西藏靈芝多糖的提取工藝研究

林秀仙　李菁　陳亮等

[摘要] 目的 優(yōu)化西藏靈芝多糖的提取工藝。 方法 以蒽酮-硫酸法作為靈芝多糖含量的測定方法，以多糖提取得率為考察指標(biāo)，對浸提過程中的溫度、時(shí)間、次數(shù)以及料液比4個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)。 結(jié)果 靈芝多糖的最佳提取條件為提取溫度100 ℃，浸提時(shí)間2 h，浸提次數(shù)3次，料液比為1∶30。 結(jié)論 該提取工藝條件穩(wěn)定，重現(xiàn)性好，可為西藏靈芝多糖的大生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] 西藏靈芝；多糖；提取工藝；含量測定

[中圖分類號(hào)] R931.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2014）04（b）-0008-04

[Abstract] Objective To optimize the extraction process for polysaccharides from Ganoderma lucidum of Tibet. Methods Anthrone-sulphuric acid method was used to dectect the content of polysaccharides，extraction rate of polysaccharides was took as inspection indicator，four factors such as temperature，time，number of times and ratio of material to liquid in the leaching process was conducted single-factor test and orthogonal test. Results The optimum temperature of extracting was 100℃，the optimum times of extracting was 2 times，the optimum extracting time was 2 h and ratio of material to liquid was 1∶30 of Ganoderma lucidum polysaccharides. Conclusion The condition of extracting process are stable and it is reproducible，which can provide reference for preparation of polysaccharides from Ganoderma lucidum of Tibet.

[Key words] Ganoderma lucidum of Tibet；Polysaccharides；Extraction process；Content determination

西藏靈芝Ganoderma lucidum Sheng H. Wu， Y. Cao& Y. C. Dai是廣義赤芝Ganoderma lucidum （Curtis） P. Karst.的復(fù)合群成員，是目前我國普遍使用的食藥用赤芝品種。

本公司選取了3個(gè)種屬的靈芝[西藏靈芝、西藏野生靈芝（松杉靈芝）Ganoderma tsugae Murrill和紫芝Ganoderma sinense Zhao，Xu et Zhang]在西藏基地進(jìn)行試種植。為了確定西藏靈芝、西藏野生靈芝（松杉靈芝）和紫芝3個(gè)品種的哪一種更適宜在本公司的西藏基地生長，開展了靈芝多糖的提取工藝優(yōu)化研究，比較不同品種靈芝的生長形態(tài)和多糖含量，為西藏基地種植靈芝提供選種依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料

西藏靈芝、松杉靈芝、紫芝（廣州白云山漢方現(xiàn)代藥業(yè)有限公司），D-無水葡萄糖對照品（中國藥品生物制品檢定所，0833-9501），95%乙醇（醫(yī)用級(jí)），水為蒸餾水，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器

R-201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申科機(jī)械研究所），YZG-1000A型真空干燥機(jī)（常州市范群干燥設(shè)備有限公司），BS210S型電子天平（德國賽多利斯），UV-2550型紫外分光光度計(jì)（日本島津公司），LXJ-IIB低速大容量多管離心機(jī)（上海棱譜儀器儀表有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 3種靈芝的形態(tài)比較和多糖含量的檢驗(yàn)

多糖含量檢驗(yàn)方法參照中國藥典2010年一部靈芝項(xiàng)下測定方法[1]。3種靈芝的形態(tài)比較和多糖含量檢驗(yàn)結(jié)果見圖1、表1。從圖1和表2可知，在西藏種植的紫芝可能由于水土不服，發(fā)育不良，菌蓋不完整，多糖含量也未符合中國藥典標(biāo)準(zhǔn)，遠(yuǎn)低于另外兩種；松杉靈芝的菌蓋很薄，孢子粉彈射很少，但多糖含量高于另外兩種靈芝；西藏靈芝的生長形態(tài)最好，多糖含量符合中國藥典標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 提取工藝研究[2-14]

