生物法合成戊二胺研究進(jìn)展

李東霞，黎 明，王洪鑫，王舒雅，路福平天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國(guó)家工業(yè)酶工程實(shí)驗(yàn)室 天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457

綜述

生物法合成戊二胺研究進(jìn)展

李東霞，黎 明，王洪鑫，王舒雅，路福平
天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國(guó)家工業(yè)酶工程實(shí)驗(yàn)室 天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457

隨著經(jīng)濟(jì)快速發(fā)展，大氣污染和全球變暖的趨勢(shì)日益惡化。世界上每年消耗大量石化資源來(lái)源的聚酰胺，戊二胺作為聚酰胺的重要組成單體，生物法合成戊二胺具有經(jīng)濟(jì)學(xué)和生態(tài)學(xué)雙重意義。目前, 生物法合成戊二胺的工程菌主要有谷氨酸棒狀桿菌和大腸桿菌，文中從微生物中戊二胺的代謝、戊二胺合成途徑的關(guān)鍵酶和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、戊二胺生產(chǎn)最佳代謝途徑和戊二胺產(chǎn)量的預(yù)測(cè)、代謝工程研究進(jìn)展等方面綜述了生物法合成戊二胺的最新研究現(xiàn)狀和進(jìn)展，并對(duì)其前景進(jìn)行了展望。

戊二胺，谷氨酸棒狀桿菌，大腸桿菌，賴氨酸脫羧酶，尸胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白

戊二胺(Diaminopentane)，又名尸胺(Cadaverine)、1,5-二氨基戊烷、五亞甲基二胺或尸毒素，是生物胺類(lèi) (包括腐胺、精胺、亞精胺和尸胺等) 中的一種[1]。1885年，德國(guó)柏林的醫(yī)師Ludwig Brieger 在腐敗的尸體中首次發(fā)現(xiàn)該胺類(lèi)，并以此得名尸胺[2]。在細(xì)胞內(nèi)，戊二胺是賴氨酸合成途徑的延伸反應(yīng)產(chǎn)物，是賴氨酸脫羧酶(E.C.4.1.1.18)催化賴氨酸脫羧產(chǎn)生的 (圖1)。戊二胺具有許多重要的生理功能，如戊二胺是微生物細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)鐵離子濃度的“鐵親和系統(tǒng)”和一些嚴(yán)格厭氧的革蘭氏陰性菌肽聚糖的主要組成成分[3-5]；戊二胺在關(guān)閉孔蛋白通道和保護(hù)大腸桿菌免受氧的毒害方面也起著重要的作用[6-8]；內(nèi)源性戊二胺的分泌以及胞內(nèi)高濃度戊二胺積累可導(dǎo)致外膜滲透性降低，抑制某些抗生素如頭孢霉素類(lèi)抗生素的作用[9-11]。

戊二胺在農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)和工業(yè)上具有廣泛的應(yīng)用。在農(nóng)業(yè)上，外源施加戊二胺可以改善坐果和促進(jìn)果實(shí)發(fā)育，提高果實(shí)的產(chǎn)量[12-13]；在醫(yī)學(xué)上，它也可作為一種有效治療痢疾的藥物[14]；在工業(yè)上，戊二胺與二元酸進(jìn)行聚合反應(yīng)可合成優(yōu)質(zhì)高分子材料——新型尼龍[15]。

圖1 賴氨酸脫羧反應(yīng)Fig. 1 Reaction of lysine decarboxylate.

每年全球約生產(chǎn)600萬(wàn)t聚酰胺，其中尼龍6.6 (即聚酰胺6.6, Polyamide 6.6, PA 6.6) 是聚酰胺類(lèi)產(chǎn)品中開(kāi)發(fā)最早、產(chǎn)量最大、應(yīng)用最廣的產(chǎn)品之一，被廣泛應(yīng)用于航空航天、汽車(chē)部件、機(jī)械零部件、電子電器和包裝材料領(lǐng)域中，在膠粘劑及化妝品領(lǐng)域也得到了廣泛應(yīng)用[16]。尼龍6.6是由己二酸和己二胺按摩爾比1：1聚合的產(chǎn)物。目前，己二酸可利用生物催化技術(shù)合成，但己二胺的合成仍然依賴于石油化工產(chǎn)品[17]。隨著國(guó)際油價(jià)的飆升和石油資源的枯竭以及石油資源的大量消耗導(dǎo)致大氣CO2含量的迅速升高和環(huán)境污染，人們?cè)噲D尋找一種能利用生物方法生產(chǎn)己二胺的替代物，從而用一種可再生資源替代石油來(lái)生產(chǎn)尼龍[18]。戊二胺是賴氨酸脫羧的產(chǎn)物，與己二胺互為同系物，可代替己二胺用來(lái)合成新型尼龍 (圖2)。在工業(yè)上，戊二胺可以分別與己二酸、琥珀酸和癸二酸等二元酸聚合形成新型材料聚酰胺5.6(Polyamide 5.6，PA 5.6)、聚酰胺5.4[19-21]和聚酰胺5.10[22]。PA 5.6具有重要的工業(yè)用途，與PA 6.6一樣具有良好的機(jī)械強(qiáng)度、較高的熔點(diǎn)和耐各種有機(jī)溶劑的特性，可以替代PA 6.6使用[23]。聚酰胺5.10材料性能極佳，具有高熔點(diǎn)(215 ℃)、低吸水率(1.8%)、低密度(1.07 g/cm3)等優(yōu)點(diǎn)。由于己二酸、琥珀酸已經(jīng)可以通過(guò)微生物合成，癸二酸也可以從蓖麻油來(lái)制取。因此，戊二胺的生物合成成為合成新型材料聚酰胺的一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題，下文將闡述生物法合成戊二胺的最新研究進(jìn)展。

圖2 PA 5.6反應(yīng)方程式Fig. 2 Chemical structure and production of polyamide 5.6 using cadaverine and adipic acid from renewable resources.

1 微生物中戊二胺的代謝

微生物中戊二胺的代謝包括戊二胺的合成、降解、吸收和分泌。微生物中存在兩種完全不同的賴氨酸合成途徑：一種是始于α-酮戊二酸和乙酰-CoA的α-氨基己二酸途徑 (AAA)，另一種是始于天冬氨酸的二氨基庚二酸途徑 (DAP)。第一種途徑主要存在于高等真菌和古生菌中，某些細(xì)菌如嗜熱棲熱菌屬中也存在該途徑；第二種途徑主要存在于細(xì)菌和植物中，而且這兩個(gè)途徑?jīng)]有直接的進(jìn)化關(guān)系[24]。

1.1 大腸桿菌和谷氨酸棒狀桿菌中戊二胺的代謝途徑

戊二胺是通過(guò)賴氨酸脫羧酶催化賴氨酸脫羧形成的。大腸桿菌能夠直接合成戊二胺，谷氨酸棒狀桿菌雖然不能直接合成戊二胺，但它能高效合成戊二胺的前體，即賴氨酸脫羧酶的底物賴氨酸，并且二者合成賴氨酸的途徑類(lèi)似 (圖3)[25]。如果在谷氨酸棒狀桿菌中表達(dá)賴氨酸脫羧酶，谷氨酸棒桿菌也能像大腸桿菌一樣直接合成戊二胺[26]。大腸桿菌中賴氨酸的合成途徑從TCA循環(huán)的中間代謝物草酰乙酸(Oxaloacetate)開(kāi)始，需要連續(xù)十步的酶反應(yīng)。前3步生成代謝的節(jié)點(diǎn)中間物天冬氨酸半醛(Aspartic acid semialdehyde)，由它進(jìn)一步合成L-甲硫氨酸、L-蘇氨酸、L-異亮氨酸和L-賴氨酸。L-賴氨酸經(jīng)賴氨酸脫羧酶的催化脫羧生成戊二胺。在大腸桿菌中，存在3種天冬氨酸激酶(EC 2.7.2.4)：LysC、ThrA和MetL，它們是催化天冬氨酸磷酸化成天冬氨酰磷酸的同工酶。

