用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用比較牛耳草代謝物的提取方法

張曉飛，段禮新，龔月樺，鄧馨

1 西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西 楊凌 712100 2 宜賓學(xué)院 生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，四川 宜賓 644000 3 中國科學(xué)院植物研究所 資源植物研發(fā)重點實驗室 植物分子生理學(xué)重點實驗室，北京 100093

復(fù)蘇植物是植物界一個特殊的類群，能夠忍受極度脫水，以類似休眠的方式度過干旱期，在水分適宜時又迅速恢復(fù)生活狀態(tài)，繼續(xù)其生活史，在這個過程中表現(xiàn)出形態(tài)結(jié)構(gòu)上的可見變化[1-4]。最早對復(fù)蘇植物研究的文獻記錄可以追溯到1919年，Dinter研究發(fā)現(xiàn)密羅木科植物密羅木Myrothamnus flabellifolius的失水葉片可以在有水的情況下恢復(fù)正常的生理狀態(tài)[5]。雖然人們很早就注意到了復(fù)蘇現(xiàn)象，但是對復(fù)蘇植物耐脫水機制的研究則是最近幾十年才迅速展開的。隨著研究技術(shù)的進步和儀器的改進，對復(fù)蘇植物的研究已經(jīng)從最初的對其生態(tài)適應(yīng)的解釋[6-9]到對其生理生化特別是抗氧化酶系統(tǒng)[10-11]、光合[12-13]、呼吸等方面的研究及至到現(xiàn)在運用分子生物學(xué)手段和方法從分子水平上研究其耐脫水機制[14-16]。

牛耳草Boea hygrometrica(Bunge) R. Br.是苦苣苔科，旋蒴苣苔屬的一種復(fù)蘇植物，主要分布在干旱頻繁發(fā)生的石灰質(zhì)巖石上，具有極端耐旱的特性，可以在失去90%–95%水分的“超干狀態(tài)”存活數(shù)年，是研究植物耐脫水機制的良好材料[17-18]。目前，已有研究從細胞水平[19]、蛋白水平[17]和基因水平[20-23]研究揭示了牛耳草抗旱的一些分子機制，但是對其內(nèi)源代謝物在抗旱中的變化和作用尚未有系統(tǒng)性的研究。由于復(fù)蘇植物次生代謝產(chǎn)物異常豐富，而傳統(tǒng)的提取方法只是針對某一類物質(zhì)有較好的提取效果[24-26]，無法全面反映所有代謝物的情況。為了解決以上問題，文中采用代謝組學(xué)方法對牛耳草的代謝物進行測定，系統(tǒng)地鑒定和分析小分子代謝物的變化，為揭示牛耳草耐旱復(fù)蘇機制、篩選關(guān)鍵代謝物質(zhì)提供重要信息。但目前的代謝物提取方法往往是針對新鮮植物樣品設(shè)計，而對脫水材料、尤其是脫水達到 95%以上的復(fù)蘇植物葉片的提取效率未知。因此摸索一種能夠?qū)ε６荨案伞?、“鮮”兩種狀態(tài)植物都有較高效率的提取技術(shù)是研究牛耳草脫水復(fù)蘇機制的代謝組學(xué)分析的前提。我們針對這個問題，對牛耳草代謝物提取方法進行比較和優(yōu)化，為后續(xù)研究提供有效的技術(shù)和方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器：Agilent 6890氣相色譜儀 (美國Agilent 公司)，LECO Pegasus IV 氣相-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀 (美國Leco公司)，Sigma 3-18K高速冷凍離心機 (美國 Sigma公司)，超低溫冰箱，TTL-DC型多功能氮吹儀 (北京)，F(xiàn)D-1T冷凍干燥機 (北京)，MS-100恒溫混勻儀 (浙江)，QL-901旋渦混合器 (江蘇)，色譜注射器(上海)。

試劑：甲醇 (色譜純，美國 Fisher公司)，氯仿 (色譜純，美國Mreda公司)，水 (色譜純，美國Fisher公司)，核糖醇 (美國Sigma公司)，無水吡啶 (色譜純，北京)，N-甲基-N-三甲基硅烷基三氟乙酰胺 (MSTFA，美國Sigma公司)，甲氧氨基鹽酸鹽 (美國Sigma公司)。

1.2 植物材料

牛耳草種子采自北京植物園櫻桃溝，4 ℃春化2 d后播種在培養(yǎng)盤中，于培養(yǎng)室中土培，溫度為 (25±2) ℃，光周期為 16 h/8 h (晝/夜)，正常供水。選取3–4月齡的植株用于實驗，即“鮮”植物。將“鮮”植物置于相對濕度30%–50%、25 ℃條件下干旱48 h后達到脫水狀態(tài) (葉片相對含水率<10%，用于實驗，即“干”植物[17](以下未特別注明的提取對象均為鮮樣)。