多糖常用熱水浸提法提取。影響熱水浸提法的因素有提取溫度、提取時(shí)間、料液比和提取次數(shù)等，本研究對這4個(gè)因素分別進(jìn)行了單因素和正交試驗(yàn)，優(yōu)化最佳的提取工藝參數(shù)。

2.2.1 料液比考察 精密稱取靈芝粗粉4份，每份5 g，分別置250 ml圓底燒瓶中，按照料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40加水回流提取1 h，濾過，濾液分別定容至250 ml，取適量濾液，測定多糖的含量，觀察不同料液比對多糖提取得率的影響（圖2）。從圖2可知，隨著料液比的增加，多糖提取得率增高，但當(dāng)料液比大于1∶30時(shí)，多糖提取得率增高不顯著。

2.2.2 提取時(shí)間的考察 精密稱取靈芝粗粉4份，每份5 g，置150 ml圓底燒瓶中，分別加水125 ml，回流提取1、1.5、2、2.5 h，濾過，濾液分別定容至250 ml，取適量濾液，測定多糖的含量，觀察不同提取時(shí)間對多糖提取得率的影響（圖3）。從圖3可知，隨著提取時(shí)間的延長，多糖提取得率逐漸增高，提取2 h即可將靈芝子實(shí)體中多糖提取較完全，這是因?yàn)榻n有利于溶劑浸入細(xì)胞壁內(nèi)，使之充分溶脹，利于有效成分進(jìn)入溶劑相中，時(shí)間太長，可能引起結(jié)構(gòu)的變化和破壞，甚至使其中的五碳環(huán)或六碳環(huán)裂解，導(dǎo)致多糖含量下降。

2.2.3 提取溫度的考察 精密稱取靈芝粗粉3份，每份5 g，置于250 ml燒杯中，加水200 ml，分別設(shè)定溫度為60、80、100℃，加熱回流提取1次，濾過，濾液分別定容至250 ml，取適量濾液，測定多糖的含量，觀察不同提取溫度對多糖提取得率的影響（圖4）。從圖4可知，提取溫度對提取工藝有很大的影響，溫度升高，多糖得率迅速增高，而且多糖的溶解性較差，生產(chǎn)上通常需要沸水才能使其提取完全，因此，考慮到企業(yè)機(jī)械化生產(chǎn)的需要，提取溫度采用100℃。

2.2.4 提取工藝的正交試驗(yàn) 精密稱取靈芝粗粉9份，每份10 g，設(shè)定提取溫度為100℃，分別按表2 L9（34）正交試驗(yàn)因素水平表的條件進(jìn)行提取，濾過，濾液定容成500 ml，取適量濾液，測定多糖的含量，計(jì)算多糖轉(zhuǎn)移率。以多糖轉(zhuǎn)移率為指標(biāo)，對料液比、提取時(shí)間和提取次數(shù)3個(gè)因素進(jìn)行考察，以確定靈芝多糖的最佳提取條件。多糖轉(zhuǎn)移率=被提取出來的多糖量（g）/藥材量（g）/藥材的多糖含量（%）×100%，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果見表3，表4。從表3正交試驗(yàn)結(jié)果可知，不同的因素水平組合對多糖提取有一定的影響，其中轉(zhuǎn)移率最高為99.38%，最低為23.20%。由表4方差分析表可知，以D因素項(xiàng)為誤差項(xiàng)進(jìn)行方差分析，結(jié)果C因素對結(jié)果有顯著差異，A、B因素對結(jié)果影響甚微。

由直觀分析可知，A、B、C 3因素對多糖轉(zhuǎn)移率的影響大小為A

3 討論

本研究中單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著料液比的增加，多糖提取得率增高，當(dāng)料液比>1∶30時(shí)，多糖提取得率增高不顯著；多糖提取得率隨提取時(shí)間增加而增高，但提取超過2 h后，多糖提取得率呈現(xiàn)平緩趨勢；提取溫度升高，多糖提取得率也顯著增高。正交試驗(yàn)結(jié)果表明：西藏靈芝多糖的最佳提取工藝條件為料液比為1∶30，提取時(shí)間為2 h，提取次數(shù)為3次。

