HPLC法測定恩替卡韋的平衡溶解度和表觀油水分配系數(shù)

劉 巖，孫英華，王 尚，何仲貴

(沈陽藥科大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110016)

HPLC法測定恩替卡韋的平衡溶解度和表觀油水分配系數(shù)

劉 巖，孫英華，王 尚，何仲貴*

(沈陽藥科大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110016)

目的考察恩替卡韋在不同介質(zhì)中的平衡溶解度及其在正辛醇-水和正辛醇-緩沖液體系中的表觀油水分配系數(shù)，為后續(xù)的制劑研究奠定基礎(chǔ)。方法 采用搖瓶-高效液相色譜法測定恩替卡韋在水中和不同pH值緩沖液中的平衡溶解度及表觀油水分配系數(shù)。結(jié)果 37oC時(shí)恩替卡韋在水中的平衡溶解度為2.53 g·L–1，堿性條件下的溶解度較低，酸性條件下的溶解度增大；恩替卡韋在不同pH值的正辛醇-緩沖液體系中的表觀油水分配系數(shù)均較小。結(jié)論 本文建立的測定方法簡單可行，37oC時(shí)恩替卡韋微溶于水，且溶解度隨pH值減小而增大，表觀油水分配系數(shù)隨pH值減小而減小。

藥劑學(xué)；恩替卡韋；高效液相色譜法；平衡溶解度；表觀油水分配系數(shù)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染一直是一個(gè)亟待解決的全球性的公共健康問題。目前，全世界HBV感染者約有3.5億，而我國HBV攜帶者就有1.2億之多[1]。HBV感染可引起慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)、肝纖維化(hepatic fibrosis，HF)、肝硬化(liver cirrhosis, LC)和原發(fā)性肝細(xì)胞癌(hepatocellulor carcinoma, HCC)等相關(guān)疾病[2]。

目前國內(nèi)外公認(rèn)有效的抗HBV藥物主要有干擾素、核苷或核苷酸類似物兩類。其中，恩替卡韋(entecavir, ETV)是由美國百時(shí)美施貴寶(Bristol-Myers Squbb)公司于20世紀(jì)90年代研發(fā)的一種環(huán)戊基鳥嘌呤核苷類似物，化學(xué)名為2-氨基-9-[(1S,3R,4S)-4-羥基-3-羥甲基-2-亞甲基環(huán)戊基]-1,9-二氫-6H-嘌呤-6-酮一水合物，分子式：C12H15N5O3? H2O，分子量：295.3，結(jié)構(gòu)式見圖 1。

圖1 恩替卡韋的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Chemical structure of entecavir

恩替卡韋于2005年3月獲得美國FDA的批準(zhǔn)[3]，并于同年11月被我國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)在國內(nèi)上市使用。由于恩替卡韋具有抗病毒作用強(qiáng)、不良反應(yīng)小、臨床耐藥發(fā)生率低等優(yōu)點(diǎn)，在治療CHB的藥物中被認(rèn)為具有很好的臨床應(yīng)用前景，并已成為目前抗HBV治療的重要一線藥物。眾所周知，藥物的理化性質(zhì)與其在生物體內(nèi)的膜滲透性具有很大的相關(guān)性，準(zhǔn)確地測定藥物的相關(guān)理化參數(shù)，尤其是平衡溶解度和表觀油水分配系數(shù)，有助于預(yù)測藥物在體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)(ADME)。目前，國內(nèi)外尚無有關(guān)測定恩替卡韋平衡溶解度及表觀油水分配系數(shù)的文獻(xiàn)報(bào)道。本文作者采用搖瓶-HPLC法系統(tǒng)地測定恩替卡韋在水中和在不同pH值緩沖液中的平衡溶解度及表觀油水分配系數(shù)，以期為該藥的進(jìn)一步深入研究奠定一定的基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀(配有Waters 2489 紫外可見檢測器、Waters e2695 分離模塊，美國 Waters公司)；HZQ-C空氣浴振蕩機(jī)(哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司)；EU-pH700型pH計(jì)(美國 Eutech 公司)；KQ-100型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；80-2B 臺式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；LDZ5-2型低速自動(dòng)平衡離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)；AR1140型電子分析天平(美國Ohaus公司)；BT25S十萬分之一電子分析天平(德國Sartorius公司)。

