腦利鈉肽對兔心肌梗死后縫隙連接蛋白重構(gòu)及炎癥因子的影響*

王伯松

(泰山醫(yī)學(xué)院附屬泰山醫(yī)院心內(nèi)科，山東 泰安 271000)

心肌缺血相關(guān)的室性心律失常是導(dǎo)致猝死的重要原因之一?？p隙連接介導(dǎo)心肌細(xì)胞間的電藕聯(lián)，縫隙連接的正常表達(dá)與分布，對于維持心臟電活動與機(jī)械活動同步有重要作用。縫隙連接蛋白Cx43的減少及分布紊亂均會導(dǎo)致缺血區(qū)心肌電傳導(dǎo)異常，誘發(fā)心律失常[1]。腦利鈉肽(BNP)是由心室分泌的多肽類的心臟激素，心肌損傷后伴隨炎性反應(yīng)的發(fā)生, BNP對此過程可能發(fā)揮調(diào)控作用。rhBNP是人工合成產(chǎn)物，與BNP作用機(jī)制相同，具有利鈉、擴(kuò)血管、抑制交感神經(jīng)系統(tǒng)及腎素-血管緊張素-醛固酮(RAAS)系統(tǒng)活性，增強(qiáng)心肌抗缺血、抗缺氧能力，也能降低心律失常的發(fā)生率[2]。以往研究發(fā)現(xiàn)腦利鈉肽能減少炎性細(xì)胞因子釋放，抑制心室重構(gòu)[3]，但是具體機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)旨在通過構(gòu)建兔心肌梗死模型，觀察rhBNP對于心肌梗死后炎癥反應(yīng)及縫隙連接蛋白數(shù)量、分布的影響。

1 材料與方法

1.1動物模型的制備與分組

58只新西蘭大白兔(普通級，2.0～2.5kg，雌雄不限)，由山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham組)18只,心肌梗死組(MI組)20只, 心肌梗死后人重組腦利鈉肽干預(yù)組(rhBNP組)20只。

兔心肌梗死模型制備：3%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉，常規(guī)消毒后沿胸骨中線切開皮膚，暴露胸骨及肋軟骨。貼緊胸骨左緣剪斷第4～5肋骨，暴露縱隔及心臟，剪開心包膜，暴露出冠狀動脈。于左心耳下緣至心尖部的中下1/3處用6/0線穿過心肌淺層縫扎前降支，記錄心電圖。心電圖示ST段抬高，結(jié)扎水平以下心肌局部顏色變暗，搏動減弱，觀察20 min后逐層關(guān)閉胸腔。假手術(shù)組，手術(shù)過程同上只穿線但不結(jié)扎冠狀動脈。術(shù)后給予青霉素(80萬單位/d)注射3天，自主飲食(水)。

MI模型制備后，48只兔存活，Sham組(n=16)，MI組(n=16)，rhBNP組(n=16)。rhBNP組自術(shù)后即刻給予rhBNP(0.01 μg/kg/min)持續(xù)靜脈泵入24 h；MI組、Sham組給予同等劑量的生理鹽水靜脈泵入；所有兔同期喂養(yǎng)8周。

1.2電生理實(shí)驗(yàn)

1.2.1測定心肌有效不應(yīng)期(ERP) 術(shù)后8周所有存活兔以3%戊巴比妥鈉(35 mg/kg)麻醉，心電監(jiān)護(hù)，開胸，縫制心包吊床。起搏電極，直徑0.3 mm ，兩針相距0.3 cm，在梗死灶周(梗死蒼白邊緣3 mm)刺入2 mm，Sham組起搏電極放置在心臟相應(yīng)部位，應(yīng)用心臟電生理刺激儀(DF-5A型，蘇州市東方電子儀器廠)以高出竇性頻率10%的頻率起搏，脈寬0.1 ms, 電壓5.0 v，確定起搏有效后，逐漸降低起搏電壓，測定起搏閾值，以起搏閾值的兩倍為輸出電壓，脈寬0.1 ms ，以S1S2 逆掃，每次遞減5 ms，測定ERP。