民辦本科院校學(xué)生主動(dòng)學(xué)習(xí)的態(tài)度不是很積極，對(duì)于深?yuàn)W的數(shù)學(xué)推導(dǎo)往往有畏難情緒．?dāng)?shù)學(xué)建模課程中采取案例式教學(xué)方法，課堂上首先對(duì)一些生動(dòng)的實(shí)際問(wèn)題進(jìn)行分析，在分析的基礎(chǔ)上自然而然地建立數(shù)學(xué)模型，然后再使用數(shù)學(xué)方法分析求解．這種教學(xué)方法符合學(xué)生的認(rèn)知理論，學(xué)生很容易接受．如微分方程內(nèi)容的案例有出土文物年代的推斷，陳光標(biāo)代言天杞園減肥是真是假案例；從手機(jī)導(dǎo)航這一問(wèn)題來(lái)講解圖論中的最短路徑問(wèn)題，從灑水車(chē)灑水問(wèn)題來(lái)講解郵遞員路徑問(wèn)題；從大學(xué)生手上的零花錢(qián)如何分配最佳來(lái)講解運(yùn)籌學(xué)中的最優(yōu)化問(wèn)題等．

其中天冬氨酸激酶Ⅰ(ThrA)[27]、天冬氨酸激酶Ⅱ(MetL)[28]是雙功能酶，它們同時(shí)也具有高絲氨酸脫氫酶活性，能催化分支中間產(chǎn)物天冬氨酸半醛生成高絲氨酸，從而使碳流流向合成蘇氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸的分支途徑。天冬氨酸激酶Ⅲ(LysC) 是賴氨酸合成途徑中的特異關(guān)鍵酶[29]。而在谷氨酸棒狀桿菌中，只有一種天冬氨酸激酶(LysC)。此外，谷氨酸棒狀桿菌中既可以通過(guò)二氨基庚二酸脫氫酶 (Ddh, EC 1.4.1.16) 直接催化四氫二吡啶二羧酸轉(zhuǎn)化為二氨基庚二酸，也可以通過(guò)DapDCEF四步催化完成轉(zhuǎn)化，而在大腸桿菌中該過(guò)程要經(jīng)歷DapDCEF四步催化才能完成。大腸桿菌中賴氨酸合成的各個(gè)步驟都受賴氨酸調(diào)控，既包括對(duì)天冬氨酸激酶Ⅲ基因 (lysC)、天冬氨酸半醛脫氫酶基因 (asd)、二氫吡啶二羧酸還原酶基因(dapB)、四氫二吡啶琥珀酸酶基因 (dapD) 和二氨基庚二酸脫羧酶基因 (lysA) 的轉(zhuǎn)錄阻遏，又包含對(duì)天冬氨酸激酶Ⅲ (LysC) 和二氫甲基吡啶酸合成酶 (DapA) 催化的反饋抑制作用[30]。

21世紀(jì)是信息化高速發(fā)展時(shí)代,多媒體的廣泛應(yīng)用已經(jīng)成為大趨勢(shì)。隨著高校信息化的發(fā)展,也必然使多媒體教室的使用朝著信息化、智能化方向深入發(fā)展[6]。不同高校應(yīng)該從學(xué)校的實(shí)際情況出發(fā),堅(jiān)持發(fā)展的理念,運(yùn)用科學(xué)的管理方法、先進(jìn)的管理技術(shù)、完善的管理制度,認(rèn)真做好多媒體的管理使用工作,同時(shí)還要做好多媒體管理人員和任課教師等的培訓(xùn)工作,為高校的正常教學(xué)運(yùn)行提供可靠的軟件支持和硬件支撐,更好地服務(wù)于全校的教學(xué)工作。

圖3 大腸桿菌和谷氨酸棒狀桿菌中尸胺的代謝途徑 (左圖為大腸桿菌中，右圖為谷氨酸棒狀桿菌中。粗體箭頭表示基因過(guò)表達(dá)活性增強(qiáng)，箭頭上帶有X表示該基因被刪除，虛線表示該途徑被弱化)Fig. 3 Metabolic pathway of cadaverine in E. coli and C. glutamicum. The left is in E. coli and the right is in C. glutamicum. Thick arrows indicate increased activity by overexpression, arrows with blue X’s indicate genes that are knocked out, dashed line indicates attenuation.

除了戊二胺合成途徑，戊二胺的代謝還受其降解和轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)控[31]。尸胺-賴氨酸反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白CadB既可以依靠離子動(dòng)力勢(shì)攝取戊二胺，又可以分泌戊二胺。大腸桿菌中戊二胺的利用和降解途徑，除了編碼腐胺/尸胺氨基轉(zhuǎn)移酶的SpeE催化戊二胺為氨丙基戊二胺之外，精胺乙酰轉(zhuǎn)移酶SpeG催化戊二胺為N-乙酰戊二胺，戊二胺轉(zhuǎn)氨酶YgjG催化戊二胺為氨基戊醛，腺嘌呤脫氨酶PuuA催化戊二胺的谷氨?；痆32]。在假單胞菌中，戊二胺通過(guò)氨基轉(zhuǎn)換作用代謝為α-哌啶，進(jìn)一步氧化為δ-氨基戊酸 (AMV)[25]。在谷氨酸棒狀桿菌中，戊二胺也可以和乙酰-CoA作用生成乙酰戊二胺。在一些物種中，戊二胺也是氨基丙酸化和乙?；牡孜颷33]。

圖4 大腸桿菌中Cad系統(tǒng)的調(diào)控模型[38]Fig. 4 Regulation Model of the Cad System in E. coli (simplified)[38].

1.2 大腸桿菌中戊二胺誘導(dǎo)合成的調(diào)控機(jī)制

來(lái)自于反芻動(dòng)物月形單胞菌的ldc基因的ORF長(zhǎng)1 182 bp，編碼393個(gè)氨基酸，形成的賴氨酸脫羧酶由兩個(gè)相同的單體構(gòu)成[46]。該基因編碼的賴氨酸脫羧酶能夠同時(shí)催化賴氨酸和鳥(niǎo)氨酸脫羧，而且對(duì)這兩個(gè)底物具有相似的Km和Vmax值。但是在該酶的催化結(jié)構(gòu)域里，催化賴氨酸脫羧和催化鳥(niǎo)氨酸脫羧的比率是0.83。該酶和其他已經(jīng)報(bào)道的細(xì)菌來(lái)源的賴氨酸脫羧酶和鳥(niǎo)氨酸脫羧酶幾乎沒(méi)有氨基酸序列的相似性，但與真核生物的鳥(niǎo)氨酸脫羧酶的氨基酸序列大約有60%的相似性[4]。

2 戊二胺合成途徑的關(guān)鍵酶和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白

[47] Kashiwagi K, Miyamoto S, Suzuki F, et al. Excretion of putrescine by the putrescine-ornithine antiporter encoded by the potE gene of Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci USA, 1992, 89: 4529–4533.

賴氨酸脫羧酶催化賴氨酸脫羧形成戊二胺，是戊二胺合成途徑中最關(guān)鍵的酶。賴氨酸脫羧酶存在于大腸桿菌Escherichia coli、蜂房哈夫尼菌Hafnia alvei、耐堿芽胞桿菌Bacillus halodurans、蠟樣芽胞桿菌Bacillus cereus、尸桿菌Bacterium cadaveris、伯克霍爾德氏菌Burkholderia vietnamensia、青紫色素桿菌Chromobacterium violaceum、霍亂弧菌Vibrio cholerae、毛鏈霉菌Streptomyces polosus等[36,39-43]大多數(shù)微生物中。賴氨酸脫羧酶也存在于高等植物中，例如黃瓜、家山黧豆等[43]。目前，已經(jīng)分別從大腸桿菌、蜂房哈夫尼菌、反芻動(dòng)物月形單胞菌Selenomonas ruminantium、鼠傷寒沙門(mén)氏菌Salmonella typhimurium和鮰愛(ài)德華氏菌Edwardsiella ictaluri等細(xì)菌中克隆出賴氨酸脫羧酶基因[44]。其中對(duì)來(lái)自于大腸桿菌中的兩種脫羧酶的特性研究較為清楚。