1.2 試藥

恩替卡韋對照品(中國食品藥品檢定研究院，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.8%，批號101248-201202)；恩替卡韋原料藥(蘇州東瑞制藥有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.7%，批號111010017)；乙腈(色譜純，天津市康科德科技有限公司)；三氟乙酸(色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；正辛醇(分析純，山東禹王實(shí)業(yè)有限公司化工分公司)；其余試劑均為分析純，水為重蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的配制

2.1.1 pH值為1.0的鹽酸溶液

按《中華人民共和國藥典》2010年版二部附錄的方法配制，用pH計(jì)驗(yàn)證，若有偏離，用鹽酸或氫氧化鈉校正pH值為1.0。

2.1.2 磷酸鹽緩沖液

依據(jù)Henderson-Hasselbalch方程理論[6]配制pH值分別為2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0、6.8、7.4、8.0的磷酸鹽緩沖液，用pH計(jì)驗(yàn)證，若有偏離，用磷酸或氫氧化鈉校正pH值為所需值。

2.1.3 恩替卡韋貯備液

取恩替卡韋對照品約12 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加流動(dòng)相適量，超聲使溶解，放至室溫，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為恩替卡韋貯備液(質(zhì)量濃度為250 μg·mL–1)。

2.1.4 恩替卡韋對照品溶液

精密量取恩替卡韋貯備液1.0 mL，置于25 mL量瓶中，加流動(dòng)相至刻度，搖勻，作為恩替卡韋對照品溶液。

2.2 恩替卡韋HPLC測定方法的建立

2.2.1 色譜條件的選擇

色譜柱：Welchrom C18色譜柱(250 mm × 4.6 mm, 5 μm)；流動(dòng)相：體積分?jǐn)?shù)0.03% 的三氟乙酸溶液-乙腈(體積比96∶ 4)；流速：1.0 mL·min–1；檢測波長：254 nm；柱溫：30oC；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2.2 專屬性試驗(yàn)

分別將流動(dòng)相和恩替卡韋對照品溶液注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖(圖 2)。試驗(yàn)結(jié)果表明，溶劑峰與主藥峰完全分開，在此色譜條件下溶劑不影響主藥的測定，說明測試方法的專屬性較強(qiáng)。

圖2 流動(dòng)相(A)和恩替卡韋對照溶液(B)的色譜圖Fig. 2 Chromatograms of mobile phase (A) and entecavir standard solution (B)

2.2.3 線性關(guān)系考察

精密量取恩替卡韋貯備液適量，用流動(dòng)相分別配制成質(zhì)量濃度依次為1、2、3、5、10、20、30、50 μg·mL–1的系列溶液，分別進(jìn)樣20 μL進(jìn)行測定，并記錄色譜圖。以溶液濃度(ρ, μg·mL–1)對峰面積(A)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程A= 2.05 7х105ρ +1.9 63х104，相關(guān)系數(shù)R2=1。試驗(yàn)結(jié)果表明，恩替卡韋在質(zhì)量濃度1～50 μg·mL–1內(nèi)與吸收峰面積呈良好的線性相關(guān)性。

2.2.4 精密度試驗(yàn)

按 “2.2.3” 項(xiàng)的方法，配制低(1 μg·mL–1)、中(10 μg·mL–1)、高(50 μg·mL–1) 3種質(zhì)量濃度的樣品溶液，按 “2.2.1” 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，每個(gè)質(zhì)量濃度測定6次，記錄峰面積，計(jì)算日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)；連續(xù)測定3 d，計(jì)算日間RSD。結(jié)果顯示，低、中、高3種質(zhì)量濃度樣品溶液的日內(nèi)RSD分別為0.25%、0.63%、0.38%，日間RSD分別為1.17%、0.82%、1.05%，表明該方法的精密度良好。

