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    一種基于光纖倏逝波生物傳感器檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌方法的建立

    2014-06-13 07:07:44劉金華孟日增聶丹丹王瑋琳王浩天
    關(guān)鍵詞:氏菌李斯特單核細(xì)胞

    劉金華,劉 韜,孟日增,聶丹丹,王瑋琳,王浩天

    (1.吉林出入境檢驗(yàn)檢疫局,吉林 長(zhǎng)春130062;2.吉林大學(xué)藥學(xué)院,吉林 長(zhǎng)春130021)

    單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogens,LM)是一種重要的食源性致病菌,他能引起人類和動(dòng)物李斯特氏菌病。人和動(dòng)物感染LM可引起單核細(xì)胞增多癥、腦膜炎、敗血癥和流產(chǎn),嚴(yán)重威脅人類健康和社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展[1,2]。該菌可通過(guò)眼睛及破損皮膚、粘膜進(jìn)入體內(nèi)而造成感染,該菌在4℃的環(huán)境中仍可生長(zhǎng)繁殖,也是冷藏食品中威脅人類健康的主要病原菌之一,因此,在衛(wèi)生微生物檢驗(yàn)中是一種重要的檢測(cè)目標(biāo)[3]。目前LM常用的檢測(cè)方法一般以生化培養(yǎng)鑒定、血清學(xué)檢測(cè)等為主[4]。光纖生物傳感器是激光技術(shù)和現(xiàn)代低消耗的光纖技術(shù)共同發(fā)展的產(chǎn)物,是目前應(yīng)用較為廣泛的生物傳感器之一[5,6]。本研究基于光纖倏逝波生物傳感器技術(shù)建立一種快速、高效檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的方法,該方法為L(zhǎng)M的衛(wèi)生檢驗(yàn)提供一種新的技術(shù)手段。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

    產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens,ATCC13124)、綿羊李斯特氏菌(listeria ivanovii,ATCC19119)、英諾克李斯特氏菌(listeria innocua,ATCC19119)、金 黃 色 葡 萄 球 菌 (Staphylococcus aureus,ATCC25923)、腸炎沙門氏菌(salmonella enteritidis,ATCC13076)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium,ATCC13311)、大 腸 埃 希 菌(Escherichia coli,ATCC25922)、蠟 樣 芽 胞 桿 菌(Bacillus cereus,ATCC11778))、單核細(xì)胞增生李斯 特 氏 菌 (Listeria monocytogens,LM,ATCC19111)、空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni,ATCC33291)等均為本實(shí)驗(yàn)室保存菌種。

    1.2 主要儀器與試劑

    光纖生物傳感器,聚苯乙烯光纖均由中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春光學(xué)精密機(jī)械研究所提供。LM多克隆抗體、LM單克隆抗體、納米量子點(diǎn)CdFe標(biāo)記的抗LM的多克隆抗體均由本實(shí)驗(yàn)室制備,磷酸鹽緩沖液PBS購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司,牛津瓊脂OXA、胰酪胨大豆酵母浸膏肉湯(TSB-YE)等LM培養(yǎng)基均購(gòu)自北京蘭伯瑞技術(shù)有限責(zé)任公司,1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽 (EDC)購(gòu)于北京晶美有限公司。

    1.3 CdTe量子點(diǎn)與LM多克隆抗體的偶聯(lián)

    取1ml的水溶性CdTe量子點(diǎn)與1ml PBS(pH=7.4)緩沖液混合,將400μl的LM多克隆抗體(1mg/ml)加入到上述混合液中,然后將100μl新制備的EDC溶液(4mg/ml)加入到混合液中,樣品在37℃培養(yǎng)箱中避光反應(yīng)2個(gè)小時(shí),然后4℃過(guò)夜。將2.5ml反應(yīng)混合液(包含1.0ml量子點(diǎn),1.0ml PBS,400μl抗體,100μl EDC)5 000r/min離心2min,取上清液,上清用截留分子量為100000的超濾膜反復(fù)進(jìn)行超濾,去除小分子物質(zhì)和未反應(yīng)的CdTe量子點(diǎn),收集超濾膜截留的CdTe-抗體偶聯(lián)物,然后用PBS(pH7.4)溶解,4℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.4 光纖的包被

    按Sai V V等人方法[7],對(duì)光纖進(jìn)行LM抗體包被,將光纖表面先用清洗液(濃HCl:乙醇體積比為1∶1)清洗10min,再用濃硫酸清洗10min,接下來(lái)在超純水中煮沸10min,使光纖表面具有親水的極化層。然后將處理好的光纖放入15μg/ml LM單抗的溶液中浸泡2h,取出用去離子水洗凈,即制成用于檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌光纖探針。

    1.5 檢測(cè)靈敏度的確定

    將LM菌株在TSB-YE液體培養(yǎng)基中42℃培養(yǎng)18h-24h。瓊脂平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。將包被LM的單克隆抗體的光纖分別插入濃度為3×100CFU/ml、3×101CFU/ml、3×102CFU/ml、3×103CFU/ml、3×104CFU/ml、3×105CFU/ml和3×106CFU/ml的LM菌溶液中孵育10min,加陰性對(duì)照,PBS清洗3遍后再與100μg/ml標(biāo)記量子點(diǎn)的多抗反應(yīng)10min,用去離子水洗凈上機(jī)測(cè)量結(jié)果。

    1.6 特異性試驗(yàn)