大腸桿菌中有兩種賴氨酸脫羧酶：誘導(dǎo)型酶CadA[34-35]和組成型酶LdcC[36-37]，它們都需要磷酸吡哆醛作為輔助因子。CadA的最適pH是5.5，在pH 8.0時(shí)完全失活；LdcC的最適pH是7.6，在廣泛的pH范圍內(nèi)均有活性[36-37]。在它們各自的最適pH條件下，LdcC的酶活性高于CadA，盡管LdcC和CadA的最適溫度都是52 ℃，但是，CadA在高溫下比較穩(wěn)定，在70 ℃時(shí)仍能保持穩(wěn)定，而LdcC從37 ℃開(kāi)始，隨著溫度升高而逐步失活[37]。厭氧環(huán)境下cadA在賴氨酸存在的情況下通過(guò)低pH (5.5) 誘導(dǎo)，表達(dá)達(dá)到最高水平，尸胺的分泌中和了胞外培養(yǎng)基的pH[34-35]。多數(shù)文獻(xiàn)認(rèn)為，ldcC是組成型表達(dá)，且在菌體中其表達(dá)水平很低[36]；但也有文獻(xiàn)認(rèn)為，ldcC不是組成型表達(dá)，而是被某種因子抑制，正常條件下轉(zhuǎn)錄很弱，mRNA不穩(wěn)定[37]。蜂房哈夫尼菌的賴氨酸脫羧酶基因ldc為組成型表達(dá)，雖然文獻(xiàn)中沒(méi)有直接來(lái)自于蜂房哈夫尼菌的賴氨酸脫羧酶的最適溫度和最適pH值，但是，固定化法產(chǎn)該酶的細(xì)胞制備1, 5-戊二胺時(shí)使用的溫度為37 ℃, pH為5.0[45]。不同來(lái)源的賴氨酸脫羧酶的氨基酸序列一致性比較高，大腸桿菌的ldcC與cadA以及來(lái)自于蜂房哈夫尼菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌的ldc基因編碼的氨基酸序列相比，相似性分別為69.4%、68.6%和68.9%。大腸桿菌的CadA和蜂房哈夫尼菌的Ldc氨基酸序列相似性為80%，然而只有41%序列具有相同的密碼子。而且它們都表現(xiàn)出特定的底物專(zhuān)一性，只能對(duì)賴氨酸進(jìn)行脫羧反應(yīng)[44]。

少尿：為了預(yù)防脫水和休克，及時(shí)補(bǔ)液，預(yù)防和治療休克：應(yīng)及時(shí)補(bǔ)充液體和血液，但應(yīng)避免使用限制腎血管的藥物（如去甲腎上腺素）；治療高鉀血癥：葡萄糖和碳酸氫鈉混合靜脈注射法，鉀離子向細(xì)胞轉(zhuǎn)移，糾正高鉀血癥，也可采用血液透析和腹膜透析。如果有嚴(yán)重的高鉀血癥或高分解代謝狀態(tài)，血液透析是最合適的；糾正代謝性酸中毒：代謝性酸中毒在少尿期并不嚴(yán)重，只需補(bǔ)充足夠的卡路里，減少身體組織的分解；控制感染：及時(shí)控制繼發(fā)感染，選擇無(wú)毒的腎臟抗生素如頭孢菌素、紅霉素、氨芐西林等。

兩組患者治療后，Lund-Mackay鼻竇CT掃描評(píng)分均下降，與治療前相比具有顯著性差異（P＜0.05）。在治療前，觀察組與對(duì)照組的Lund-Mackay鼻竇CT掃描評(píng)分之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），在治療20天后，觀察組的該項(xiàng)評(píng)分低于對(duì)照組，且比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表3。

大腸桿菌中有兩種賴氨酸脫羧酶：誘導(dǎo)型酶CadA[34-35]和組成型酶LdcC[36-37]，它們都需要磷酸吡哆醛作為輔助因子。Fritz等建立了大腸桿菌中戊二胺誘導(dǎo)合成的戊二胺操縱子調(diào)控機(jī)制 (圖4)[38]。戊二胺操縱子包括誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Pcad、賴氨酸脫羧酶基因cadA和賴氨酸-尸胺反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因cadB，戊二胺操縱子上游是其調(diào)節(jié)基因cadC[34]。戊二胺的合成受pH值和賴氨酸濃度調(diào)節(jié)。在低pH值、高賴氨酸濃度條件下，cadC基因被激活，其產(chǎn)物作用于Pcad，啟動(dòng)cadA、cadB基因表達(dá)合成賴氨酸脫羧酶CadA和賴氨酸-尸胺反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白CadB[31]。CadA利用細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)子和賴氨酸合成戊二胺和CO2，同時(shí)將合成的戊二胺轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外。cadC基因上游有編碼賴氨酸滲透酶的基因lysP，賴氨酸滲透酶基因lysP并不是戊二胺操縱子的組成成分，但它編碼的蛋白LysP能抑制CadC的活性。高濃度的賴氨酸可以抑制LysP蛋白對(duì)CadC活性的抑制作用[37]。高濃度戊二胺對(duì)cadC基因表達(dá)具有抑制作用，還可導(dǎo)致細(xì)胞膜孔蛋白的關(guān)閉[9]，影響細(xì)菌的正常生長(zhǎng)。

[3] Francisco J, Flores J, Rincn JF. Characterization of the iron regulated desA promoter of Streptomyces pilosusasa system for controlled gene express ion in actinomycetes. Microb Cell Fact, 2003, 71: 339–349.

2.2 賴氨酸-尸胺反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白

圖5 賴氨酸脫羧酶系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig. 5 Phylogenetic tree of lysine decarboxylase.

賴氨酸-尸胺反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白CadB (Cadaverinelysine antiporter)是一種轉(zhuǎn)運(yùn)戊二胺和賴氨酸的跨膜蛋白，與PotE(腐胺-鳥(niǎo)氨酸反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)[47-50]和AdiC(胍丁胺-精氨酸反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)[51-52]一樣，都屬于APC超家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 (Amino acid/polyamine/ organocation superfamily of transporters)[53]，對(duì)菌體生長(zhǎng)具有重要影響。cadB基因長(zhǎng)1 335 bp，與cadA組成cad操縱子，編碼444個(gè)氨基酸[34]。大腸桿菌中戊二胺的濃度不只是通過(guò)生物合成來(lái)維持，也可以通過(guò)攝取、分泌、降解進(jìn)行調(diào)節(jié)[31]。由于賴氨酸脫羧酶是胞內(nèi)酶，合成的戊二胺若在細(xì)胞內(nèi)積累，對(duì)細(xì)胞具有毒性[54]。Soksawatmaekhin等[31]對(duì)CadB的功能進(jìn)行了詳細(xì)研究，表明CadB在細(xì)胞中同時(shí)具有分泌和吸收功能，既可以經(jīng)過(guò)質(zhì)子動(dòng)力攝取戊二胺，也可以進(jìn)行賴氨酸-戊二胺的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)，從而分泌戊二胺。尸胺吸收和分泌的Km值分別為20.8、303 μmol/L。在中性pH值下，如果細(xì)胞內(nèi)多胺不足，細(xì)胞可以通過(guò)CadB少量攝入戊二胺；在酸性pH值下，CadA催化賴氨酸形成戊二胺，CadB將合成的戊二胺轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外，維持細(xì)胞內(nèi)外戊二胺的平衡。CadB和CadA對(duì)于細(xì)胞在酸性pH值下的生長(zhǎng)和對(duì)酸性的耐受方面具有重要作用。

阿東這才想到，阿里已經(jīng)很久沒(méi)有拍著手掌歡唱“阿里的弟弟回來(lái)了”。他一下警覺(jué)起來(lái)，心道自己是不是對(duì)阿里關(guān)心少了？當(dāng)晚便帶著阿里去逛街，給他買(mǎi)了許多吃的，還陪他打了游戲機(jī)。阿里跟著阿東倒是開(kāi)心，玩游戲時(shí)也樂(lè)得呵呵笑。但一到家，轉(zhuǎn)瞬便又神情憂郁。