在靈芝培養(yǎng)基中，隨著靈芝菌絲體的生長和成熟，靈芝多糖的含量逐步增加，直到開傘期達(dá)到最高值，從孢子彈射期后，含量急劇下降[15-16]。本公司在西藏種植的3種靈芝多糖含量大小為松杉靈芝>西藏靈芝>紫芝，其中，松杉靈芝由于已完全開傘，而且?guī)缀鯖]有孢子粉，包子無彈射，因此多糖含量最高，而紫芝由于發(fā)育不良，菌傘沒開，因此多糖含量最低，因此，在種植靈芝時(shí)，應(yīng)根據(jù)不同目的，需要的是孢子粉還是靈芝多糖，其采收期也應(yīng)有所不同。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典[M].一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：174-175.

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[6] 馬明輝，呂麗娟，貢濟(jì)宇，等.靈芝提取工藝的研究[J].長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，23（3）：24-25.

[7] 禹建春，羅向華，吳昌枝，等.靈芝多糖的提取工藝研究[J].海峽藥學(xué)，2012，24（8）：25-26

[8] 黃純，高向東，龐秀炳，等.靈芝多糖的提取工藝優(yōu)化[J].江蘇藥學(xué)與臨床研究，2005，13（6）：66-67.

[9] 劉春泉，宋江峰，李大婧，等.響應(yīng)曲面法優(yōu)選靈芝實(shí)體多糖的提取工藝[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2007，23（3）：239-243.

[10] 陳乃東，陳瓊，何健.正交試驗(yàn)優(yōu)選靈芝多糖的提取工藝[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（19）：8146-8148.

[11] 周吳萍，杜文佳.靈芝多糖提取工藝的優(yōu)化[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，52（15）：3632-3634.

[12] 閆雪蓮.提取靈芝活性多糖最佳工藝研究[J].中國科技博覽，2012，（30）：275.

[13] 陳凌華，程祖鋅，楊志堅(jiān)，等.靈芝多糖熱水提取條件的優(yōu)化試驗(yàn)[J].浙江食用菌，2009，17（4）：21-23.

[14] 劉英梅，李春華，陳鴻雁.靈芝孢子粉中多糖提取工藝的研究[J].中成藥，2006，28（3）：332-335.

[15] 韋會(huì)平，李學(xué)剛，蒲盛才，等.靈芝生長過程中靈芝多糖含量變化規(guī)律研究[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2006，34（5）：10-12.

[16] 史俊青，張麗萍，楊春清，等.不同品種靈芝多糖含量差異研究[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010，16（13）：104-106.

（收稿日期：2014-03-03 本文編輯：許俊琴）

2.2.3 提取溫度的考察 精密稱取靈芝粗粉3份，每份5 g，置于250 ml燒杯中，加水200 ml，分別設(shè)定溫度為60、80、100℃，加熱回流提取1次，濾過，濾液分別定容至250 ml，取適量濾液，測定多糖的含量，觀察不同提取溫度對多糖提取得率的影響（圖4）。從圖4可知，提取溫度對提取工藝有很大的影響，溫度升高，多糖得率迅速增高，而且多糖的溶解性較差，生產(chǎn)上通常需要沸水才能使其提取完全，因此，考慮到企業(yè)機(jī)械化生產(chǎn)的需要，提取溫度采用100℃。

