自噬相關(guān)蛋白在肺鱗癌和腺癌組織中的表達(dá)及相關(guān)性研究*

郭 凱 黃 波 王曉東

自噬相關(guān)蛋白在肺鱗癌和腺癌組織中的表達(dá)及相關(guān)性研究*

郭 凱 黃 波 王曉東△

目的 探討肺鱗癌和腺癌中自噬相關(guān)蛋白Beclin1、自噬相關(guān)蛋白1（Atg1）、雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的表達(dá)情況及其相關(guān)性分析。方法采用免疫組織化學(xué)Envision二步法，檢測(cè)82例肺癌（鱗癌和腺癌）組織及17例癌旁正常肺組織中Beclin1、Atg1、mTOR的表達(dá)情況，并分析其表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果肺癌組織中Beclin1的陽(yáng)性表達(dá)率低于正常組（52.44%vs 94.12%，P＜0.01），在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、不同分化程度情況的肺癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且隨腫瘤惡變和侵襲程度的增強(qiáng)呈遞減趨勢(shì)。肺癌組與正常組Atg1陽(yáng)性表達(dá)率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（64.71%vs 46.34%），但在腫塊較大肺癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率低于腫塊較小者（P＜0.01）。肺癌組mTOR陽(yáng)性表達(dá)率高于正常組（53.66%vs 5.88%，P＜0.01），有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌組織中mTOR陽(yáng)性表達(dá)率高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者（P＜0.01）。相關(guān)性分析顯示，鱗癌中Beclin1與Atg1表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.609），Beclin1、Atg1分別與mTOR呈負(fù)相關(guān)（r分別為-0.617、-0.444）；肺腺癌中，Beclin1與Atg1表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.458），Beclin1、Atg1分別與mTOR呈負(fù)相關(guān)（r分別為-0.497，-0.541），均P＜0.01。結(jié)論Beclin1、Atg1、mTOR在肺鱗癌和腺癌組織中的表達(dá)呈現(xiàn)較好的相關(guān)性，提示肺鱗癌和腺癌的臨床病理學(xué)變化與自噬有關(guān)。

肺腫瘤；癌,鱗狀細(xì)胞；腺癌；自噬；Beclin1；自噬相關(guān)蛋白1；雷帕霉素靶蛋白

肺鱗癌起源于支氣管上皮，約占原發(fā)性肺癌的40%～50%，腺癌主要起源于較小的支氣管黏膜中分泌黏液的上皮細(xì)胞，女性多見，約占肺癌發(fā)病率的20%～30%。近年來(lái)研究表明，自噬是細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)代謝的重要途徑之一，而其調(diào)控機(jī)制的失活與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[1-2]。Beclin1、自噬相關(guān)蛋白1（autophagy-related protein 1，Atg1）、雷帕霉素靶蛋白（target of rapamycin,mTOR)是編碼自噬相關(guān)蛋白的重要基因[3-4]。本研究通過(guò)檢測(cè)Beclin1、Atg1、mTOR在不同分化程度肺鱗癌和肺腺癌中的表達(dá)情況，探討其對(duì)肺癌發(fā)生發(fā)展的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集我院2012年4月—2013年4月有完整臨床及病理資料的肺鱗癌和肺腺癌患者82例，其中男46例，女36例，年齡32～73歲，平均（53.00±10.43）歲。所有病例均經(jīng)病理證實(shí)，術(shù)前未經(jīng)過(guò)放化治療。按照國(guó)際抗癌聯(lián)盟（Union for International Cancer Control,UICC）2009年修訂的pTNM分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ期26例，Ⅱ～Ⅲ期56例。按照WHO肺癌分類標(biāo)準(zhǔn)：鱗癌（SCC）39例，腺癌43例；中、高分化56例，低分化26例。瘤體直徑≥3 cm者47例，＜3 cm者35例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移38例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移44例。另收集同一患者的距癌組織＞5 cm、經(jīng)HE染色證實(shí)無(wú)癌細(xì)胞浸潤(rùn)的正常余肺組織17例（正常組）。所有標(biāo)本的使用均經(jīng)我院倫理委員會(huì)同意，取得患者或家屬的知情。