Soksawatmaekhin等[54]還進(jìn)一步鑒定出CadB上與戊二胺吸收和分泌相關(guān)的氨基酸殘基：Tyr73、Tyr89、Tyr90、Glu204、Tyr235、Asp303和Tyr423強(qiáng)烈影響戊二胺的吸收和分泌；Trp43、Tyr57、Tyr107、Tyr366和Tyr368主要影響戊二胺的吸收；Arg299主要影響戊二胺的分泌，說(shuō)明Arg299涉及賴氨酸羧基的識(shí)別；Cys370的巰基不僅對(duì)戊二胺的氨基識(shí)別是必需的，可能還涉及H+的識(shí)別。而且，同時(shí)涉及戊二胺吸收和分泌、或者僅涉及戊二胺分泌的氨基酸殘基都位于細(xì)胞膜的細(xì)胞質(zhì)一側(cè)，而僅涉及尸胺吸收的氨基酸殘基位于細(xì)胞膜的周質(zhì)空間一側(cè)。Tomitori等[55]還利用已知的AdiC晶體模型模擬了CadB與PotE的結(jié)構(gòu)，三者結(jié)構(gòu)極其相似，只是與底物結(jié)合位點(diǎn)的寬度因底物大小而不同。這些研究為CadB的功能改造奠定了基礎(chǔ)。

谷氨酸棒狀桿菌不能合成戊二胺，因此不存在專(zhuān)一的戊二胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，轉(zhuǎn)運(yùn)賴氨酸的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白LysE也不能轉(zhuǎn)運(yùn)戊二胺。Kind等[56]研究表明，當(dāng)在谷氨酸棒桿菌中合成戊二胺時(shí)，有35種候選基因的表達(dá)量上升，其中編碼一種滲透酶的cg2893基因的表達(dá)量增加了2.6倍。當(dāng)該基因被刪除時(shí)，戊二胺的分泌降低了90%，而過(guò)表達(dá)該基因時(shí)，戊二胺的產(chǎn)量可提高20%。因此，滲透酶Cg2893可能具有轉(zhuǎn)運(yùn)戊二胺的功能。cg2893基因長(zhǎng)1 485 bp，編碼494個(gè)氨基酸，其核苷酸序列和cadB的相似性為69.42%，其氨基酸序列與CadB的相似性為67%。該基因的發(fā)現(xiàn)為在谷氨酸棒桿菌中研究戊二胺的合成和轉(zhuǎn)運(yùn)提供了理論依據(jù)。

3 戊二胺生產(chǎn)最佳代謝途徑和產(chǎn)量的預(yù)測(cè)

計(jì)量網(wǎng)絡(luò)模型可以通過(guò)模擬預(yù)測(cè)谷氨酸棒狀桿菌和大腸桿菌生產(chǎn)戊二胺的潛力，該模型以兩種微生物的基因組序列為基礎(chǔ)進(jìn)行評(píng)估[57]。使用基礎(chǔ)通量模型分析可以推導(dǎo)出生產(chǎn)戊二胺的最大理論產(chǎn)量、最佳途徑、最有前途的目的基因[58]。谷氨酸棒狀桿菌和大腸桿菌利用不同的代謝途徑優(yōu)化戊二胺的生產(chǎn)[57]。谷氨酸棒桿菌大量利用戊糖磷酸途徑，而此途徑在大腸桿菌中幾乎未參與戊二胺的合成。合成賴氨酸時(shí)，谷氨酸棒桿菌利用特異性的脫氫酶分支途徑，而流向三羧酸循環(huán)的通量為零，相反，大腸桿菌中只使用需要大量通量流向三羧酸循環(huán)的琥珀酰途徑。預(yù)測(cè)的谷氨酸棒狀桿菌生產(chǎn)戊二胺最高產(chǎn)量是0.43 g/g (0.75 mol/mol)，大腸桿菌則是0.49 g/g (0.84 mol/mol)。這些數(shù)值遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了目前所達(dá)到的生產(chǎn)水平，說(shuō)明我們?nèi)杂泻艽蟮膬?yōu)化空間去生產(chǎn)戊二胺。大腸桿菌中，轉(zhuǎn)氫酶 (EC 1.6.1.1-2) 催化NAD+和NADPH與NADH和NADP+之間相互轉(zhuǎn)化的線粒體酶，在網(wǎng)絡(luò)模型上刪除轉(zhuǎn)氫酶時(shí)預(yù)測(cè)產(chǎn)量降低至0.40 g/g。反之，在網(wǎng)絡(luò)模型中添加轉(zhuǎn)氫酶時(shí)，預(yù)測(cè)的谷氨酸棒桿菌最高產(chǎn)量則增加為0.49 g/g。因此，轉(zhuǎn)氫酶在兩種微生物戊二胺合成途徑中扮演重要的角色。

4 戊二胺代謝工程研究進(jìn)展

大腸桿菌的遺傳背景清楚，戊二胺的合成機(jī)制明確，是研究戊二胺合成的理想宿主之一。研究者或者利用大腸桿菌的靜息細(xì)胞合成戊二胺，或者根據(jù)大腸桿菌中戊二胺的代謝途徑，對(duì)大腸桿菌進(jìn)行代謝工程改造，利用糖類(lèi)發(fā)酵直接合成戊二胺。Nishi等利用強(qiáng)啟動(dòng)子Plac構(gòu)建過(guò)表達(dá)cadA的大腸桿菌工程菌，工程菌發(fā)酵后投入底物賴氨酸，戊二胺產(chǎn)量達(dá)到69 g/L發(fā)酵液[59]。為了直接利用糖類(lèi)合成戊二胺，Qian等[32]利用大腸桿菌K12 W3110作為宿主，對(duì)戊二胺代謝途徑進(jìn)行了改造：1) 刪除編碼降解戊二胺的speE、speG、ygjG、puuA和puuP基因，使戊二胺降解和利用途徑失活；2) 利用強(qiáng)啟動(dòng)子Plac過(guò)表達(dá)cadA；3) 通過(guò)強(qiáng)啟動(dòng)子Ptrc替換原啟動(dòng)子過(guò)表達(dá)lysC、dapA、dapB和lysA來(lái)增加底物賴氨酸的合成；4)把ddh整合到染色體的iclR(異檸檬酸裂合酶)調(diào)節(jié)基因位點(diǎn)增加草酰乙酸的供給。結(jié)果表明：對(duì)賴氨酸合成途徑的修飾以及野生型lysC的過(guò)表達(dá)沒(méi)有使戊二胺產(chǎn)量提高，而草酰乙酸的供給是個(gè)潛在的瓶頸。最終，大腸桿菌工程菌XQ56合成戊二胺的產(chǎn)量為 0.13 g/g葡萄糖。

谷氨酸棒狀桿菌是生產(chǎn)賴氨酸的高產(chǎn)菌株，賴氨酸是合成戊二胺的前體物質(zhì)。因此，研究者也選擇谷氨酸棒狀桿菌作為宿主菌株進(jìn)行代謝工程改造，從而利用糖類(lèi)發(fā)酵來(lái)合成戊二胺。Mimitsuka等[26]首次利用谷氨酸棒桿菌工程菌發(fā)酵葡萄糖來(lái)生產(chǎn)戊二胺，將cadA插入谷氨酸棒桿菌的高絲氨酸脫氫酶基因(hom)位點(diǎn)，cadA在卡那霉素抗性基因啟動(dòng)子調(diào)控下表達(dá)，發(fā)酵液上清中積累了2.6 g/L戊二胺；研究還表明，由于谷氨酸棒桿菌缺乏戊二胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，導(dǎo)致戊二胺在細(xì)胞內(nèi)積累，抑制了賴氨酸脫羧酶的活性和戊二胺的合成。Tateno等[60]將淀粉酶基因amyA和cadA同時(shí)克隆到谷氨酸棒狀桿菌中共表達(dá)，構(gòu)建成可直接利用可溶性淀粉生產(chǎn)戊二胺的谷氨酸棒狀桿菌工程菌，尸胺產(chǎn)量達(dá)到23.4 mmol/L。本實(shí)驗(yàn)室利用蜂房哈夫尼菌中賴氨酸脫羧酶基因ldc，以大腸桿菌/谷氨酸棒桿菌穿梭質(zhì)粒pXMJ19為載體，構(gòu)建工程菌株C. glutamicum TK260512/pXMJl9-ldc。工程菌C. glutamicum TK260512/pXMJ19-ldc合成的戊二胺產(chǎn)量為0. 96 g/L[61]。

