耳蝸局部應(yīng)用NR2B受體阻滯劑對(duì)水楊酸鈉致豚鼠螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷的拮抗作用*

劉淵 尹時(shí)華 黃訓(xùn)健 周琦 舒競(jìng)鋮 韋順蓮

耳鳴、聽力下降和言語認(rèn)知能力減低是水楊酸鈉對(duì)聽覺系統(tǒng)毒副作用最明顯的三大癥狀[1]，其中，耳鳴及聽力下降的原因還不明確。早期研究發(fā)現(xiàn)，大劑量給予水楊酸鈉可引起豚鼠螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡以及聽力損失，且凋亡率與聽力損失程度呈平行關(guān)系[2]，但其凋亡機(jī)制還不甚明了。有研究表明，N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDA受體)過度活化引起大量Ca2+內(nèi)流是水楊酸鈉致耳鳴的重要原因[3，4]，細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載與細(xì)胞凋亡有著密切聯(lián)系[5]，那么，NMDA受體過度激活是否也參與了水楊酸鈉致豚鼠螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡的過程呢？為此，本研究通過在豚鼠圓窗龕局部給予艾芬地爾(ifenprodil)(NMDA受體NR2B亞型的一種特異性受體阻滯劑[6])聯(lián)合腹腔注射水楊酸鈉，通過檢測(cè)給藥前后各組豚鼠ABR閾值、耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞內(nèi)caspase-3蛋白的表達(dá)及螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡率，探討耳蝸局部特異性阻斷NR2B受體是否可以拮抗水楊酸鈉致豚鼠螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的損傷。報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組處理 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為耳廓反應(yīng)靈敏、未暴露于噪聲及耳毒性藥物環(huán)境的健康花色豚鼠(廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)，實(shí)驗(yàn)前，應(yīng)用美國 TDT(Tucker Davis Technologies) 電生理測(cè)試系統(tǒng)進(jìn)行雙側(cè) ABR 測(cè)試，選取反應(yīng)閾小于40 dB SPL的豚鼠48只，隨機(jī)分為四組，每組12只。 Ⅰ組為空白對(duì)照組；Ⅱ組為人工外淋巴液(artificial perilymph，APL)組，左耳圓窗龕注人APL 60 μl；Ⅲ組為水楊酸鈉組，左耳圓窗龕注入APL 60 μl，腹腔注射水楊酸鈉；IV組為艾芬地爾組，左耳圓窗龕注入溶于APL的艾芬地爾(10 μmol/l)60 μl后，腹腔注射水楊酸鈉。于水楊酸鈉給藥前12 h圓窗龕給藥，水楊酸鈉注射量為400 mg·kg-1·d-1，連續(xù)注射 7 天。

1.2聽性腦干反應(yīng)檢測(cè) 于實(shí)驗(yàn)前及給藥結(jié)束后動(dòng)物處死前用美國TDT系統(tǒng)(Tucker Davis Technologies)對(duì)豚鼠雙耳分別進(jìn)行 ABR 測(cè)試。1%戊巴比妥鈉溶液對(duì)豚鼠行腹腔注射麻醉 (35 mg/kg)，而后將其置于屏蔽倉內(nèi)，記錄電極扎入額頂正中，參考電極接同側(cè)耳廓，鼻尖接地。插入式耳機(jī)給聲，短聲刺激，刺激率21.1次/秒，帶通濾波 300～3 000 Hz ，觀察時(shí)程20 ms ，疊加次數(shù)1 024次。最大輸出為110 dB SPL, 以10或5 dB遞減或遞增，以能引出明確的、可重復(fù)波III的最小刺激強(qiáng)度為ABR反應(yīng)閾。