    用建立的方法對(duì)上述產(chǎn)氣莢膜梭菌、綿羊李斯特氏菌、英諾克李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、腸炎沙門氏菌、傷寒沙門氏菌、大腸埃希菌、蠟樣芽胞桿菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、空腸彎曲桿菌進(jìn)行特異性交叉試驗(yàn),同時(shí)設(shè)空白對(duì)照。

    1.7 人工添加樣品的檢測(cè)

    取雞肉25g加入225ml的TSB-YE液體培養(yǎng)基中,分別加入單核細(xì)胞增生李斯特菌懸液,使其濃度分別達(dá)到5CFU/ml,10CFU/ml,20CFU/ml,30CFU/ml,40CFU/ml,50CFU/ml。均質(zhì)后取2 ml上清,煮沸滅菌,各取1ml用于檢測(cè)。每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    將純培養(yǎng)的菌液用PBS緩沖液稀釋成3×100-3×106CFU/ml的濃度梯度,當(dāng)LM菌體濃度為3×101-3×106CFU/ml時(shí),可檢測(cè)到明顯的陽(yáng)性信號(hào);當(dāng)菌液濃度小于3×101CFU/ml時(shí)結(jié)果為陰性。故該方法對(duì)LM檢測(cè)的靈敏度可達(dá)到3×101CFU/ml,見(jiàn)圖1。

    圖1 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌靈敏度的檢驗(yàn)

    2.2 特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    用建立的光纖倐逝波生物傳感器分別對(duì)105CFU/ml不同菌株的菌液檢測(cè),顯示該方法對(duì)于單核細(xì)胞增生李斯特氏菌具有較好的特異性,可以得到較明顯信號(hào)。其他菌株的檢測(cè)結(jié)果均為陰性,結(jié)果見(jiàn)圖2。

    圖2 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌特異性的檢驗(yàn)

    2.3 人工添加樣品的檢測(cè)

    將標(biāo)準(zhǔn)LM稀釋到一定濃度加入雞肉中,檢測(cè)結(jié)果如表1所示,其檢測(cè)靈敏度可達(dá)到30CFU/ml,即在樣品中若含有30CFU/ml的在單核細(xì)胞增生李斯特氏菌即可被檢出,而對(duì)于20CFU/mL的濃度的樣品3次檢測(cè)中可能有1-2次結(jié)果為陽(yáng)性。

    表1 人工感染樣品檢測(cè)結(jié)果

    3 討論

    光纖倏逝波生物傳感器是以光纖和光電轉(zhuǎn)換器件為主要轉(zhuǎn)換元件的一種光電轉(zhuǎn)換設(shè)備[8],他主要是利用倏逝波場(chǎng)來(lái)激發(fā)光纖表面標(biāo)記在生物分子上的熒光染料,從而檢測(cè)通過(guò)特異性反應(yīng)附著于纖芯表面倏逝波場(chǎng)范圍內(nèi)的生物分子[9,10]。由于倏逝波是光在光纖中以全反射傳播時(shí)產(chǎn)生的部分穿透界面的光波,他只存在于界面附近薄層內(nèi),只對(duì)來(lái)自光纖界面附近極薄的一層熒光分子進(jìn)行熒光激發(fā)和收集,而樣品中游離的熒光分子則幾乎不會(huì)被激發(fā)和收集,這樣便省去了傳統(tǒng)生化檢測(cè)方法中繁冗復(fù)雜的清洗步驟,簡(jiǎn)化了操作步驟,將檢測(cè)時(shí)間從常規(guī)分析的幾個(gè)小時(shí)縮短到十幾分鐘,大大縮短了檢測(cè)時(shí)間提高了檢測(cè)效率[11,12]。

    當(dāng)光纖倏逝波生物傳感器檢測(cè)目標(biāo)菌時(shí),光纖表面固定的生物識(shí)別分子抗體與目標(biāo)菌發(fā)生特異性反應(yīng),進(jìn)而與熒光染料標(biāo)記的檢測(cè)抗體結(jié)合,使熒光染料固定于光纖表面,倏逝波激發(fā)出熒光,其中部分熒光進(jìn)入光纖,通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)換器將光信號(hào)轉(zhuǎn)換為物理信號(hào),之后經(jīng)過(guò)放大處理,獲得數(shù)據(jù)。通過(guò)檢測(cè)是否激發(fā)出熒光信號(hào)及熒光信號(hào)的強(qiáng)度大小來(lái)分析待測(cè)物的有無(wú)及含量。與其他生物檢測(cè)手段相比,光纖生物傳感器具有如下優(yōu)點(diǎn):首先該方法不受光纖表面倏逝波場(chǎng)以外的生物分子的干擾具有較高的檢測(cè)靈敏度;其次該技術(shù)操作簡(jiǎn)單,測(cè)量用時(shí)較短可應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)[9]。在本研究試驗(yàn)中,用納米量子點(diǎn)做熒光標(biāo)記物,相對(duì)于傳統(tǒng)的有機(jī)熒光染料來(lái)說(shuō),納米量子點(diǎn)具有更高的靈敏性和穩(wěn)定性。使用納米量子點(diǎn)代替?zhèn)鹘y(tǒng)的熒光染料檢測(cè)病原微生物,能夠獲得了更強(qiáng)的熒光強(qiáng)度,更長(zhǎng)的發(fā)光時(shí)間以及能夠?qū)晒庑盘?hào)更精確的檢出,從而使得大大的提高了檢測(cè)的靈敏度。本實(shí)驗(yàn)中,完成一次檢測(cè)過(guò)程只需30 min,而且該檢測(cè)方法具有較高的靈敏度和較好的特異性,使得該技術(shù)具有較好的應(yīng)用前景。

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