構(gòu)建戊二胺高產(chǎn)菌株需要對(duì)代謝途徑的不同節(jié)點(diǎn)進(jìn)行改造或修飾，包括中心碳代謝中前體和輔因子優(yōu)化、產(chǎn)物的轉(zhuǎn)運(yùn)以及與戊二胺合成代謝流無(wú)關(guān)的分支代謝途徑的解除或弱化[62]。Kind等[63]對(duì)谷氨酸棒狀桿菌中戊二胺代謝途徑進(jìn)行了改造：1) 在天冬氨酸激酶和丙酮酸羧化酶引入點(diǎn)突變 lysC311和pycA458，解除了該酶受到的反饋調(diào)節(jié)；2) 過(guò)表達(dá)回補(bǔ)酶 (Anaplerotic enzyme) 丙酮酸羧化酶基因(pyc)，刪除催化草酰乙酸消耗的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(pepck)，保證重要前體草酰乙酸的供給；3) 過(guò)表達(dá)天冬氨酸激酶基因(aspC)、二氫吡啶二羧酸還原酶基因(dapA)、二氨基庚酸脫氫酶基因(ddh)和二氨基庚酸羧化酶基因(lysA)，保證生物合成流流向賴氨酸；4) 高絲氨酸脫氫酶在59位點(diǎn)(hom59)滲漏突變，實(shí)現(xiàn)對(duì)分支絲氨酸途徑的弱化。5) 利用強(qiáng)啟動(dòng)子Ptuf調(diào)控和密碼子優(yōu)化過(guò)表達(dá)ldcC，最終戊二胺產(chǎn)量達(dá)到200 mmol(0.11 g/g葡萄糖)，該菌株命名為DAP-3c。若加入賴氨酸脫羧酶的輔酶磷酸吡哆醛，戊二胺產(chǎn)量達(dá)到300 mmol(0.17 g/g葡萄糖)。此外，該過(guò)程中檢測(cè)到副產(chǎn)物N-乙酰戊二胺，約占總產(chǎn)物的25%。N-乙酰尸胺是以乙酰-CoA作為乙?；w，經(jīng)NCgl1469催化戊二胺合成的產(chǎn)物[63]。敲除該基因戊二胺產(chǎn)量增加了11%，葡萄糖向戊二胺的摩爾轉(zhuǎn)換率達(dá)到30%。然而，副產(chǎn)物的代謝流沒(méi)有全部流向戊二胺，這可能是受到戊二胺轉(zhuǎn)運(yùn)的限制造成的。通過(guò)全局轉(zhuǎn)錄分析 (Global transcription profiling)，從35種候選基因中鑒定出cg2893編碼的滲透酶可能具有轉(zhuǎn)運(yùn)戊二胺的功能[64]。敲除該基因戊二胺的分泌降低了90%，而過(guò)表達(dá)該基因時(shí)，戊二胺的產(chǎn)量可提高20%，副產(chǎn)物減少75%。說(shuō)明增強(qiáng)戊二胺的分泌可以降低戊二胺對(duì)賴氨酸脫羧酶的競(jìng)爭(zhēng)抑制作用，從而提高戊二胺的產(chǎn)量。本實(shí)驗(yàn)將cadB克隆至谷氨酸棒桿菌中，與蜂房哈夫尼菌的ldc基因共表達(dá)，在谷氨酸棒桿菌合成戊二胺的同時(shí)，幫助戊二胺轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外，解除戊二胺的反饋抑制作用。工程菌合成戊二胺的分泌率較C. glutamicum TK260512/pXMJl9-ldc提高了27%[65]，戊二胺的產(chǎn)量也提高了30%。說(shuō)明CadB可以在谷氨酸棒狀桿菌中表達(dá)，且可以將戊二胺轉(zhuǎn)運(yùn)至胞外，進(jìn)而提高戊二胺的產(chǎn)量。

4)利用非對(duì)稱孔隙壓力場(chǎng)可以提高煤體定向壓裂效果，控制水壓與水平應(yīng)力比需要控制在合理的范圍內(nèi)。研究結(jié)果表明：鶴壁礦區(qū)內(nèi)，煤巖體水平地應(yīng)力比在1.0～1.8，控制水壓6～12 MPa時(shí)定向壓裂效果明顯。

[18] Sanders J, Scott E, Weusthuis R, et al. Bio-refinery as the bio-inspired process to bulk chemicals. Macromol Biosci, 2007, 7(2): 105–117.

其二，突出各部門(mén)各鄉(xiāng)鎮(zhèn)街道的積極協(xié)同配合。由于“五水共治”不單單是水利和環(huán)保等部門(mén)的工作，而是涉及到鄉(xiāng)鎮(zhèn)街道等基層組織的工作，所以就需要通過(guò)宣傳報(bào)道營(yíng)造一種各單位、各部門(mén)、各鄉(xiāng)鎮(zhèn)街道齊心協(xié)力、共同為“五水共治”獻(xiàn)計(jì)出力的氛圍。

Buschke等利用谷氨酸棒狀桿菌共表達(dá)木糖異構(gòu)酶基因xylA和木酮糖激酶基因xylB并在HCE (High constitutive expression) 啟動(dòng)子調(diào)控下過(guò)表達(dá)cadA，工程菌利用木糖發(fā)酵合成戊二胺，戊二胺產(chǎn)量為13.9 mmol/L發(fā)酵液，轉(zhuǎn)化率為每mol木糖轉(zhuǎn)化(164.5±6.9) mmol戊二胺，對(duì)應(yīng)每mol碳轉(zhuǎn)化(32.9±1.4) mmol戊二胺[67]。碳源轉(zhuǎn)化為戊二胺的轉(zhuǎn)化率比較低，可能是碳源轉(zhuǎn)化成二氧化碳損失過(guò)多，以及木糖的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制還不太清楚。為了提高木糖的轉(zhuǎn)化效率和提高戊二胺產(chǎn)量，Buschke等將木糖合成途徑中的tkt操縱子過(guò)表達(dá)并刪除戊二胺分解代謝中的lysE和act基因，構(gòu)建高產(chǎn)戊二胺的谷氨酸棒狀桿菌工程菌C. glutamicum DAP-Xyl1 icdGTGPeftufbp Psodtkt Δact ΔlysE，戊二胺產(chǎn)量達(dá)到103 g/L[33]。