2.2.4 提取工藝的正交試驗(yàn) 精密稱取靈芝粗粉9份，每份10 g，設(shè)定提取溫度為100℃，分別按表2 L9（34）正交試驗(yàn)因素水平表的條件進(jìn)行提取，濾過，濾液定容成500 ml，取適量濾液，測定多糖的含量，計(jì)算多糖轉(zhuǎn)移率。以多糖轉(zhuǎn)移率為指標(biāo)，對料液比、提取時(shí)間和提取次數(shù)3個(gè)因素進(jìn)行考察，以確定靈芝多糖的最佳提取條件。多糖轉(zhuǎn)移率=被提取出來的多糖量（g）/藥材量（g）/藥材的多糖含量（%）×100%，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果見表3，表4。從表3正交試驗(yàn)結(jié)果可知，不同的因素水平組合對多糖提取有一定的影響，其中轉(zhuǎn)移率最高為99.38%，最低為23.20%。由表4方差分析表可知，以D因素項(xiàng)為誤差項(xiàng)進(jìn)行方差分析，結(jié)果C因素對結(jié)果有顯著差異，A、B因素對結(jié)果影響甚微。

由直觀分析可知，A、B、C 3因素對多糖轉(zhuǎn)移率的影響大小為A

3 討論

本研究中單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著料液比的增加，多糖提取得率增高，當(dāng)料液比>1∶30時(shí)，多糖提取得率增高不顯著；多糖提取得率隨提取時(shí)間增加而增高，但提取超過2 h后，多糖提取得率呈現(xiàn)平緩趨勢；提取溫度升高，多糖提取得率也顯著增高。正交試驗(yàn)結(jié)果表明：西藏靈芝多糖的最佳提取工藝條件為料液比為1∶30，提取時(shí)間為2 h，提取次數(shù)為3次。

在靈芝培養(yǎng)基中，隨著靈芝菌絲體的生長和成熟，靈芝多糖的含量逐步增加，直到開傘期達(dá)到最高值，從孢子彈射期后，含量急劇下降[15-16]。本公司在西藏種植的3種靈芝多糖含量大小為松杉靈芝>西藏靈芝>紫芝，其中，松杉靈芝由于已完全開傘，而且?guī)缀鯖]有孢子粉，包子無彈射，因此多糖含量最高，而紫芝由于發(fā)育不良，菌傘沒開，因此多糖含量最低，因此，在種植靈芝時(shí)，應(yīng)根據(jù)不同目的，需要的是孢子粉還是靈芝多糖，其采收期也應(yīng)有所不同。

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[4] 李艷，趙海燕，呂建寧.靈芝多糖提取工藝研究[J].中成藥，2006，28（7）：1052-1054.

[5] 干偉偉，常繼東.靈芝多糖的響應(yīng)曲面法優(yōu)化研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（1）：259-262.

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[7] 禹建春，羅向華，吳昌枝，等.靈芝多糖的提取工藝研究[J].海峽藥學(xué)，2012，24（8）：25-26

[8] 黃純，高向東，龐秀炳，等.靈芝多糖的提取工藝優(yōu)化[J].江蘇藥學(xué)與臨床研究，2005，13（6）：66-67.

[9] 劉春泉，宋江峰，李大婧，等.響應(yīng)曲面法優(yōu)選靈芝實(shí)體多糖的提取工藝[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2007，23（3）：239-243.

[10] 陳乃東，陳瓊，何健.正交試驗(yàn)優(yōu)選靈芝多糖的提取工藝[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（19）：8146-8148.

[11] 周吳萍，杜文佳.靈芝多糖提取工藝的優(yōu)化[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，52（15）：3632-3634.

[12] 閆雪蓮.提取靈芝活性多糖最佳工藝研究[J].中國科技博覽，2012，（30）：275.

[13] 陳凌華，程祖鋅，楊志堅(jiān)，等.靈芝多糖熱水提取條件的優(yōu)化試驗(yàn)[J].浙江食用菌，2009，17（4）：21-23.

[14] 劉英梅，李春華，陳鴻雁.靈芝孢子粉中多糖提取工藝的研究[J].中成藥，2006，28（3）：332-335.

[15] 韋會(huì)平，李學(xué)剛，蒲盛才，等.靈芝生長過程中靈芝多糖含量變化規(guī)律研究[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2006，34（5）：10-12.

[16] 史俊青，張麗萍，楊春清，等.不同品種靈芝多糖含量差異研究[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010，16（13）：104-106.

