CDCP1胞外段基因的克隆及在大腸桿菌中表達

李玲霞，王志巧，羅曉麗，宋麗娜＊，于珊珊，何成彥，趙麗純，李洪軍，趙海豐，武利濤

（1.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長春130033；2.吉林大學藥學院，吉林 長春130021；3.佳木斯大學第一臨床學院，黑龍江 佳木斯154003；4.北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院）

含 CUB 結構域蛋白1（CUB Domain－containing Protein 1，CDCP1）是一種細胞表面糖蛋白。研究證實CDCP1為一種新的干細胞標志物［1］表達失調與多種癌癥的發(fā)生、發(fā)展相關［2－7］。CDCP1為腫瘤輔助診斷及治療的潛在靶點。鑒于目前國內應用的CDCP1抗體制劑多為國外公司進口，因此研制CDCP1抗體制劑，可滿足國內在系統(tǒng)地探討CDCP1在腫瘤發(fā)生發(fā)展、免疫診斷和靶向治療中的需求。

1 材料與方法

1.1 腫瘤細胞株及菌種與質粒

人肺腺癌細胞株A549由吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院檢驗科保存、大腸桿菌 DH5α、BL21（DE3）、pGEX－KG由吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院檢驗科保存。

1.2 主要試劑

Trizol（Invitrogen）、Cloned AMV First－Strand cDNA Synthesis Kit、限制性內切酶EcoRⅠ、BamHⅠ、rTaq聚合酶、dNTP、T4連接酶（TaKaRa）、膠回收試劑盒、小量質粒提取試劑盒（愛思進生物技術公司）、IPTG、丙烯酰胺、N，N－甲叉雙丙烯酰胺（Sigma）。

引物由上海生工合成，引物序列如下：上游引物：5’－CGC GGATCC ATG AGCTGCCCAGACGGAGTCAC－3’；下游引物：5’－CG GAATTC TCA AGACATCAGGGTTGCTGAGC－3’。

1.3 實驗方法

1.3.1總RNA的提取 按Trizol試劑說明提取肺癌細胞系A549總RNA，測定RNA含量及260 nm和280nm的吸收值的比值。

1.3.2cDNA第一條鏈的合成 按Takara的Cloned AMV First－Strand cDNA Synthesis Kit操作步驟完成。

1.3.3PCR反應 取cDNA 反應液1μl，加入0.5 ml PCR管中，分別加入2mmol／L dNTP 4μl，10×PCR緩沖液5μl，上、下游引物各1μl（10.0pmol／μl），Taq酶2.5U，加DEPC水至終體積50μl，反應條件為94℃變性1min，57℃退火45s，72℃延伸1 min，32個循環(huán)后72℃延伸5min。取9μl PCR擴增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，在圖像分析處理系統(tǒng)上觀察、記錄電泳結果。

1.3.4表達載體的構建 堿性裂解法小量制備質粒；酶切反應混合物經(jīng)震蕩混勻、孵育后得到的產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，純化回收酶切產(chǎn)物并將產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳；將連接反應混合物震蕩混勻，連接過夜；制備轉化的感受態(tài)細胞，涂布于含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基表面，放于37℃培養(yǎng)。

1.3.5重組克隆的篩選和鑒定 通過雙酶切及PCR鑒定確認陽性的克隆，進行基因序列測定。測序結果在NCBI Human RefSeq數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對，查看所克隆序列是否為目的序列，是否有缺失或者突變。

1.3.6GST－CDCP1 融合蛋白在大腸桿菌中誘導表達 將pGEX－KG／CDCP1轉化到大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)中，經(jīng)氨芐青霉素篩選轉化后菌落，挑取不同單克隆小量培養(yǎng)，提取質粒雙酶切鑒定。誘導表達前一天將pGEX－KG／CDCP1重組菌（BL21）培養(yǎng)過夜，留1ml菌液做為陰性對照，剩余培養(yǎng)液中加入IPTG誘導表達，離心后將沉淀懸于Tris緩沖液中；取上述制備的懸液與上樣緩沖液混勻，加熱離心后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，染色，洗脫，直至觀察到清晰的條帶。

2 結果

2.1 CDCP1基因的擴增

以肺腺癌細胞株A549的mRNA為模板，應用所設計的引物通過RT－PCR法擴增CDCP1胞外段基因目的片段。瓊脂糖凝膠電泳結果顯示：在約270bp處擴增出單一條帶，大小與預計相符，見圖1。

2.2 重組質粒pGEX－KG／cdcp1的篩選及鑒定

將PCR產(chǎn)物經(jīng)EcoRⅠ、BamHⅠ雙酶切后，定向插入同樣經(jīng)雙酶切的pGEX－KG載體中，獲得重組質粒pGEX－KG／CDCP1。經(jīng)EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切、PCR及DNA序列測定對重組質粒進行鑒定，篩選出與GST之間讀碼框架正確的重組質粒，酶切鑒定、PCR鑒定見圖2、圖3。

圖1 RT－PCR擴增CDCP1基因目的片段

圖2 重組質粒pGEX－KG／CDCP1的酶切鑒定

圖3 重組質粒pGEX－KG／CDCP1的PCR鑒定

2.3 融合蛋白GST－CDCP1在大腸桿菌中的誘導表達

含PGEX－KG／CDCP1重組子的BL21用IPTG誘導表達6h后，SDS－PAGE分析可見，與誘導前相比，在相對分子質量約35kD處出現(xiàn)明顯的誘導蛋白條帶，分子質量大小與預期一致，見圖4。