5 戊二胺研究前景展望

市場(chǎng)上的完全生物基尼龍產(chǎn)品包括聚酰胺11、聚酰胺1010和聚酰胺46。其中聚酰胺11和聚酰胺1010來(lái)源于蓖麻油[68]，聚酰胺46由糖類(lèi)發(fā)酵得到的產(chǎn)物腐胺和己二酸聚隸屬于荷蘭DSM公司旗下Stanyl品牌[25]。市場(chǎng)上的部分生物基尼龍產(chǎn)品包括聚酰胺610、聚酰胺1012、聚酰胺410和聚酰胺10T，其他的生物基尼龍還處于研發(fā)階段[68]。2012年，日本味之素公司和東麗實(shí)業(yè)公司宣布合作開(kāi)發(fā)生物基尼龍?jiān)?,5-戊二胺。由于谷氨酸棒狀桿菌和大腸桿菌的遺傳背景清楚、生長(zhǎng)周期短，為戊二胺的合成研究及工業(yè)生產(chǎn)提供了有利依據(jù)。然而，無(wú)論是大腸桿菌還是谷氨酸棒狀桿菌，雖然中心代謝途徑的改造在一定程度上提高了戊二胺的產(chǎn)量，但戊二胺的合成量遠(yuǎn)達(dá)不到實(shí)際生產(chǎn)要求，還需要大量的基礎(chǔ)研究。賴氨酸脫羧酶是胞內(nèi)酶，戊二胺滯留在胞內(nèi)造成對(duì)賴氨酸脫羧酶的反饋抑制。已知的戊二胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白只有大腸桿菌中的賴氨酸-尸胺反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白CadB，能夠在谷氨酸棒狀桿菌中表達(dá)，但轉(zhuǎn)化效率還有待提高。而谷氨酸棒狀桿菌中cg2893編碼的滲透酶也可能具有轉(zhuǎn)運(yùn)戊二胺的功能，但是谷氨酸棒狀桿菌中不止這一種潛在的戊二胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，還可能存在未知的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。如果能找到所有的戊二胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，比較其利弊，篩選出表達(dá)量最高的蛋白，這對(duì)戊二胺的生產(chǎn)具有重大意義。然而，戊二胺的轉(zhuǎn)運(yùn)量增加了，胞外的戊二胺量會(huì)明顯增加，這會(huì)對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)造成影響。大腸桿菌在0.2 mol/L戊二胺存在時(shí)生長(zhǎng)率下降35%，在0.5 mol/L戊二胺存在時(shí)仍有菌體生存，但戊二胺濃度在0.3–0.5 mol/L時(shí)部分細(xì)胞已裂解。大腸桿菌對(duì)戊二胺的耐受性低于其對(duì)腐胺的耐受性[69]。谷氨酸棒狀桿菌在1 mol/L戊二胺濃度時(shí)仍能對(duì)數(shù)生長(zhǎng)，生長(zhǎng)率下降約67%[27]。因此，明確戊二胺抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的機(jī)制，提高谷氨酸棒狀桿菌和大腸桿菌對(duì)戊二胺的耐受性是亟需解決的問(wèn)題。

REFERENCES

[1] Tabor CW, Tabor H. Polyamines in microorganisms. Microbiol Rev, 1985, 49: 81–99.

[2] Brieger L. Weitere Untersuchungen über Ptomaine A. Berlin: Hirschwald, 1885.

目前已經(jīng)克隆的賴氨酸脫羧酶序列很多，盡管缺乏與它們的酶學(xué)性質(zhì)有關(guān)的報(bào)道，但從構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)來(lái)看，賴氨酸脫羧酶分屬于兩個(gè)大的類(lèi)群，其中來(lái)源于蜂房哈夫尼菌和大腸桿菌K12的賴氨酸脫羧酶屬于一個(gè)大的類(lèi)群，其余來(lái)源的賴氨酸脫羧酶來(lái)源于另一個(gè)大的類(lèi)群 (圖5)。

[4] Hirao T, Sato M, Shirahata A. Covalent link age of polyamines to peptidoglycan in Anaerovibrio lipolytica. Bacteriol, 2000, 182(4): 1154–1157.

[5] Kamio Y, Nakamura K. Putrescine and cadaverine are constituents of peptidoglycan in Veillonella alcalescens and Veillonella parvula. Bacteriol, 1987, 169(6): 2881–2884.

[6] Delavega AL, DelcourAH. Cadaverine induces closing of E. coli porins. EMBO, 1995, 14(23): 6058–6065.

[7] Igarashi K, Kashiwagi K. Modulation of cellular function by polyamines. Int J Biochem Cell Biol, 2010, 42(1): 39–51.

[8] Chattopadhyay MK, Tabor CW, Tabor H. Polyamines protect Escherichia coli cells from the toxic effect of oxygen. Proc Natl Acad Sci USA, 2003, 100(5): 2261–2265.

[9] Samartzidou H, Delour AH. Excretion of endogenous cadaverine leads to a decrease in porin-mediated outer membrane permeability. J Bacteriol, 1999, 18(3): 791–798.

[10] Tkachenko AG, Shumkov AV, Akhova AV. Adaptive functions of Escherichia coli polyamines in response to sublethal concentrations of antibiotics. Microbiol, 2009, 78(1): 25–32.

[11] Manuel J, Zhanel GG, Kievit T. Cadaverine suppresses persistence to carboxypenicillins in Pseudomonas aeruginosa PAO1. Antimicrob Agents Chemother, 2010, 54(12): 5173–5179.

[12] Chen XH, Yu J, Li LL. Advances in study on polyamines during flowering and fruit setting and development in higher plants. Chin Bull Bot, 2003, 20(1): 36–42 (in Chinese).陳學(xué)好, 于杰, 李伶利. 高等植物開(kāi)花結(jié)實(shí)的多胺研究進(jìn)展. 植物學(xué)通報(bào), 2003, 20(1): 36–42.

[13] Wang XY, Zou Q. Advances in study on polyamines during flowering and fruit setting and development in higher plants. Chin Bull Bot, 2002, 19(1): 11–20 (in Chinese).王曉云, 鄒琦. 多胺與植物衰老關(guān)系研究進(jìn)展. 植物學(xué)通報(bào), 2002, 19(1) : 11–20.

推薦理由:黨的十九大報(bào)告明確指出：“中國(guó)特色社會(huì)主義最本質(zhì)的特征是中國(guó)共產(chǎn)黨領(lǐng)導(dǎo)，中國(guó)特色社會(huì)主義制度的最大優(yōu)勢(shì)是中國(guó)共產(chǎn)黨領(lǐng)導(dǎo)，黨是最高政治領(lǐng)導(dǎo)力量?！钡环τ腥速|(zhì)疑中國(guó)共產(chǎn)黨的執(zhí)政地位。本書(shū)對(duì)這些懷疑進(jìn)行了概括，匯總為十個(gè)疑問(wèn)，以通俗易懂的語(yǔ)言、豐富生動(dòng)的事例，通過(guò)分析中國(guó)共產(chǎn)黨的歷史發(fā)展與當(dāng)代建設(shè)，以及在新時(shí)代的執(zhí)政理念與施政方略，給予有力的回答。

[14] Casalino M, Latella MC, Prosseda G, et al. Molecular evolution of the lysine decarboxylase defective phenotype in Shigellasonnei. Int J Med Microbiol, 2005, 294: 503–512.

[15] Kiyohiko N, Shuichi E, Yukiko M. Enzymatic method for producing cadaverine dicarboxylate and its use for the production of nylon: Japan, 147688. 2003-05-26.

[16] Deng RS, Wei YF, Chen BN. Polyamide Resin and Its Application. Beijing: Chemical Industry Press, 2002: 124–130 (in Chinese).鄧如生, 魏運(yùn)房, 陳步寧. 聚酰胺樹(shù)脂及其應(yīng)用.北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2002: 124–130.

[22] Ogunniyi DS. Castor oil: a vital industrial raw material. Bioresource Technol, 2006, 97(9): 1086–1091.

Volkert等通過(guò)對(duì)代謝途徑進(jìn)行改造，構(gòu)建了能利用葡萄糖發(fā)酵生產(chǎn)戊二胺谷氨酸棒狀桿菌工程菌DAP，戊二胺產(chǎn)量達(dá)到72 g/L，并從發(fā)酵液中分離純化戊二胺，純度達(dá)到99%以上[66]。

[19] Okino S, Noburyu R, Suda M, et al. An efficient succinic acid production process in a metabolically engineered Corynebacterium glutamicum strain. Appl Microbiol Biot, 2008, 81(3): 459–464.

水利工程管理工作中可能會(huì)遇到很多問(wèn)題，如果這些問(wèn)題發(fā)生了，那么我們能做的就是大膽變通，在原來(lái)的管理方法基礎(chǔ)上進(jìn)行創(chuàng)新，創(chuàng)建起和諧的管理模式，不斷適應(yīng)當(dāng)前的市場(chǎng)經(jīng)濟(jì)需求。與此同時(shí)，為了更好的提升管理水平，提高競(jìng)爭(zhēng)力，水利單位應(yīng)形成自己獨(dú)有的單位文化，建立屬于自己的管理隊(duì)伍，充分發(fā)揮出職工們的工作熱情，從整體上提升管理水平。

[20] Oh IJ, Kim DH, Oh EK, et al. Optimization and scale-up of succinic acid production by Mannheimia succiniciproducens LPK7. J Microbiol Biotechnol, 2009, 19(2): 167–171.