1.3豚鼠圓窗龕局部給藥 用1%戊巴比妥鈉35 mg/kg對(duì)豚鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉后，固定于自制的動(dòng)物固定架上。常規(guī)消毒，左耳后下方做一弧形切口，鈍性分離組織，暴露聽泡，乳突尖骨質(zhì)鉆孔，看清圓窗龕，將浸泡于60 μl含有艾芬地爾(Sigma公司，10 μmol/L)的人工外淋巴液(APL，含NaCl 137、KCl 5、CaCl22、NaH2PO41 、Glucose 11、NaHCO312、MgCl21，pH 7.4±0.2)中的明膠海綿置于圓窗龕，用骨蠟封閉聽泡，逐層縫合。

1.4標(biāo)本取材及制備 最后一次ABR檢測(cè)(于最后一次水楊酸鈉給藥后的12 h時(shí)進(jìn)行)結(jié)束后立即行過量麻醉斷頭處死豚鼠，迅速取出顳骨，打開聽泡，暴露耳蝸，置于4%多聚甲醛0.01 M PBS(pH=7.4)固定液中，在解剖顯微鏡下挑破圓窗，取出鐙骨，于蝸尖處挑開一小孔，用微玻璃吸管由蝸頂灌注固定液1～2 min，可見固定液經(jīng)前庭階和鼓階由前庭窗和圓窗流出，再將標(biāo)本浸置于該固定液中，置4 ℃冰箱內(nèi)繼續(xù)固定6小時(shí)。0.1 M PBS浸洗過夜。10%脫鈣液脫鈣4周。梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟定向包埋后平行耳蝸縱軸連續(xù)切片，片厚5 μm，分別進(jìn)行TUNEL陽性細(xì)胞檢測(cè)(每組6只)及caspase-3免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)(每組6只)。

1.5Caspase-3免疫組織化學(xué)染色 切片置于60 ℃恒溫烤箱30 min；常規(guī)石蠟切片二甲苯脫蠟和梯度酒精水化；自來水沖洗，0.01M PBS(pH7.4)浸洗3次×3 min；切片置于0.01 M枸櫞酸緩沖液(pH=6.0)放入高壓鍋高壓修復(fù)2 min，0.01 M PBS浸洗3次×3 min；3%H2O2室溫孵育10 min，0.01 M PBS浸洗3次×3 min；每個(gè)標(biāo)本滴加50 μl(1:50)抗caspase-3兔源單克隆抗體(Proteintech公司)4 ℃過夜，0.01 M PBS浸洗3次×5 min；滴加山羊抗兔IgG/辣根過氧化物酶標(biāo)記(中杉金橋公司)，置于37 ℃恒溫烤箱中孵育30 min，0.01 M PBS浸洗3次×5 min；DAB(中杉金橋公司)顯色，自來水沖洗終止反應(yīng)；蘇木素復(fù)染，自來水沖洗終止反應(yīng)，自來水反藍(lán)10 min；梯度酒精脫水，二甲苯透明，烤干，中性樹脂封片。

1.6TUNEL染色方法 切片置于60 ℃恒溫烤箱30 min；常規(guī)石蠟切片二甲苯脫蠟和梯度酒精水化；自來水沖洗，PBS浸洗3次×3 min；新鮮3% H2O2甲醇溶液室溫處理10 min，滅活內(nèi)源性過氧化物酶，0.01 M PBS(pH7.4)浸洗3次×3 min；蛋白酶K消化，37 ℃孵育30 min，0.01 M PBS浸洗3次×3 min；吸水紙吸干周圍液體，加50 μl TUNEL反應(yīng)混合物(Roche公司)，置于濕盒中37 ℃孵育60 min,0.01 M PBS浸洗3次×5 min；加轉(zhuǎn)換劑POD(Roche公司)，置于濕盒中37 ℃孵育30 min，0.01 M PBS浸洗3次×5 min；DAB(中杉金橋公司)顯色，自來水沖洗終止反應(yīng)；蘇木素復(fù)染，自來水沖洗終止反應(yīng)，自來水反藍(lán)；梯度酒精脫水，二甲苯透明，烤干，中性樹脂封片。

TUNEL陽性反應(yīng)：光鏡下正常螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞核呈藍(lán)色，凋亡螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞核呈深淺不一的棕黃色，并且出現(xiàn)核固縮，染色質(zhì)濃集。螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡指數(shù)(apoptosis index,AI)=TUNEL陽性著色SGN細(xì)胞數(shù)/總SGN細(xì)胞數(shù)。