1.2 主要試劑及儀器 鼠抗人Beclin1、mTOR單克隆抗體、兔抗人Atg1單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)abcam生物公司。PV9000辣根酶標(biāo)記羊抗兔/小鼠二抗試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。石蠟切片機(jī)、攤片烤片機(jī)（德國(guó)萊卡公司）。

1.3 方法 手術(shù)切除后的標(biāo)本迅速經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，厚度5 μm切片。采用免疫組化Envision法二步法進(jìn)行檢測(cè)，具體步驟如下：切片常規(guī)脫蠟至水，將切片置于含pH 6.0枸椽酸緩沖液的高壓鍋內(nèi)，加熱至減壓閥噴氣2 min以修復(fù)抗原，自然冷卻后，PBS洗滌；3%過(guò)氧化氫溶液處理10～30 min以去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；滴加適當(dāng)濃度稀釋的一抗（鼠抗人Beclin1抗體），4℃孵育過(guò)夜；滴加聚合物輔助劑，37℃孵育30 min；滴加辣根酶標(biāo)記羊抗兔/小鼠IgG多聚體（PV9000）37℃孵育30 min,以上各步驟間均采用0.01 mol/L PBS洗滌3次，每次5 min；DAB顯色；蘇木素復(fù)染，脫水，透明，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。陰性對(duì)照用PBS替代一抗。Atg1、mTOR蛋白染色步驟同上。

采用Greenspan半定量法對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞比例及染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分。陽(yáng)性細(xì)胞比例及染色強(qiáng)度均分為1、2、3、4等4個(gè)級(jí)別，對(duì)應(yīng)的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量分別為≤10%、11%～25%、26%～50%、≥51%，對(duì)應(yīng)的染色強(qiáng)度分別為無(wú)著色、淡棕黃色、棕黃色、深棕色。陽(yáng)性細(xì)胞比例與染色強(qiáng)度評(píng)分相乘，≤2分者為陰性,＞2分者為陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Bivariate（Spearman）等級(jí)相關(guān)性分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 肺癌組、正常組各蛋白陽(yáng)性表達(dá)情況 Beclin1蛋白定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，Atg1蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)，mTOR蛋白表達(dá)于陽(yáng)性細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，呈棕黃色顆粒。肺癌組Beclin1陽(yáng)性表達(dá)率低于正常組，mTOR陽(yáng)性表達(dá)率高于正常組（P＜0.01），2組間Atg1陽(yáng)性表達(dá)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1，圖1、2。

Table 1 Comparison of Beclin1,Atg1 and mTOR expression between normal tissue and lung cancer表1 Beclin1、Atg1、mTOR的陽(yáng)性表達(dá)情況例（%）

2.2 不同臨床病理特征肺癌患者組織中各蛋白陽(yáng)性表達(dá)情況比較 不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、分化程度情況的肺癌組織中Beclin1陽(yáng)性表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，隨腫瘤惡變和侵襲程度的增強(qiáng)呈遞減趨勢(shì)；腫塊較大肺癌組織中Atg 1陽(yáng)性表達(dá)率較低（P＜0.01）；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌組織中mTOR陽(yáng)性表達(dá)率高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者（P＜0.01）；其余不同臨床病理特征肺癌患者組織間相應(yīng)蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2，圖1、2。

2.3 自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的相關(guān)性 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，肺鱗癌組織中，Beclin1與Atg1表達(dá)呈正相關(guān)，Beclin1、Atg1分別與mTOR呈負(fù)相關(guān)；肺腺癌組織中，Beclin1與Atg1表達(dá)呈正相關(guān)，Beclin1、Atg1分別與mTOR呈負(fù)相關(guān)，見表3。