[21] Stellmacher R, Hangebrauk J, Wittmann C, et al. Fermentative manufacture of succinic acid with Basfia succiniciproducens DD1 in serum flasks. Chem Lett, 2010, 82(8): 1223–1229.

[17] Lin SS, Weng HS. Liquid-phase oxidation of cyclohexane over CoAPO-5: synergism effect of coreactant and solvent effect. Appl Catal A-Gen, 1994, 118(1): 21–31.

[23] Jiang LL, Wu XY, Liu Y, et al. Fermentation and properties of lysine decarboxylase. Fine Chem, 2006, 23(11): 1060–1067 (in Chinese).蔣麗麗, 吳曉燕, 劉毅, 等. 賴氨酸脫羧酶發(fā)酵工藝及酶學(xué)性質(zhì). 精細(xì)化工, 2006, 23(11): 1060–1067.

[24] Velasco AM, Leguina JI, Lazcano A. Molecular evolution of the lysine biosynthetic pathways. Mol Evol , 2002, 55: 445–459.

[25] Schneider J, Wendisch VF. Biotechnological production of polyamines by Bacteria: recent achievements and future perspectives. Appl Microbiol Biotechnol, 2011, 91: 17–30.

[26] Mimitsuka T, Sawai H, Hatsu M, et al. Metabolic engineering of Corynebacterium glutamicum for cadaverine fermentation. Biosci Biotechnol Biochem. 2007, 71(9): 2130–2135.

夾嘴夾持導(dǎo)線提供摩擦力時(shí)要求夾持穩(wěn)定性能可靠，同時(shí)還要保證導(dǎo)線不受損傷，因此卡線器夾嘴不應(yīng)過(guò)短。但是，夾嘴過(guò)長(zhǎng)容易導(dǎo)致卡線器整體尺寸、質(zhì)量過(guò)大，造成搬運(yùn)和移動(dòng)不便。導(dǎo)線的夾緊狀態(tài)如圖3所示。

[27] Katinka M, Cossart P, Sibilli L, et al. Nucleotide sequence of the thrA gene of Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci USA, 1980, 77(10): 5730–5733.

[28] Zakin MM, Duchange N, Ferrara P, et al. Nucleotide sequence of the metL gene of Escherichia coli. Its product, the bifunctional aspartokinase ii-homoserine dehydrogenase II, and the bifunctional product of the thrA gene, aspartokinase I-homoserine dehydrogenase I, derive from a common ancestor. J Biol Chem, 1983, 258(5): 3028–3031.

[29] Cassan M, Parsot C, Cohen GN, et al. Nucleotide sequence of lysC gene encoding the lysine-sensitive aspartokinase III of Escherichia coli K12. Evolutionary pathway leading to three isofunctional enzymes. J Biol Chem, 1986, 261(3): 1052–1057.

[30] Park JH, Lee KH, Kim TY, et al. Metabolic engineering of Escherichia coli for the production of L-valine based on transcriptome analysis and in silico gene knockout simulation. Proc Natl Acad Sci USA, 2007, 104(19): 7797–7802.

[31] Soksawatmaekhin W, Kuraishi A, Sakata K, et al. Excretion and uptake of cadaverine by CadB and its physiological functions in Escherichia coli. Mol Microbiol, 2004, 51 (5): 1401–1412.

[32] Qian Z, Xia X, Lee SY. Metabolic engineering of Escherichia coli for the production of cadaverine: a five carbon diamine. Biotechnol Bioeng, 2011, 108: 93–103.

青皮藥材的HPLC指紋圖譜建立及聚類(lèi)分析和主成分分析…………………………………………………… 靳貝貝等（24）：3336

[33] Buschke N, Becker J, Sch?fer R, et al. Systems metabolic engineering of xylose-utilizing Corynebacterium glutamicum for production of 1,5-diaminopentane. Biotechnol J, 2013, 8: 557–570.

[34] Meng SY, Bennett GN. Nucleotide sequence of the Escherichia coli cad operon: a system for neutralization of low extracellular pH. J Bacteriol, 1992, 174(8): 2659–2669.

[35] Watson N, Dunyak DS, Rosey EL, et al. Identification of elements involved in transcriptional regulation of the Escherichia coli cad operon by external pH. J Bacteriol, 1992, 174(2): 530–540.

[36] Yamamoto Y, Miwa Y, Miyoshi K, et al. The Escherichia coli ldcC gene encodes another lysine decarboxylase, probably a constitutive enzyme. Genes Genet Syst, 1997, 72 (3): 167–172.

[37] Lemonnier M, Lane D. Expression of the second lysine decarboxylase gene of Escherichia coli. Microbiol, 1998, 144(3): 751–760.

1.搭建學(xué)習(xí)新平臺(tái)，增強(qiáng)學(xué)習(xí)趣味性。公司打破傳統(tǒng)的集中學(xué)習(xí)模式，充分利用寶勝文化雜志、網(wǎng)站、辦公OA系統(tǒng)等媒介，建立黨員微信群、黨建工作交流群，實(shí)現(xiàn)黨員全覆蓋的溝通、交流和學(xué)習(xí)。公司OA辦公系統(tǒng)開(kāi)設(shè)“黨建在線”、“黨務(wù)公開(kāi)”、“兩學(xué)一做”等專(zhuān)欄，將黨的最新理論、中航最新要求、黨員發(fā)展等內(nèi)容及時(shí)傳達(dá)，讓新思想新動(dòng)態(tài)在指尖滑動(dòng)中深入腦海。

[38] Fritz G, Koller C, Burdack K, et al. Induction kinetics of a conditional pH stress response system in Escherichia coli. J Mol Biol, 2009, 393(2): 272–286.

[39] Neely MN, Olson ER. Kinetics of expression of the Escherichia coli cad operon as a function of pH andlysine. J Bacteriol, 1996, 178(18): 5522–5528.

[40] Sabo DL, Boeker EA, Byers B. Purification and physical properties of inducible Escherichia coli lysine decarboxylase. Biochem, 1974, 13(4): 662–670.

[41] Stefan V, Harald H, Andreas K, et al. Process for production of cadaverine by fermentation: German, 2008100053323. 2008-02-01.

從企業(yè)管理的激勵(lì)實(shí)踐上看，一些企業(yè)在處理物質(zhì)和精神的關(guān)系問(wèn)題上確實(shí)存在二者失衡的現(xiàn)象。有的企業(yè)義利失衡、金錢(qián)崇拜、誠(chéng)信迷失、潛規(guī)則盛行；有的企業(yè)員工精神生活沉淪，沒(méi)有工作熱情，對(duì)工作、對(duì)環(huán)境采用冷漠、忽視的態(tài)度；有的企業(yè)業(yè)余生活單調(diào)、人際交流貧乏；有的企業(yè)“拿著令箭當(dāng)雞毛，在執(zhí)行上級(jí)指示的時(shí)候打折扣、搞變通”，“內(nèi)心浮躁，自卑自棄”；有的單位只講規(guī)則、不講感情，干群關(guān)系冷漠，團(tuán)隊(duì)凝聚力缺失……如此等等，腐蝕著企業(yè)應(yīng)有的敬業(yè)、奉獻(xiàn)、拼搏以及創(chuàng)新等良好精神風(fēng)貌。

[42] Fecker LF, Beier H, Berlin J. Cloning and characterization a lysine decarboxylase gene form Hafnia alvei．Mol Gen Genet, 1986, 203: 177–184.

[43] Lu MH, Li XM, Chen JF, et al. Study on chilling tolerance of cucumber during germination and expression of lysine decarboxylase gene. Sci Agri Sin, 2005, 38(12): 2492–2495 (in Chinese).逯明輝, 李曉明, 陳勁楓, 等．黃瓜發(fā)芽期耐冷性與賴氨酸脫羧酶基因表達(dá). 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2005, 38(12): 2492–2495.

[44] Sakazaki R. The genus Hafnia//Starr MP, Stolp H, Trfiper HG, et al eds. The Prokaryotes. New York: Springer, Berlin Heidelberg, 1981: 1181–1186.