1.3 樣品的采集和提取方法

樣品采集：選取 4–6棵生長狀況良好的牛耳草植株，將其葉片混合，置于研缽中，用液氮充分研磨至粉末，之后置于冷凍干燥儀中冷凍干燥24 h。

樣品提取方法：分為A法和B法。

A法：提取過程參照Lisec等[27]和Weckwerth等[28]的方法，稍作改動。具體如下：稱取干燥的樣品20 mg，放入2 mL的離心管中，加入1.5 mL預(yù)冷 (?20 ℃) 的甲醇溶液，再加入 10 μL 濃度為5 mg/L的核糖醇作為內(nèi)標，渦旋混勻。37 ℃振蕩反應(yīng)提取 2 h，之后放入冷凍離心機中，12 000×g離心10 min。取上清1 mL轉(zhuǎn)移至另一個新的2 mL離心管中，加入400 μL氯仿、400 μL水，渦旋混勻，使極性相和非極性相充分溶于水和氯仿中。12 000×g離心5min，取上清200 μL (極性相) 放入1.5 mL的尖底色譜進樣瓶中，低溫氮氣流吹干，加入 50 μL濃度為20 mg/mL 肟化試劑甲氧氨基鹽酸鹽，37 ℃、200 r/min振蕩反應(yīng)2 h。之后加入80 μL硅烷化試劑MSTFA，37 ℃、200 r/min振蕩反應(yīng)0.5 h，上樣進行GC-MS分析。每個處理設(shè)3個重復(fù)。

B法：將 A法中的甲醇溶液用甲醇-氯仿-水溶液 (甲醇：氯仿：水體積比為5 2 2) 替換，其他操作同A法。每個處理設(shè)6個重復(fù)。

1.4 色譜質(zhì)譜條件

VF-5MS 型色譜柱 (30 m×250 μm ×0.25 μm)；進樣口溫度280 ℃；分流比4 1；進樣量1 μL；載氣：氦氣；溶劑延遲5 min；載氣流速：1 mL/min，色譜柱初始溫度80 ℃，保持2 min，以8 /min℃升至300 ℃，保持13 min。傳輸線溫度280 ℃，EI離子源：溫度，210 ℃，電子能量，70 eV；全掃描模式，掃描范圍m/z： 70–650。

1.5 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計檢驗

VF-5MS 型色譜柱 (30 m×250 μm ×0.25 μm)；進樣口溫度280 ℃；分流比4∶1；進樣量1 μL；載氣：氦氣；溶劑延遲5 min；載氣流速：1 mL/min，色譜柱初始溫度80 ℃，保持2 min，以8 ℃/min升至300 ℃，保持13 min。傳輸線溫度280 ℃，EI 離子源：溫度，210 ℃，電子能量，70 eV；全掃描模式，掃描范圍m/z: 70–650。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種提取方法的PLS-DA分析

將牛耳草代謝物GC-MS數(shù)據(jù)經(jīng)過預(yù)處理后導(dǎo)入SIMCA-P軟件進行PLS-DA分析，得到兩種方法的 scatter plot圖 (圖 1)。從圖上可以看出，同一方法的重復(fù)數(shù)據(jù)點都集中在一起，說明在實驗操作、儀器穩(wěn)定性等方面都是可靠的，數(shù)據(jù)的質(zhì)量是良好的，可以用于后續(xù)分析。而兩種提取方法的數(shù)據(jù)點在空間上可以得到明顯區(qū)分，分布差異表明兩種方法提取的代謝物在種類、數(shù)量和濃度等方面均存在差異。

圖1 A法 (▲1) 和B (▲2) 法提取牛耳草代謝物的PLS-DA分析散點圖Fig. 1 Scatter plot of the method A (▲1) and method B (▲2) by PLS-DA.

2.2 兩種提取方法提取效果的比較

為了更直觀地比較這兩種方法的提取效果，把兩者的總離子色譜圖疊加在一起進行分析 (圖 2)。由圖可知，兩種提取方法的提取效果存在明顯區(qū)別，就 B法而言，其色譜峰的數(shù)目明顯多于A法，且色譜信號強度也優(yōu)于A法。對兩種方法檢測到的色譜峰數(shù)目進行數(shù)學(xué)統(tǒng)計(圖3)，結(jié)果顯示，兩種方法提取的色譜峰的數(shù)目差異顯著 (P<0.05)。對干樣的提取效果進行分析， A法提取的干樣色譜峰總數(shù)只有155個，明顯低于鮮樣 (數(shù)據(jù)未顯示)，表明此方法不適于干樣樣品提取。

2.3 兩種提取方法提取效率的比較

圖2 兩種方法的總離子色譜圖Fig. 2 Stack of total ion current chromatograms of the method A and B.