3 討論

自噬是指細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的細(xì)胞器和大分子物質(zhì)在膜包囊泡中的降解過(guò)程[5]。在生理狀態(tài)下，自噬具有維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和促進(jìn)細(xì)胞生存的作用，但是過(guò)度的自噬可引起細(xì)胞死亡。目前關(guān)于腫瘤細(xì)胞自噬的研究報(bào)道不一，有研究表明腫瘤細(xì)胞的自噬活性降低，也有研究顯示某些腫瘤細(xì)胞保持了較高的自噬活性，如胃癌、結(jié)腸癌、肝癌、乳腺癌、宮頸癌等[6-7]。

自噬主要受mTOR復(fù)合體和Beclin1復(fù)合體的調(diào)節(jié)，mTOR通路的激活抑制自噬的發(fā)生，而Be-clin1復(fù)合體可促進(jìn)自噬的發(fā)生。Atg1蛋白是啟動(dòng)自噬通路的一個(gè)關(guān)鍵的絲氨酸蘇氨酸激酶，Atg1與Atg13、Atg17蛋白形成復(fù)合體后能夠高效的激活自噬。而mTOR復(fù)合體（TORC1）是調(diào)控Atg1復(fù)合體活性的最主要上游分子[8]，TORC1作為雷帕霉素的靶分子，具有絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶的活性。TOR信號(hào)通路是調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、自噬的重要信號(hào)通路，該通路可以整合來(lái)自糖、氨基酸、生長(zhǎng)因子等多種信號(hào)，調(diào)控胞內(nèi)蛋白的合成和降解。mTOR通過(guò)與Atg1結(jié)合形成復(fù)合體，抑制Atg1的激酶活性，進(jìn)一步抑制自噬的發(fā)生[9]。而Beclin1基因雜合缺失是細(xì)胞發(fā)生惡變轉(zhuǎn)化的原因之一，研究發(fā)現(xiàn)Beclin1可與PI3K形成復(fù)合體來(lái)調(diào)節(jié)Atg蛋白在自噬前體結(jié)構(gòu)中的定位，發(fā)揮調(diào)節(jié)自噬的作用[10]。Beclin1基因缺失大鼠中的自噬形成有缺陷，而且惡性腫瘤的發(fā)生率明顯提高，所以Beclin1被認(rèn)為是一種腫瘤抑制基因[11]。研究發(fā)現(xiàn)MCF7乳腺癌細(xì)胞中穩(wěn)定超表達(dá)Beclin1可降低細(xì)胞增殖和成瘤能力[12]。

Table 2 Beclin1,Atg1 and mTOR expression in lung cancer表2 Beclin1、Atg1、mTOR在肺鱗癌和腺癌中的表達(dá)情況 例（%）

Table 3 Correlation of Beclin1,Atg1 and mTOR in lung cancer表3 Beclin1、Atg1、mTOR在肺鱗癌和腺癌中的相關(guān)性 （例）

本研究結(jié)果顯示，癌旁正常肺組織中Beclin1呈高表達(dá)，mTOR表達(dá)較少，而在肺鱗癌和腺癌中則呈相反的表達(dá)趨勢(shì)，并且Beclin1在不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、分化程度情況的肺癌組織的陽(yáng)性表達(dá)率有明顯差異，腫塊較大肺癌組織中Atg 1陽(yáng)性表達(dá)率較低，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌組織中mTOR陽(yáng)性表達(dá)率高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者。Beclin1與Atg1呈明顯的正相關(guān)，而二者與mTOR呈現(xiàn)明顯的負(fù)相關(guān)。在正常情況下，機(jī)體通過(guò)細(xì)胞自噬清除衰老的細(xì)胞器，維持機(jī)體的自我更新。在腫瘤發(fā)生的早期，自噬蛋白Beclin1、Atg1表達(dá)量較正常時(shí)降低，但仍發(fā)揮一定的自噬的作用，以抑制腫瘤細(xì)胞的形成[13]。當(dāng)腫瘤細(xì)胞增殖活躍時(shí)，可能引起mTOR和PI3K的活性改變，mTOR通過(guò)與Atg1結(jié)合形成復(fù)合體，抑制Atg1的激酶活性，抑制Atg1復(fù)合體的形成，進(jìn)一步抑制自噬的發(fā)生。而PI3K活性的改變，影響了Beclin1復(fù)合體的形成，從而影響自噬的發(fā)生。由于腫瘤細(xì)胞凋亡不足、自噬功能下降，導(dǎo)致本應(yīng)該通過(guò)凋亡或自噬性死亡的細(xì)胞不能發(fā)生凋亡或自噬性死亡，引起細(xì)胞的異常增多，最終導(dǎo)致癌變。本研究可對(duì)肺癌患者的診斷、預(yù)后判斷提供實(shí)驗(yàn)支持，并且為進(jìn)一步采用蛋白抑制劑靶向干預(yù)自噬以防止肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移提供理論依據(jù)，具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。