[45] Jiang LL, Liu JZ, Shen YL, et al. Producing cadaverine by cell immobilization of lysine decarboxylase. Fine Chem, 2007, 24(11): 1080–1084 (in Chinese).蔣麗麗, 劉均忠, 沈俞, 等. 用固定化L-賴氨酸脫羧酶細(xì)胞制備1,5-戊二胺. 精細(xì)化工, 2007, 24(11): 1080–1084.

[46] Takatsuka Y, Yamaguchi Y, Ono M, et al. Gene cloning and molecular characterization of lysine decarboxylase from Selenomonas ruminantium delineate its evolutionary relationship to ornithine decarboxylases from eukaryotes. J Bacteriol, 2000, 6732–6741.

2.1 賴氨酸脫羧酶

[48] Kashiwagi K, Shibuya S, Tomitori H, et al. Excretion and uptake of putrescine by the PotE protein in Escherichia coli. Biol Chem, 1997, 272: 6318–6323.

[49] Kashiwagi K, Kuraishi A, Tomitori H, et al. Identification of the putrescine recognition site on polyamine transport protein PotE. Biol Chem, 2000, 275: 36007–36012.

[50] Qian ZG, Xia XX, Lee SY, et al. Metabolic engineering of Escherichia coli for the production of putrescine: a four carbon diamine. Biotechnol Bioeng, 2009, 104(4): 651–662.

[51] Gong S, Richard H, Foster JW. YjdE (AdiC) is the arginine: agmatine antiporter essential for arginine-dependent acid resistance in Escherichia coli. Bacteriol, 2003, 185: 4402–4409.

[52] Iyer R, Williams C, Miller C. Arginine-agmatine antiporter in extreme acid resistance in Escherichia coli. Bacteriol, 2003, 185: 6556–6561.

[53] Jack DL, Paulsen IT, Saier MH. The amino acid/polyamine/organocation (APC) superfamily of transporters specific for amino acids, polyamines and organocations. Microbiol, 2000, 146: 1797–1814.

[54] Soksawatmaekhin W, Uemura T, Fukiwake N, et al. Identification of the cadaverine recognition site on the cadaverine-lysine antiporter cadB. J Biol Chem, 2006. 281(39): 29213–29220.

[55] Tomitori H, Kashiwagi K, Igarash K. Structure and function of polyamine-amino acid antiporters CadB and PotE in Escherichia coli. Amino Acids, 2012, 42: 733–740.

[56] Kind S, Kreye S, Wittmann C. Metabolic engineering of cellular transport for overproduction of the platform chemical 1,5-diaminopentane in Corynebacterium glutamicum. Metab Eng, 2011, 13: 617–627.

[57] Kind S, Wittman C. Bio-based production of the platform chemical 1,5-diaminopentane. Appl Microbiol Biotechnol, 2011, 91: 1287–1296.

[58] Melzer G, Esfandabadi ME, Franco LE, et al. Flux design: in silico design of cell factories based on correlation of pathway fluxes to desired properties. BMC Syst Biol, 2009, 3: 120.

[59] Nishi K, Endo S, Mori Y, et al. Method for producing cadaverine dicarboxylate: US 7189543 B2. 2007-3-13.

[60] Tateno T, Okada Y, Tsuchidate T, et al. Direct production of cadaverine from soluble starch usingCorynebacterium glutamicum coexpressing alpha-amylase and lysine decarboxylase. Appl Microbiol Biotechnol, 2009, 82: 115–121.

[61] Niu T, Li M, Zhang JH, et al. Construction of recombinant Corynebacterium glutamicum producing 1,5-pentanediamine by one step method. China Biotechnol, 2010, 30(8): 93–99 (in Chinese).牛濤, 黎明, 張俊環(huán), 等. 一步法生產(chǎn)1,5-戊二胺谷氨酸棒桿菌基因工程菌的構(gòu)建. 中國(guó)生物工程雜志, 2010, 30(8): 93–99．

[62] Park JH, Lee SY. Towards systems metabolic engineering of microorganisms for amino acid production. Curr Opin Biotechnol, 2008, 19: 454–460.

[63] Kind S, Jeong WK, Schr?der H, et al. Systems-wide metabolic pathway engineering in Corynebacterium glutamicum for bio-based production of diaminopentane. Metab Eng, 2010, 12(4): 341–351.

[64] Kind S, Jeong WK, Schr?der H, et al. Identification and elimination of the competing N-acetyldiaminopentane pathway for improved production of diaminopentane by Corynebacterium glutamicum. Appl Environ Microbiol, 2010b, 76(15): 5175–5180.

[65] Huang YY, Li M, Liu M, et al. Construction and transformation of Corynebacterium glutamicum expression vector of cadaverine-lysine antiporter cadB gene. Biotechnol Bull, 2012(8): 94–100 (in Chinese).黃云雁, 黎明, 劉萌, 等. 賴氨酸-尸胺反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白cadB基因谷氨酸棒桿菌表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化.生物技術(shù)通報(bào), 2012(8): 94–100.

[66] Volkert M, Zelder O, Ernst B, et al. Method for fermentively producing 1,5-diaminopentane: US, 20100292429, 2010-11-18.

[67] Buschke N，Schroder H，Wittmann C. Metabolic engineering of Corynebacterium glutamicum for production of 1,5-diaminopentane from hemicelluloses. Biotechnol J, 2011, 6: 306–317.

[68] Ji D, Fang Z, Ouyang PK, et al. Progress in bio-based polyamides. Chin J Biopro Eng, 2011, 6: 306–317 (in Chinese).季棟, 方正, 歐陽(yáng)平凱, 等. 生物基聚酰胺研究進(jìn)展. 生物加工過(guò)程, 2013, 11(2): 73–80.

[69] Limsuwun K, Jones PG. Spermidine acetyltransferase is required to prevent spermidine toxicity at low temperatures in Escherichia coli. Bacteriol, 2000, 182(19): 5373–5380.

(本文責(zé)編 郝麗芳)

Progress in biosythesis of diaminopentane

Dongxia Li, Ming Li, Hongxin Wang, Shuya Wang, and Fuping Lu
Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology, Ministry of Education, National Engineering Laboratory for Industrial Enzymes, Tianjin Key Laboratory of Industrial Microbiology, College of Biotechnology, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China

Air pollution and global warming are increasingly deteriorating. Large amounts of polyamides derived from fossil fuel sources are consumed around the world. Cadaverine is an important building monomer block of bio-based polyamides, thus biotechnological processes for these polymers possess enormous ecological and economical potential. Currently, the engineered strains for biological production of cadaverine are Corynebacterium glutamicum and Escherichia coli. We review here the latest research progress of biosynthesis of cadaverine including metabolism of cadaverine in microorganisms, key enzymes and transport proteins in cadaverine synthesis pathway, optimum pathways and cadaverine yields.

cadaverine, Corynebacterium glutamicum, Escherichia coli, lysine decarboxylase (LDC), cadaverine-lysine antiporter (CadB)

May 18, 2013; Accepted: August 20, 2013

Ming Li. Tel: +86-22-60601958; Fax: +86-22-60602298; E-mail: liming09@tust.edu.cn

李東霞, 黎明, 王洪鑫, 等. 生物法合成戊二胺研究進(jìn)展. 生物工程學(xué)報(bào), 2014, 30(2): 161-174.

Li DX, Li M, Wang HX, et al. Progress in biosythesis of diaminopentane. Chin J Biotech, 2014, 30(2): 161-174.

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 21176190), Key Technology Research and Development Program of Tianjin, China (No. 11ZCKFSY00900), Tianjin Research Program of Application Foundation and Advanced Technology (No. 11JCYBJC09600), Changjiang Scholars and Innovative Research Team (No. IRT1166).

國(guó)家自然科學(xué)基金(No. 21176910), 天津市科技支撐計(jì)劃 (No. 11ZCKFSY00900), 天津市應(yīng)用基礎(chǔ)及前沿技術(shù)研究計(jì)劃(No. 11JCYBJC 09600), 長(zhǎng)江學(xué)者與創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(No. IRT1166) 資助。