（收稿日期：2014-03-03 本文編輯：許俊琴）

2.2.3 提取溫度的考察 精密稱取靈芝粗粉3份，每份5 g，置于250 ml燒杯中，加水200 ml，分別設(shè)定溫度為60、80、100℃，加熱回流提取1次，濾過，濾液分別定容至250 ml，取適量濾液，測定多糖的含量，觀察不同提取溫度對多糖提取得率的影響（圖4）。從圖4可知，提取溫度對提取工藝有很大的影響，溫度升高，多糖得率迅速增高，而且多糖的溶解性較差，生產(chǎn)上通常需要沸水才能使其提取完全，因此，考慮到企業(yè)機(jī)械化生產(chǎn)的需要，提取溫度采用100℃。

2.2.4 提取工藝的正交試驗(yàn) 精密稱取靈芝粗粉9份，每份10 g，設(shè)定提取溫度為100℃，分別按表2 L9（34）正交試驗(yàn)因素水平表的條件進(jìn)行提取，濾過，濾液定容成500 ml，取適量濾液，測定多糖的含量，計(jì)算多糖轉(zhuǎn)移率。以多糖轉(zhuǎn)移率為指標(biāo)，對料液比、提取時(shí)間和提取次數(shù)3個(gè)因素進(jìn)行考察，以確定靈芝多糖的最佳提取條件。多糖轉(zhuǎn)移率=被提取出來的多糖量（g）/藥材量（g）/藥材的多糖含量（%）×100%，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果見表3，表4。從表3正交試驗(yàn)結(jié)果可知，不同的因素水平組合對多糖提取有一定的影響，其中轉(zhuǎn)移率最高為99.38%，最低為23.20%。由表4方差分析表可知，以D因素項(xiàng)為誤差項(xiàng)進(jìn)行方差分析，結(jié)果C因素對結(jié)果有顯著差異，A、B因素對結(jié)果影響甚微。

由直觀分析可知，A、B、C 3因素對多糖轉(zhuǎn)移率的影響大小為A

3 討論

本研究中單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著料液比的增加，多糖提取得率增高，當(dāng)料液比>1∶30時(shí)，多糖提取得率增高不顯著；多糖提取得率隨提取時(shí)間增加而增高，但提取超過2 h后，多糖提取得率呈現(xiàn)平緩趨勢；提取溫度升高，多糖提取得率也顯著增高。正交試驗(yàn)結(jié)果表明：西藏靈芝多糖的最佳提取工藝條件為料液比為1∶30，提取時(shí)間為2 h，提取次數(shù)為3次。

在靈芝培養(yǎng)基中，隨著靈芝菌絲體的生長和成熟，靈芝多糖的含量逐步增加，直到開傘期達(dá)到最高值，從孢子彈射期后，含量急劇下降[15-16]。本公司在西藏種植的3種靈芝多糖含量大小為松杉靈芝>西藏靈芝>紫芝，其中，松杉靈芝由于已完全開傘，而且?guī)缀鯖]有孢子粉，包子無彈射，因此多糖含量最高，而紫芝由于發(fā)育不良，菌傘沒開，因此多糖含量最低，因此，在種植靈芝時(shí)，應(yīng)根據(jù)不同目的，需要的是孢子粉還是靈芝多糖，其采收期也應(yīng)有所不同。

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[8] 黃純，高向東，龐秀炳，等.靈芝多糖的提取工藝優(yōu)化[J].江蘇藥學(xué)與臨床研究，2005，13（6）：66-67.

[9] 劉春泉，宋江峰，李大婧，等.響應(yīng)曲面法優(yōu)選靈芝實(shí)體多糖的提取工藝[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2007，23（3）：239-243.

[10] 陳乃東，陳瓊，何健.正交試驗(yàn)優(yōu)選靈芝多糖的提取工藝[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（19）：8146-8148.

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（收稿日期：2014-03-03 本文編輯：許俊琴）