3 討論

CDCP1是一種細胞跨膜糖蛋白。CDCP1表達失調與多種腫瘤相關［8］。有研究比較了結腸腺癌和鄰近正常組織，發(fā)現(xiàn)結腸癌細胞的惡性度與CDCP1染色強度相關［9］。在一項腎細胞癌研究中也觀察到，正常腎臟細胞未檢測到CDCP1表達，而33.5%癌癥病例檢測到CDCP1的表達，而且CDCP1的表達與腫瘤分期、組織學分級和轉移等進展性疾病指標顯著相關。到目前為止有關CDCP1在腫瘤細胞中的功能了解較少，但可明確其為上皮來源腫瘤抗原，并為高轉移性表皮樣癌的腫瘤相關蛋白。CDCP1在細胞與細胞之間及細胞與細胞基質間黏附中起重要作用。CDCP1通過與細胞內多種蛋白質相互作用而發(fā)揮其生物學作用，但目前還了解較少。能力的生物學特征了解的很少。而在正常的肺［10］、結腸［11］、睪丸等組織中檢測到CDCP1低水平表達。CDCP1也是白血病細胞［12］、骨髓和間充質干／祖細胞和神經(jīng)祖細胞［10］。

圖4 SDS－PAGE分析融合蛋白GST－CDCP1的表達

鑒于CDCP1為一種腫瘤相關抗原，且為跨膜蛋白，CDCP1是腫瘤診斷與治療的較理想的靶點［13］。最近應用基因工程抗CDCP1發(fā)現(xiàn)，靶向CDCP1阻斷腫瘤發(fā)展。在體外，該抗體阻斷前列腺癌PC－3細胞的遷移和侵襲［4］。

目前有關CDCP1在腫瘤發(fā)生發(fā)展作用及CDCP1信號傳導系統(tǒng)的研究較少。因此研制新型、價格適宜的CDCP1抗體有助于促進國內進行更廣泛深入的有關CDCP1生物學作用的研究。

本研究構建的重組質粒pGEX－K／CDCP1轉化大腸桿菌后經(jīng)IPTG誘導獲得高效表達。下一步將通過親和層析純化CDCP1－GST融合蛋白，經(jīng)免疫印記鑒定后免疫動物制備多克隆抗體，并通過B淋巴細胞雜交瘤技術制備單克隆抗體，抗體經(jīng)初步純化，選擇肺癌、結腸癌等組織標本和血液標本進行抗體特異性鑒定。

綜上所述，我們成功克隆了CDCP1胞外段基因序列并構建了pGEX－KG／CDCP1原核表達載體。本研究工作，為CDCP1抗體的制備奠定實驗基礎。

［1］Schneider M，Huber J，Hadaschi KB，et al.Characterization of colon cancer cells：a functional approach characterizing CD133as a potential stem cell marker［J］.BMC Cancer，2012，12：96.

［2］Park JJ，Jin YB，Lee YJ，et al.KAI1suppresses HIF－1aand VEGF expression by blocking CDCP1－enhanced Src activation in prostate cancer［J］.BMC Cancer，2012，12：81.

［3］Kollmorgen G，Bossenmaier B，Niederfellner G，et al.Structural requirements for cub domain containing protein 1（CDCP1）and Src dependent cell transformation［J］.Plos One，2012，7（12）：e53050.

［4］Sandvig K，Lorente A.Protemoic Analysis of Microvesicles Released by the Human Prostate Cancer Cell Line PC－3［J］.Mol Cell Protemics，2012，11（7）：M111.

［5］Liu H，Ong SE，Badu－Nkansah K，et al.CUB－domain－containing protein 1（CDCP1）activates Src to promote melanoma metastasis［J］.PNAS，2011，108（4）：1379.

［6］Razorenova OV，F(xiàn)inger EC，Colavitti R，et al.VHL loss in renal cell carcinoma leads to up－regulation of CUB domain－containing protein 1to stimulate PKCδ－driven migration［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2011，1085（5）：1931.

［7］Spassov DS，Wong CH，Harris G，et al.A tumor－suppressing function in the epithelial adhesion protein Trask［J］.Oncogene，2012，31（4）：419.

［8］Casar B，Rimann I，Kato H，et al.In vivo cleaved CDCP1promotes early tumor dissemination via complexing with activatedβ1integrin and induction of FAK／PI3K／Akt motility signaling［J］.Oncogene，2014，33（2）：255.

［9］M Scherl－Mostageer M，Sommerqruber W，Abseher R，et al.Identification of a novel gene，CDCP1，overexpressed in human colorectal cancer［J］.Oncogene，2001，20：4402.

［10］劉 銳，徐保鋒，王 清，等.一種新型肺癌細胞表面蛋白－CDCP1在肺癌患者中的表達及意義的獨立標志物［J］.中國實驗診斷學，2011，15（1）：75.

［11］Yousef I，Bréard J，SidAhmed－Adrav N，，et al.Infrared spectral signatures of CDCP1－induced effects in colon carcinoma cells［J］.Analyst，2011，136（24），5162.

［12］Gioia R，Leroy C，Druilion C，et al.Quantitative phosphoproteomics revealed interplay between Syk and Lyn in the resistance to nilotinib in chronic myeloid leukemia cells［J］.Blood，2011，118（8）：2211.

［13］Kollmorgena G，Niederfellner G，Lifke A，et al.Antibody mediated CDCP1degradation as mode of action for cancer targeted therapy［J］.Mol Oncol，2013，7（6）：1142.