1.2.2程序電刺激誘發(fā)室性心律失常

1.2.2.1刺激終點(diǎn) ①誘發(fā)出持續(xù)性室性心動過速(VT)或心室顫動(Vf)； ②完成所有操作仍未誘發(fā)出室性心律失常。

1.2.2.2刺激方案 ①行S1S2刺激，以5ms逐步遞減直至誘發(fā)VT/Vf或心肌不應(yīng)期；②以S1S2刺激如未誘發(fā)出室速或室顫，則在不應(yīng)期的基礎(chǔ)上增加30ms，加發(fā)S3重復(fù)遞減刺激，直至誘發(fā)VT/Vf或心肌不應(yīng)期；③S1S1持續(xù)刺激8 min。如未誘發(fā)出室性心律失常，停止刺激5分鐘后重復(fù)上述步驟。

1.3免疫熒光分析

新鮮的標(biāo)本冰凍切片后(取材部位均與上述電生理指標(biāo)測定位置一致)，10%中性甲醛固定制作蠟塊，制成4 μm切片。采用SABC法進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測。陰性對照用PBS代替一抗。滴加10%羊血清室溫孵育20 min，滴加1∶100稀釋的Cx43多克隆抗體(美國Millipore公司)， 4 ℃孵育過夜，PBS洗3 min×3次，滴加1∶500稀釋的異硫氰酸熒光素標(biāo)記的IgG抗體(IgG- FITC), 37 ℃孵育20 min, PBS洗3 min×3次，緩沖甘油封片。 以Zeiss LSM510激光共聚焦顯微鏡觀察,以488 nm波長激發(fā)FITC，發(fā)生光為519 nm的綠光。每張切片取4～5個視野，選擇細(xì)胞縱行走向區(qū)域逐層掃描獲取圖像。

1.4IL-1β、TNF-α mRNA的表達(dá)水平的檢測

2017年，國內(nèi)數(shù)字出版行業(yè)的市場營業(yè)收入總額達(dá)到7071.93億元，國內(nèi)互聯(lián)網(wǎng)期刊出版行業(yè)的市場營業(yè)收入總額達(dá)到20.10億元，較2016年上漲了14.68%。

按照Trizol試劑盒(Invitrogen公司)提供的方法提取梗死灶周心肌總RNA。根據(jù)Genbank查詢目的基因序列，Primer5.0設(shè)計引物，GADPH為內(nèi)參照，GAPDH引物序列；上游5’ GCGCCTGGTCACCAGGGCTGCTT 3’,下游5’ TGCCGAAGTGGTCGTGGATGCCT 3’，擴(kuò)增目的片段465bp。1)目的基因IL-1β引物序列：上游5’ATGGCAACTG TTCCTGAACTCAACT 3’，下游5’CAGGACAGGTA TAGATTCTTTCCTTT 3’，擴(kuò)增目的片段257bp；2)目的基因TNF-α引物序列：上游5’CATCTTCTCA AAATTCGAGTGACAA 3’，下游5’TGGGAGTAGAC AAGGTACAACCC 3’，擴(kuò)增目的片段175bp；按試劑盒說明一步法逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR反應(yīng)體系：cDNA 10 μl、5×PCR緩沖液 10 μl、Tag酶0.25 μl，目的基因及GAPDH上游、下游引物各0.5 μl，加入雙蒸水至總體積50 μl，95 ℃預(yù)變性5 min，擴(kuò)增36個循環(huán)(條件：95 ℃變性30 s、53 ℃ 退火60 s、68 ℃延伸240 s，4 ℃ 5 min)。取PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，應(yīng)用UVIpro凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行熒光半定量分析，以目的基因與內(nèi)參照物基因條帶吸光度比值作為目的基因的相對表達(dá)水平。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1動物的基本情況

術(shù)后8周Sham組存活16只, MI組存活16只，rhBNP組存活16只。MI組及rhBNP組心電圖可見病理性Q波，梗死區(qū)心肌呈蒼白色；Sham組冠狀動脈穿線附近心肌無變化。

2.2電生理實(shí)驗(yàn)

2.2.2室性心律失常誘發(fā)率 進(jìn)行程序電刺激，Sham組有1例誘發(fā)出VT，2例誘發(fā)出Vf；MI組有3例誘發(fā)出VT，5例誘發(fā)出Vf。而rhBNP組有2例誘發(fā)出VT，3例誘發(fā)出Vf，各組間均有顯著性差異。(見表 1)。