2.2.5 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

按 “2.2.3” 項(xiàng)的方法，配制低(1 μg·mL–1)、中(10 μg·mL–1)、高(50 μg·mL–1) 3種質(zhì)量濃度的樣品溶液，按 “2.2.1” 項(xiàng)下色譜條件測定，每種質(zhì)量濃度測定6次，由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算對應(yīng)的質(zhì)量濃度，按公式：回收率% = 測定濃度值/真實(shí)濃度值×100%，計(jì)算低、中、高 3種質(zhì)量濃度的回收率分別為98.26%、99.01%、99.73%，表明該方法的準(zhǔn)確度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別對不同pH值條件下的恩替卡韋溶液在振搖前和振搖24、48、72 h(溫度為37oC)后進(jìn)行測定，結(jié)果表明恩替卡韋在不同pH值條件下、在72 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3 恩替卡韋平衡溶解度的測定

參照文獻(xiàn)的實(shí)驗(yàn)方法[7-8]，將過量的恩替卡韋置于10 mL具塞玻璃試管中，分別加入2 mL水、pH值為1.0的鹽酸溶液，以及pH值分別為2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0、6.8、7.4、8.0的磷酸鹽緩沖液，超聲溶解30 min，直至溶液過飽和，于37oC空氣浴恒溫條件下振蕩72 h。將飽和恩替卡韋溶液以13 000 r·min–1離心10 min，取上清液，用流動(dòng)相稀釋至線性范圍內(nèi)，進(jìn)樣20 μL，按 “2.2.1” 項(xiàng)下色譜條件測定，記錄峰面積，由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算恩替卡韋在各種溶劑中的平衡溶解度。結(jié)果表明，37oC時(shí)恩替卡韋在水中的平衡溶解度為2.53 mg·mL–1，在磷酸鹽緩沖液中的平衡溶解度隨pH值升高而減小，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見表1和圖 3。

表1 37 oC時(shí)恩替卡韋在不同pH值緩沖液中的平衡溶解度(n=3)Table 1 Equilibrium solubility of entecavir in buffer solutions of different pH at 37 oC (n=3)

圖3 37 oC時(shí)恩替卡韋在不同pH值緩沖液中的平衡溶解度Fig. 3 Equilibrium solubility of entecavir in buffer solutions of different pH at 37 oC

2.4 恩替卡韋表觀油水分配系數(shù)的測定

取恩替卡韋原料藥適量，分別溶解于被正辛醇飽和的水、pH值為 1.0的鹽酸溶液，以及pH值分別為 2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0、6.8、7.4、8.0的磷酸鹽緩沖液中，制成不同pH值的恩替卡韋水溶液，作為供試溶液，用流動(dòng)相稀釋至線性范圍內(nèi)，精密量取20 μL注入液相色譜儀，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，記錄峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，求出各供試品溶液的質(zhì)量濃度，記為ρw初。

分別精密量取上述各供試品溶液2 mL，置于10 mL具塞試管中，再分別加入被上述各種介質(zhì)飽和的正辛醇2 mL，搖勻，于37oC空氣浴恒溫條件下振蕩72 h直至平衡。取出，以3 500 r·min–1離心10 min使分層，取下層水相，用流動(dòng)相稀釋至線性范圍內(nèi)，精密量取20 μL注入液相色譜儀，按 “2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，記錄峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，求出平衡后水相中藥物的質(zhì)量濃度，記為ρw。

其中，ρo為平衡后油相中藥物的質(zhì)量濃度，ρw為平衡后水相中藥物的質(zhì)量濃度。本實(shí)驗(yàn)中，水相與油相的體積相等，故在藥物分配達(dá)到平衡時(shí)進(jìn)而可推出37oC時(shí)恩替卡韋的表觀正辛醇/水分配系數(shù)為在不同pH值的緩沖液中的表觀正辛醇-緩沖液分配系數(shù)見表 2和圖 4。結(jié)果表明，恩替卡韋的表觀油水分配系數(shù)隨著pH值的升高而增大。

表2 37 oC時(shí)恩替卡韋在正辛醇-緩沖液體系中的表觀油水分配系數(shù)(n=3) Table 2 Apparent oil/water partition coefficient of entecavir in n-octanol-buffer solution systemswith various pH at37 oC (n=3)

圖4 37 oC時(shí)恩替卡韋在正辛醇-緩沖液體系中的表觀油水分配系數(shù)Fig. 4 Apparent oil/water partition coefficient of entecavir in n-octanol-buffer solution systems with various pH at 37 oC