1.7圖像分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 caspase-3染色切片在400倍視野下由Image-Pro Plus 6.0 專業(yè)圖像分析軟件測(cè)定累積光密度值(integrated optical density ， IOD)和面積(area)，并計(jì)算平均光密度值 (average optical density，AOD) ，平均光密度值越高，表達(dá)水平越高，凋亡效應(yīng)用凋亡率評(píng)價(jià)。組間進(jìn)行單因素方差檢驗(yàn)，組內(nèi)進(jìn)行SNK檢驗(yàn)。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)資料均采用SPSS 16.0專用統(tǒng)計(jì)軟件包分析。

2 結(jié)果

2.1給藥后各組動(dòng)物ABR閾值比較 給藥后I、II組動(dòng)物ABR閾值分別為31.67±5.16和33.33±5.17 dB SPL，I、II組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，III組ABR閾值為64.17±7.36 dB SPL，較I、II組明顯升高(P<0.01)，IV組為49.17±5.85 dB SPL，較I、II組顯著升高(P<0.01)，但較III組顯著降低(P<0.01)。

2.2各組Caspase-3表達(dá)比較 I、II組動(dòng)物螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中無明顯著色，其平均光密度值分別為0.105 7±0.008 1和0.106 3±0.007 2，III組SGN細(xì)胞著色明顯，平均光密度值為0.3251±0.015 8，IV組SGN細(xì)胞著色明顯減弱，平均光密度值為0.197 3±0.014 5(圖1)。

2.3各組TUNEL染色結(jié)果 I、II組動(dòng)物螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞無明顯凋亡，凋亡率分別為4.35%±1.49%和5.25%±1.47%，III組SGN細(xì)胞凋亡明顯，凋亡率為76.62%±2.55%，IV組SGN細(xì)胞凋亡率為35.29%±3.51%，較III組明顯降低(圖2)。

圖1 各組動(dòng)物螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中Caspase-3的表達(dá) a～d分別為I～I(xiàn)V組(×400)

圖2 各組動(dòng)物螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡染色結(jié)果 a～d分別為I～I(xiàn)V組(×400)

3 討論

螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞是聯(lián)系耳蝸與聽覺中樞的樞紐，其中95%為Ι型螺旋神經(jīng)節(jié)，它與內(nèi)毛細(xì)胞形成的突觸連接以谷氨酸為神經(jīng)遞質(zhì)將耳蝸編碼的聽覺信息傳入聽覺中樞。正常情況下，這種突觸間的遞質(zhì)傳遞是由α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸受體(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid receptor, AMPAR)介導(dǎo)的[7]。值得注意的是，螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞表面也有NMDA受體表達(dá)，雖然該受體并不參與正常情況下神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞，但研究顯示這些受體在耳蝸興奮性毒性損傷的突觸修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用[8]。NMDA受體在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的生理作用,其可調(diào)節(jié)神經(jīng)元的存活,調(diào)節(jié)神經(jīng)元樹突、軸突結(jié)構(gòu)發(fā)育及參與突觸可塑性的形成等[9]。NMDA受體屬于配體門控離子通道,是由不同的亞單位組成的四聚體或五聚體,編碼這些亞單位的基因?qū)?個(gè)家族:NR1、NR2(包括NR2A～D)、NR3(包括NR3A、B)。NR1是NMDA受體復(fù)合物的功能性亞單位,單獨(dú)的NR2或NR3不能形成功能性受體，但它們可以和NR1聚合形成功能性復(fù)合物，由不同的亞單位組成的受體往往表現(xiàn)出不同的生理學(xué)和藥理學(xué)特性，最典型的就是由NR1和NR2B亞單位形成異聚體NR1/NR2B，其對(duì)Ca2+有高通透性[10]，可被艾芬地爾選擇性阻斷。