2.3炎癥因子 mRNA水平

MI組梗死灶周IL-1β mRNA、TNF-α mRNA水平均較Sham組相應(yīng)部位均明顯增高(P<0.01)，rhBNP組較MI組IL-1β mRNA 、TNF-α mRNA水平減低(P<0.05)。(見表2)。

2.4免疫熒光及激光共聚顯微鏡分析

Sham組Cx43主要分布于心肌細(xì)胞的端-端連接處；MI組Cx43表達(dá)量明顯顯著減少，且分布發(fā)生改變，Cx43端-端連接減少，而側(cè)-側(cè)連接相對增多；而rhBNP組較MI組CX43表達(dá)增多，分布紊亂程度部分改善，趨于接近Sham組。(見圖1～3)。

表 1 各組間電生理數(shù)據(jù)比較

注：與Sham組相比，*P<0.01；與MI組相比，#P<0.05

表 2 炎癥因子 mRNA 水平(RT- PCR)

注：與Sham組相比，*p<0.01；與MI組相比，#p<0.05

圖1 Sham 組Cx43分布均勻。

圖2 MI組Cx43分布散亂。

圖3 rhBNP組CX43分布紊亂程度得以改善。

3 討 論

以往研究提示心肌細(xì)胞間電耦聯(lián)的改變與心律失常的發(fā)生關(guān)系緊密，縫隙連接的數(shù)量及空間分布決定了細(xì)胞間在各方向上傳導(dǎo)速度的不同，縫隙連接在空間上的重新分布造成了電傳導(dǎo)各向異性的改變，而縫隙連接的數(shù)量改變或功能下降會使動作電位傳導(dǎo)的速度減慢，增加電不穩(wěn)定性增加導(dǎo)致心律失常易于發(fā)生。Perter[4]等通過對狗心肌梗死灶的心外膜下邊緣區(qū)尚存活心肌進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)Cx43 的降解和分布的改變與心律失常的發(fā)生有著密切的關(guān)系，并且通過標(biāo)測直接證實(shí)了Cx43分布改變與折返環(huán)路形成的關(guān)系，從分子水平揭示了心律失常發(fā)生的解剖學(xué)基礎(chǔ)。

本研究觀察梗死周邊區(qū)Cx43減少，室顫閾值隨之明顯降低，提示心肌缺血破壞了正常的縫隙連接?？赡苡卸喾N機(jī)制參與了這個過程，比如細(xì)胞內(nèi)酸性物質(zhì)堆積，氧自由基的大量生成等。神經(jīng)內(nèi)分泌因素和細(xì)胞因子激活的多個復(fù)雜信號傳導(dǎo)通路介導(dǎo)了心肌縫隙連接重構(gòu)。心肌梗死后梗死周邊區(qū)炎癥因子如IL-1β、TNF-α和ET-1表達(dá)顯著增高[5]。TNF-α、IL-1可通過各自的信號傳導(dǎo)通路影響Cx43數(shù)量和功能[6,7]。 并能夠加劇心梗Cx43的降解[8]。 梗死灶周Cx43數(shù)目的下降會造成局部心肌電傳導(dǎo)速度減慢，使缺血心肌與正常心肌之間電傳導(dǎo)速度的差異增大，易于發(fā)生折返性心律失常。由此可以推測Cx43的減少可能是缺血誘發(fā)心律失常的一個重要因素。

rhBNP能夠抑制RAAS和ET-1分泌，拮抗神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)過度激活產(chǎn)生的心臟毒性[9]，rh-BNP 可以使腎上腺的去甲腎上腺素分泌率明顯下降，而不引起反射性交感神經(jīng)興奮及心率增加，還可直接抑制心臟交感神經(jīng)活動[10]。持續(xù)而嚴(yán)重的心肌缺血在較短時間內(nèi)造成心肌細(xì)胞的大量壞死，炎性細(xì)胞浸潤并釋放大量的炎癥促進(jìn)性的細(xì)胞因子。Chiurchi等[11]研究表明, BNP可調(diào)控THP-1人巨噬細(xì)胞炎性因子的產(chǎn)生,如活性氧、活性氮、白三烯B4受體、前列腺素E2以及TNF-α、IL-12和IL-10。炎癥介質(zhì)可能通過心肌細(xì)胞壞死、凋亡引起纖維化而參與心力衰竭的發(fā)生和發(fā)展。心肌梗死區(qū)、梗死周邊區(qū)和非梗死區(qū)都存在著心肌細(xì)胞凋亡，心肌細(xì)胞凋亡也能促進(jìn)Cx43的降解。以往研究發(fā)現(xiàn)腦利鈉肽能顯著抑制心肌纖維化[12]。

