tǒng)計學意義(32.2±6.42 vs.21.2±2.58，P=0.150 6，圖2)。

圖2 嗎啡促BT474細胞轉(zhuǎn)移及YAP-siRNA抑制嗎啡促細胞轉(zhuǎn)移Fig.2 Morphin-induced migration of BT474 cells and inhibited by YAP-siRNA

2.3 嗎啡去磷酸化激活YAP蛋白嗎啡誘導乳腺癌細胞轉(zhuǎn)移依賴于YAP蛋白，為了進一步了解其機制，我們使用嗎啡刺激BT474細胞后，收集不同時間點的總蛋白，Western blot檢測總蛋白中YAP含量的變化及其磷酸化狀態(tài)的改變。結(jié)果顯示，嗎啡刺激細胞后，總YAP蛋白的含量未出現(xiàn)改變，而其磷酸化狀態(tài)(p YAP)在2 h后逐漸降低(圖3)。此外，利用細胞免疫熒光染色技術(shù)檢測BT474細胞中YAP蛋白的定位，綠色熒光標記YAP蛋白，DAPI(紅色熒光)標記細胞核，發(fā)現(xiàn)嗎啡刺激4 h后，BT474細胞核內(nèi)綠色熒光強度明顯升高，表明細胞中YAP在核內(nèi)濃集，進而發(fā)揮共轉(zhuǎn)錄激活因子的活性(圖4，Overlay為YAP蛋白染色與核染色疊加后成像)。

圖3 嗎啡促BT474細胞YAP去磷酸化Fig.3 Morphine-induced dephosphorylation of YAP in BT474 cells

圖4 嗎啡誘導BT474細胞中YAP蛋白核內(nèi)濃集Fig.4 Morphine-induced YAP nuclear translocation in BT474 cells

3 討 論

嗎啡作為一種阿片類藥物可以和大腦中的阿片類受體結(jié)合，具有強大的鎮(zhèn)痛作用，并被廣泛用于晚期癌癥患者的疼痛治療，以提高生存質(zhì)量［8］。然而，一些研究證據(jù)顯示，在乳腺癌中，嗎啡具有促進腫瘤細胞增殖、轉(zhuǎn)移及侵襲的作用，并對其在腫瘤治療中的應(yīng)用提出質(zhì)疑［4，9］。本實驗中，乳腺癌細胞BT474在嗎啡刺激后，表現(xiàn)為轉(zhuǎn)移能力的增加，也證實了之一觀點，并與WEINGAERTNER等人［10］的研究具有一致性。但值得注意的是，另外也有一些研究表明，嗎啡同樣具有抑制乳腺癌生長或增加化療敏感的作用［11-12］，這可能是由于實驗條件的不一致導致，如選用了不同的腫瘤細胞系、嗎啡作用的劑量及時間不同，因此嗎啡與乳腺癌進展惡化的研究尚待進一步研究。

腫瘤的進展惡化與新生血管的形成密不可分。既往研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌研究模型中，嗎啡具有促血管生成活性［9］。其涉及的分子機制可能包括激活了G蛋白-MAPK-VEGF受體信號、EGF受體信號、高表達COX-2或前列腺素E2等介導血管形成［4，10，13-14］。在這些信號分子中，有證據(jù)顯示，細胞中的YAP蛋白能調(diào)控其中的VEGF受體的活化［7，15］。因此，我們設(shè)想YAP蛋白也可能作為嗎啡促腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的重要調(diào)控因子之一。本研究發(fā)現(xiàn)，當乳腺癌細胞YAP蛋白表達降低時，與未干預(yù)的細胞相比，嗎啡促使其轉(zhuǎn)移的能力明顯下降，這一結(jié)果證實了我們的設(shè)想。而針對YAP的研究發(fā)現(xiàn)，其可作為一種癌蛋白在多種腫瘤組織中表現(xiàn)為其本身表達升高或去磷酸化活化，最終導致細胞核內(nèi)的YAP含量增加，并作為共轉(zhuǎn)錄激活因子促使其下游的腫瘤相關(guān)基因高表達［16］。我們認為，相對于YAP蛋白的表達增高，其磷酸化的狀態(tài)更為重要。本研究也發(fā)現(xiàn)，嗎啡刺激細胞后并未引起其高表達，而是通過抑制其磷酸化促使YAP更多的進入細胞核中。最近的研究證實，共轉(zhuǎn)錄激活因子YAP進入細胞核內(nèi)，能促進細胞因子amphiregulin的大量分泌，其作為EGFR的配體能有效刺激EGFR信號通路的激活［7，15，17］。但在本實驗中，未能對這一機制進行深入研究；同時嗎啡作為一種細胞外分子，其如何通過與相應(yīng)的受體結(jié)合活化YAP蛋白使其發(fā)生去磷酸的機制也有待進一步闡明。

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(編輯 卓選鵬)

The role of YAP in morphine-induced migration of breast cancer cells

YANG Yuan-dong，ZHANG Ling-min，YUAN Hui，YUAN Wei
(Department of Anesthesiology，the First Affiliated Hospital，Medical School of Xi'an Jiaotong University，Xi'an 710061，China)

ObjectiveTo investigate the role of yes-associated protein(YAP)signaling pathway in morphineinduced migration of breast cancer cells.MethodsYAP in BT474 cells was down-regulated using siRNA. Migration assays were conducted using in vitro transwell cell migration assays.Western blots were performed to detect changes of YAP and phosphorylated YAP expressions in breast cancer cells after treatment with morphine. The translocation of YAP in cells was analyzed by immunofluorescence staining.ResultsThe expression of YAP in BT474 cells was significantly inhibited by YAP-siRNA.Morphine could significantly increase the migration of breast cancer cells as compared to that of controls(79.4±5.48 vs.32.2±6.42，P=0.0005).Down-regulated YAP led to inhibition of morphine-induced BT474 cell migration(29.2±4.08 vs.21.2±2.58，P=0.135 9).In addition，morphine-induced YAP dephosphorylation and nuclear translocation in the time-dependent manner.Conclusion Morphine can promote the metastasis of breast cancer by activating YAP protein in the cancer cells.

morphine；breast cancer；migration；yes-associated protein(YAP)

R971.2

A

1671-8259(2014)05-0618-04

10.7652/jdyxb201405010

2014-01-07

2014-04-02

陜西省科技攻關(guān)項目(No.2013SF2-14) Supported by the Key Science and Technology Program of Shaanxi Province(No.2013SF2-14)

楊遠東(1968-)，男(漢族)，主治醫(yī)師.E-mail：yyd519@163.com

時間：2014-07-22 16∶31 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20140722.1631.011.html