圖3 兩種方法提取的色譜峰數(shù)目Fig. 3 Total peak numbers of extract by method A and B.

由于代謝組學(xué)的檢測對象主要是生物樣品中小分子量的代謝物，如氨基酸、糖類、有機酸和脂肪酸類[30]等，因此文中從所有代謝物中選取了9種共有峰變量，包括3種有機酸、3種氨基酸及3種糖類，以代謝物和內(nèi)標核糖醇的峰面積比來表示代謝物的相對含量，以 B法和 A法相對含量的比值衡量兩種提取方法的優(yōu)劣。采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行t檢驗 (表1)，結(jié)果顯示，多數(shù)代謝物的提取率B法均高于A法，僅蜜二糖例外；且除蘇氨酸外，其余7種代謝物的提取效率A法和B法的差異程度均達到了顯著水平。

2.4 方法穩(wěn)定性比較

植物代謝物的成分非常復(fù)雜，色譜峰數(shù)量眾多，如何對色譜峰進行鑒定就顯得尤為重要。鑒于色譜峰保留時間的穩(wěn)定性對色譜峰的匹配很重要，我們根據(jù)總檢測時間的長度隨機挑選了10個色譜峰，對兩種方法中色譜峰保留時間的穩(wěn)定性進行了比較分析，同時對這10個色譜峰的相對峰面積，即提取效率的穩(wěn)定性也進行了考察 (表2)。結(jié)果顯示，兩種方法的10個色譜峰保留時間的相對標準偏差RSD值均小于1%，表明兩種方法提取的代謝物保留時間穩(wěn)定性良好。提取效率穩(wěn)定性結(jié)果顯示，A法中，RSD≤5%的僅有1個，比例為10%，5%＜RSD≤10%的5個，比例為50%，RSD≥10%的4個，比例為40%，而B法中分別為40%、60%和0。由此可知，在提取效率的穩(wěn)定性方面，B法遠遠優(yōu)于A法。

通過以上各項指標的比較分析可知，B方法更適合于牛耳草葉片代謝物的提取分析。

表1 兩種提取方法的提取效率Table 1 Extract efficiencies of method A and B

表2 色譜峰保留時間穩(wěn)定性及提取效率穩(wěn)定性考察Table 2 Peak stability of retention time and extract efficiency

2.5 干鮮植物樣品提取效果的比較

前期結(jié)果顯示，A法提取的干樣色譜峰總數(shù)只有155個，明顯低于鮮樣，所以我們重點比較了 B法對“干”、“鮮”兩種狀態(tài)下的樣品的提取效果。將鮮樣 (CK) 和干樣 (D48 h) 的色譜圖疊加在一起分析 (圖4)，由圖可知，除差異峰以外 (兩種狀態(tài)的差異代謝物)，絕大部分色譜峰在兩種狀態(tài)的樣品中都可以檢測得到，而且在保留時間上基本吻合。這說明 B方法同樣也適用于牛耳草干樣代謝物的提取，不會造成大量代謝物的“丟失”。對兩種狀態(tài)的樣品提取的色譜峰數(shù)目進行統(tǒng)計 (圖5)，兩者均達到300個以上，沒有顯著差異。對干樣的色譜峰保留時間和提取效率的穩(wěn)定性進行分析 (表3)，保留時間的RSD值均小于1%，提取效率的RSD值在5%左右，穩(wěn)定性良好 (10個色譜峰與表2中的相對應(yīng))。

2.6 干鮮植物樣品代謝物變化的比較

前期結(jié)果顯示，鮮樣中檢測到308.17個峰，干樣中檢測到317個峰，而把鮮樣和干樣總離子色譜圖疊加進行分析則共檢測到580個峰。這說明兩者間特異的色譜峰數(shù)目眾多，即存在數(shù)量眾多的差異物質(zhì)。580個色譜峰中，2個處理都檢測到的 265個，Match≥750的99個，其中有15個有機酸峰，51個糖類峰，13個氨基酸峰，這3大類物質(zhì)占了所檢測到的物質(zhì)種類的絕大部分，與代謝組所能檢測到的物質(zhì)對象是相吻合的。進一步分析，鮮樣中特有的代謝物質(zhì)峰為106個，Match≥750的14個，5個有機酸峰，4個糖類峰，1個氨基酸峰。干樣中特有的代謝物質(zhì)峰為 89個，Match≥750的17個，12個糖類峰，1個有機酸峰，2個氨基酸峰。干樣中糖類物質(zhì)不僅在種類上遠大于鮮樣，而且總含量也較鮮樣明顯上升。牛耳草在脫水過程中糖類物質(zhì)明顯增多，這可能與糖類作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來抵御干旱脅迫有關(guān)。而脫水過程中其他物質(zhì)的具體變化與脫水的關(guān)系及牛耳草作為復(fù)蘇植物特異的代謝物變化還有待進一步分析。