3 討論

藥物表觀油水分配系數(shù)的測定方法有搖瓶法、液相色譜法、薄層色譜法和產(chǎn)生柱法等[11]。色譜法需要用一系列已知表觀油水分配系數(shù)的同系物來建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，成本較高；產(chǎn)生柱法測定過程中達(dá)到平衡時(shí)間過長，且步驟較多，故本文采用了最為簡便的搖瓶法，同時(shí)采用高效液相色譜法對恩替卡韋的含量進(jìn)行測定，并且進(jìn)行了專屬性、線性關(guān)系、精密度和準(zhǔn)確度等方法驗(yàn)證，均符合要求,而且樣品溶液在72 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。說明該測定方法可行，測定結(jié)果可信。

體內(nèi)胃腸道pH值在1.0 ～ 8.0，其中，胃1.0 ～ 3.0，十二指腸4.0 ～ 6.0，空腸6.0 ～ 7.0，回腸7.0，結(jié)腸8.0。為了模擬人體的生理環(huán)境，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)并考察了恩替卡韋在pH值為1.0、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0、6.8、7.4、8.0時(shí)的平衡溶解度和表觀油水分配系數(shù)。正辛醇的極性與多數(shù)有機(jī)體液的極性相差不大，其溶解度參數(shù)與生物膜的溶解度參數(shù)很接近，常作為模擬生物膜相的有機(jī)溶劑，因此本實(shí)驗(yàn)選用正辛醇-水為模擬系統(tǒng)。而且，本實(shí)驗(yàn)所用的有機(jī)相為水相飽和的正辛醇，類似地，水相也是用正辛醇飽和的，這樣就避免了實(shí)驗(yàn)過程中由于正辛醇與水的分配而造成的誤差。

藥物在體內(nèi)的溶解、吸收、分布、轉(zhuǎn)運(yùn)與藥物的水溶性及脂溶性有關(guān)，采用正辛醇-水系統(tǒng)測定藥物的表觀油水分配系數(shù)對于預(yù)測藥物的體內(nèi)吸收具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)的測定結(jié)果表明，恩替卡韋的表觀油水分配系數(shù)隨著pH值的不同而改變，即隨著pH值的升高，恩替卡韋表觀油水分配系數(shù)逐漸增大，這與恩替卡韋的平衡溶解度隨pH值升高而減小的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合。

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Determination of equilibrium solubility of entecavir and its apparent oil/water partition coefficient by HPLC

LIU Yan, SUN Ying-hua, WANG Shang, HE Zhong-gui*
(School of Pharmacy, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016, China)

∶ ObjectiveTo detemine the equilibrium solubility of entecavir in various media and its apparent oil/water partition coefficient in the n-octanol-water/buffer solution systems, which will build up a basis for the further research of its preparations. Methods A shake flask-high performance liquid chromatography (HPLC) method was developed to determine the equilibrium solubility of entecavir in water and different pH buffer solutions and its apparent oil/water partition coefficient. Results The equilibrium solubility of entecavir was 2.53 mg·mL–1in water at 37oC. Furthermore, the values were lower in basic buffer solutions and increased in acid buffer solutions. In addition, the values of apparent oil/water partition coefficient of entecavir were low in n-octanol-water/buffer solution systems with different pH values. Conclusions A simple and feasible method was established in this study. It was found that entecavir is slightly soluble in water at 37oC, and its solubility and apparent oil/water partition coefficient are separately increased and decreased as pH value reduces.

∶pharmaceutics; entecavir; HPLC; equilibrium solubility; apparent oil/water partition coefficient

R94

A

(2014)06–0201–08

(本篇責(zé)任編輯：秦 昕)

2014-04-11

劉巖(1988-), 女(漢族), 安徽宿州人, 碩士研究生, Tel. 024-23986320, E-mail liuyansyyk@126.com;＊通訊作者：何仲貴(1965-), 男(漢族), 寧夏鹽池人, 教授, 博士, 主要從事藥物新劑型與新技術(shù)研究, Tel. 024-23986321, E-mail hezhonggui@vip.163.com。