研究發(fā)現(xiàn)NMDA受體的激活是細(xì)胞死亡的主要原因，這種細(xì)胞死亡繼發(fā)于急性興奮性的損傷[11]。生理狀態(tài)下各谷氨酸優(yōu)先興奮NMDA受體，在病理狀態(tài)下，某些不被激活的NR1/NR2B受體亞型被激活，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[12]。NR2B受體的高表達(dá)可能改變NMDA受體的結(jié)構(gòu)，功能及組成的改變，使離子通道的通透性異常增高，導(dǎo)致Ca2+超載，病理性Ca2+內(nèi)流會(huì)導(dǎo)致Ca2+依賴的一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase，nNOS)和磷脂酶A2的激活以及線粒體的功能失調(diào)[13～15]，從而引起活性氧/氮及自由基的增加，最終導(dǎo)致細(xì)胞損傷。另外，線粒體內(nèi)Ca2+上調(diào)可以提高ROS產(chǎn)物及細(xì)胞色素C的釋放，這些產(chǎn)物是凋亡小體的變構(gòu)及caspase-3活化所必需的，其結(jié)果是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[16]。caspase-3是凋亡發(fā)生過程中時(shí)常被激活的一種蛋白酶，能催化細(xì)胞中許多關(guān)鍵蛋白質(zhì)的水解，caspase-3參與所有細(xì)胞凋亡過程中染色質(zhì)的凝集和DNA碎裂的過程。因此，它是細(xì)胞裂解及凋亡小體形成這一特殊過程的重要參與者[17]。

艾芬地爾是一種可與NMDA受體NR2B亞型高度選擇性結(jié)合的有機(jī)化合物，它通過阻斷NMDA受體的功能從而在動(dòng)物大腦缺血模型及損傷模型中發(fā)揮著神經(jīng)保護(hù)作用；同時(shí)，它也在由谷氨酸及低氧損傷所致的細(xì)胞毒性過程中發(fā)揮著重要的保護(hù)作用[18]。有研究顯示，艾芬地爾可以阻斷由谷氨酸及NMDA引起的海馬細(xì)胞及視網(wǎng)膜細(xì)胞的興奮性損傷[19]。但艾芬地爾的這種保護(hù)作用的機(jī)制還存在爭(zhēng)議，以Tamura為代表的學(xué)者認(rèn)為亞精胺等內(nèi)源性多胺可與結(jié)合于NMDA受體復(fù)合結(jié)構(gòu)的多胺調(diào)節(jié)位點(diǎn)相互作用，從而促進(jìn)谷氨酸對(duì)NMDA受體的激活過程，而艾芬地爾正是通過阻斷多胺對(duì)這一激活過程的陽性調(diào)節(jié)作用從而非競(jìng)爭(zhēng)性的阻斷NMDA受體的功能[20～22]。而另一些學(xué)者[23]則認(rèn)為艾芬地爾并不是與多胺位點(diǎn)相互作用而是通過直接與NMDA受體作用發(fā)揮其細(xì)胞保護(hù)作用的。

本研究通過觀察腹腔注射水楊酸鈉后豚鼠耳蝸局部應(yīng)用NR2B受體阻滯劑艾芬地爾后，SGN中caspase-3的表達(dá)情況及TUNEL法檢測(cè)SGN凋亡率，發(fā)現(xiàn)艾芬地爾明顯阻斷了水楊酸鈉引起的螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡，其機(jī)制可能與艾芬地爾選擇性的與NMDA受體的NR2B亞型結(jié)合，從而抑制由NMDA受體過度興奮促發(fā)的Ca2+內(nèi)流有關(guān)。有研究顯示[24]，在離體培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元中加入艾芬地爾可以阻斷高電壓激活鈣通道，這種作用正是通過阻斷NMDA受體實(shí)現(xiàn)的。

目前，對(duì)艾芬地爾的細(xì)胞保護(hù)作用機(jī)制還知之甚少，目前國內(nèi)外的研究還僅僅停留在其與NMDA受體相互作用的水平，但這一保護(hù)過程的具體分子作用機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。

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