BNP 可能對心梗后心肌的急性炎癥過程產(chǎn)生影響，進(jìn)一步對心肌的炎癥性損傷產(chǎn)生保護(hù)作用。rhBNP組的Cx43的免疫熒光檢測顯示BNP干預(yù)可降低梗死灶周炎癥因子的表達(dá)，抑制心梗后Cx43的降解，促使Cx43的表達(dá)和分布趨與正?；?使得局部電傳導(dǎo)的破壞減輕,正常心肌與缺血心肌之間縫隙連接的數(shù)目差距減小，電傳導(dǎo)的一致性可能有所恢復(fù)，這有利于打破折返環(huán)，抑制心律失常的發(fā)生。從而推測BNP這種部分逆轉(zhuǎn)缺血對縫隙連接的損傷作用，可能參與了BNP抑制心肌梗死后室性心律失常發(fā)生的過程。

[1] Peter NS,Green CR,Pool-Wilson PA,et al.Cardiac arrhythmogenesis and the gap junction [J]. Mol Cell Cardiol, 1995,27:37-44.

[2] Savio P,Souza D,Derek M,et al.B-type natriuretic peptide limits infarct size in rate isolated hearts via KATP channel opening[J]. Sm J Physiol Heart Circ Physiol,2003,284(6):1592.

[3] Yu XY,Liu CZ,Wang JH, et al. Brain natriuretic peptide and left ventricular remodeling after emergency percutaneous coronary intervention in acute myocardial infarction patients[J]. Zhong guoWei Zhong Bing Ji Jiu Yi Xue, 2008, 20(4): 204-206.

[4] Peters NS，Coromilas T，Severs NJ，et al． Disturbed connexin43 gap junction distribution correlates with the location of reentrant circuits in the epicardial border zone of healing canine infarcts that cause ventricular tachycardia[J]． Circulation，1997，95: 988-996．

[5] Yuan M J， Huang C X， Tang Y H， et al． A novel peptide ghrelin inhibits neural remodeling after myocardial infarction in rats [J]． Eur J Pharmacol，2009， 618(1-3)：52-57．

[6] Eugenin EA,Branes MC,Bermam JW,Saez JC.TNF-α plus INF-γ induce connexin 43 expression and formation of gap junctions between human monocytes/macrophages that enhance physiological responses[J].J Immumol,2003,170(3):1320-1328.

[7] Tonon R,D Andrea P.The functional expression of connexin 43 in articular chondrocytes is increased by interleukin I :evidence for a Ca2+-dependent mechanism[J]. Biorheology. 2002, 39(1-2): 153-160.

[8] Hao J, Suzuki K, Lu Y, et al. Inhibition of gap junction-mediated intercellular communication by TNF-αincultured human corneal fibroblasts[J]. IOVS, 2005,46(4): 1195-1200.

[9] Yancy CW,Saltzberg MT,Berkowita RL,et al.Safety and feasibility of using serial infusions of nesititide for heart failure in an outpatient setting.(from the FUSIONI Trial) [J].Am J Cardiol,2004,94(5):595-601.

[10] Brunner-La Rocca HP，Kaye DM，Woods RL，et al．Effects of intravenous brain natriuretic peptide on regional sympathetic activity in patients with chronic heart failure as compared with healthy control subjects[J]．J Am Coll Cardiol,2001,37: 1221-122．

[11] Chiurchi?V, Izzi V, DcAquilio F, et al.Brain Natriuretic Peptide (BNP) regulates the production of inflammatory mediators in human THP -1 macrophages[J]. Regul Pept, 2008, 148 (1-3): 26-32.

[12] Ogawa Y，Tamura N，Chusho H，et al． Brain nartiuretic peptide appears to act locally as an antifibrotic factor in the heart[J]． Can J Physio Pharmacol，2001，79: 723．