圖4 B法提取牛耳草鮮樣 (CK) 和干樣 (D48 h) 的總離子色譜圖Fig. 4 Stack of total ion current chromatograms of the extracts from fresh (CK) and dehydrated (D48 h) materials of B.hygrometrica using method B.

圖5 B法提取牛耳草鮮樣 (CK) 和干樣 (D48 h) 的色譜峰數(shù)目Fig. 5 Total peak numbers of the extracts from fresh (CK)and dehydrated (D48 h) materials of B. hygrometrica using Method B.

3 討論

復(fù)蘇植物在自然界廣泛存在，其種類幾乎覆蓋了所有的植物生命形式 (裸子植物除外)[4]。以往的研究主要集中在分子水平上，本研究旨在通過應(yīng)用代謝組學(xué)方法測定牛耳草脫水前后代謝物種類及含量的變化，對牛耳草的代謝物進行比較全面的檢測及研究，從中找出對牛耳草耐脫水機制有重要影響的關(guān)鍵代謝物，為進一步探明復(fù)蘇植物的抗旱復(fù)蘇機制提供理論依據(jù)。在全球干旱缺水的背景下，能為尋找強效抗旱基因資源和小分子抗旱調(diào)節(jié)劑以及作物抗旱育種提供基礎(chǔ)。

表3 B法提取牛耳草干樣的色譜峰保留時間穩(wěn)定性及提取效率穩(wěn)定性Table 3 Peak stability of retention time and extract efficiency of the extracts from dehydrated materials of B. hygrometrica using Method B

一種良好的代謝物提取方法是代謝組學(xué)研究的基礎(chǔ)，既要求能提出盡可能多的代謝物，還要求檢測方法的穩(wěn)定性良好。本研究用兩種方法對牛耳草葉片代謝物進行提取，以GC-MS為代謝物分析方法，對提取效果進行了比較，發(fā)現(xiàn)甲醇-氯仿-水法提取物在色譜峰數(shù)目及信號強度方面均優(yōu)于甲醇法；在提取效率方面，為了盡可能全面反映整體情況，選擇了氨基酸、糖類及小分子有機酸這 3類可以代表代謝組學(xué)檢測對象的物質(zhì)進行分析；在考察方法學(xué)穩(wěn)定性方面，則依據(jù)檢測時間的總長度均勻隨機進行選擇，因此能夠更好地反映整體情況。結(jié)果顯示，甲醇-氯仿-水法在各方面都優(yōu)于甲醇法，而且對干樣的提取效果也達到相似水平，表明該方法適用于不同含水量的植物樣品的代謝物提取及后續(xù)分析。在此基礎(chǔ)上，對牛耳草干鮮樣品代謝物的初步統(tǒng)計分析結(jié)果顯示鮮樣和干樣的差異色譜峰數(shù)目有300多個，說明牛耳草在脫水前后體內(nèi)生理生化活動發(fā)生了明顯的改變，而這些改變可能與牛耳草耐脫水機制有密切的關(guān)系。

以往對牛耳草小分子代謝物的研究僅鑒定了少數(shù)物質(zhì)，如蔡祥海等[24]用醋酸乙酯對牛耳草進行提取，得到了7個甾體類和 1個三萜類化合物，鄭曉珂等[26]利用 Diaion HP-20、Sephadex LH-20、Toyopearl HW-40、硅膠柱等柱色譜技術(shù)對牛耳草成分進行分離純化，得到了 5種糖醇類物質(zhì)，而本研究則檢測到了 200余種物質(zhì)，遠高于其他方法。而鮮樣和干樣中代謝物的具體變化及這些變化與牛耳草脫水前后生理生化活動變化及其耐脫水復(fù)蘇機制的關(guān)系還有待進一步研究。

致 謝：本研究得到中科院植物所分子生理重點實驗室漆曉泉研究員和薛震工程師的指導(dǎo)，解麗霞和孟獻斌等同學(xué)參與部分數(shù)據(jù)分析，在此一并致謝！

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