Figure 1 Beclin1,Atg1 and mTOR expression in lung SCC(Envision,×400)圖1 Beclin1、Atg1、mTOR在不同分化程度肺鱗癌中的表達(dá)（Envision法，×400）

Figure 2 Beclin1,Atg1 and mTOR expression in lung adenocarcinoma(Envision,×400)圖2 Beclin1、Atg1、mTOR在不同分化程度腺癌中的表達(dá)（Envision，×400）

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（2013-10-09收稿 2014-02-07修回）

（本文編輯 李國(guó)琪）

Expression and Correlated Analysis of Autophagy-related Proteins in Human Squamous Cell Carcinoma and Adenocarcinoma of Lung

GUO Kai,HUANG Bo,WANG Xiaodong
The First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University,Jinzhou 121000,China

ObjectiveTo explore expression of Beclin1,autophagy-related protein 1(Atg1),mammalian target of rapamycin(mTOR)in squamous cell carcinoma(SCC)and adenocarcinoma of lung and to analyse relationship among these three factors.MethodsImmunohistochemical stainning was applied to detect expression of Beclin1,Atg1 and mTOR in 82 samples of SCC and adenocarcinoma of lung(lung cancer group)and 17 samples of paraneoplastic normal lung tissues(control group).Correlations of expression of Beclin1,Atg1 and mTOR were analyzed in SCC and adenocarcinoma of lung.Re?sultsThe expression of Beclin1 was significantly lower in lung cancer group than that in control group（52.44%vs 94.12%，P＜0.01）.There were significant differences of the differentiation,TNM stages and lymph node metastasis in lung cancer group compared with those in control group.And Beclin1 expression showed a decreasing trend with malignant and invasive of tumors.mTOR expression in lung cancer tissue with lymph nod metastasis is higher than that in the tissue without lymph node metastasis（P＜0.01）.Atg1 expression in lung cancer tissue with larger mass is less than that in lung cancer tissue with small lumps（P＜0.01）.Beclin1 Expression was positively correlated with the Atg1 expression in SCC（r=0.609，P＜0.01）. Beclin1 and Atg1 expressions were both negatively correlated with mTOR expression in SCC（r=-0.617，-0.444，P＜0.01）. Beclin1 expression was positively correlated with Atg1 expression in adenocarcinoma（r=0.458，P＜0.01）.Beclin1 and Atg1 expression were both negatively correlated with mTOR expression in adenocarcinoma（r=-0.497，-0.541，P＜0.01）.Conclu?sionBeclin1,Atg1 and mTOR expression showed a strong correlation in lung cancer,and clinicopathological change of lung SCC and adenocarcinoma may be related to autophagy.

lung neoplasms;carcinoma,squamous cell;adenocarcinoma;autophagy;Beclin1;autophagy-related protein 1;target of rapamycin

R734.2

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.06.007

*遼寧省科技廳基金資助項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：201202143）

遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院胸外科（郵編121000）

△通訊作者 E-mail:antiy3018@sina.com