鈾酰與多肽和蛋白質(zhì)相互作用研究進(jìn)展

劉洋，肖成梁，梅雷，屈國普，石偉群，*

1.南華大學(xué)核科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南衡陽421001;2.中國科學(xué)院高能物理研究所，核輻射與核能技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100049

鈾酰與多肽和蛋白質(zhì)相互作用研究進(jìn)展

劉洋1，2，肖成梁2，梅雷2，屈國普1，*，石偉群2，*

1.南華大學(xué)核科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南衡陽421001;2.中國科學(xué)院高能物理研究所，核輻射與核能技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100049

隨著核能事業(yè)的快速發(fā)展，人們越來越關(guān)注錒系核素對生態(tài)環(huán)境和生物體所造成的影響，其中錒系元素的生物毒理行為正成為核能基礎(chǔ)研究熱點(diǎn)之一。錒系陽離子與生物分子特別是多肽和蛋白質(zhì)的相互作用研究對于理解其在生物體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、吸收和沉積等基本毒理學(xué)問題至關(guān)重要。鈾作為核燃料循環(huán)中主要的錒系元素，其毒理學(xué)問題更具研究意義。本文綜述了鈾酰離子(UO22+)在分子水平上與氨基酸、多肽和蛋白質(zhì)之間相互作用機(jī)理的研究進(jìn)展。分析了所形成配合物的配位模式、分子結(jié)構(gòu)以及熱力學(xué)數(shù)據(jù)等;評價(jià)了血漿蛋白對鈾在人體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、吸收和沉積所起的作用;討論了能特異性識別UO22+的多肽和蛋白質(zhì)的設(shè)計(jì)原理，對本領(lǐng)域今后的發(fā)展動(dòng)向也進(jìn)行了展望。

鈾酰;氨基酸;多肽;蛋白質(zhì);相互作用;分子水平

隨著核能事業(yè)的快速發(fā)展、核電產(chǎn)業(yè)的迅速增長，對鈾的需求量也不斷加大。在鈾礦開采、核燃料制造、乏燃料后處理和核廢物處理與處置等核燃料循環(huán)的環(huán)節(jié)中，放射性核素均有可能在工業(yè)活動(dòng)和地質(zhì)運(yùn)動(dòng)中通過遷移、擴(kuò)散、轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)化等途徑進(jìn)入到環(huán)境中，從而直接或間接對人居環(huán)境和生物體造成嚴(yán)重影響。

對生物體而言，鈾不僅具有與放射性比活度相關(guān)的放射毒性，且具有重金屬的化學(xué)毒性。毒理學(xué)研究表明:盡管所有鈾的同位素及其衰變子體均具有放射性，會(huì)對人體器官造成內(nèi)照射損傷，但鈾中毒通常不是放射學(xué)效應(yīng)引起的，而是來自于體內(nèi)的生物化學(xué)相互作用［1］。因此人們普遍認(rèn)為內(nèi)污染導(dǎo)致?lián)p傷主要是源于鈾的化學(xué)毒性。鈾的化學(xué)毒性與其在進(jìn)入人體途徑、價(jià)態(tài)、體內(nèi)化合物的形式有密切關(guān)系［2］。通常，鈾元素進(jìn)入人體的暴露途徑主要有吸入、食入和傷口滲入等。大多數(shù)四價(jià)鈾化合物都不溶于水，水溶液中大多以六價(jià)的鈾酰(UO22+)形式存在，因此體液中鈾主要以UO22+形式存在。在人體血液中鈾主要以鈾酰鹽或者鈾酰－蛋白質(zhì)復(fù)合物的形式存在［3］，并通過血液循環(huán)迅速分布到各組織器官中，如腎臟、骨骼、肝臟和脾臟等。

盡管關(guān)于鈾與生物體相互作用的研究工作已有大量的文獻(xiàn)報(bào)道，但是大部分側(cè)重于研究鈾在生物體內(nèi)不同組織中的分布與沉積情況［4－5］，以及其毒理效應(yīng)［6］、促排劑［7］等。人們對UO22+生理毒性的分子機(jī)制尚未明確了解。蛋白質(zhì)是UO22+在生物體內(nèi)的主要結(jié)合分子，但是在分子水平上關(guān)于UO22+與多肽及蛋白質(zhì)相互作用的機(jī)理同樣還不明確，定量研究UO22+與多肽及蛋白質(zhì)結(jié)合性能的結(jié)果還很少。因此，在分子水平上從結(jié)構(gòu)特征及熱力學(xué)穩(wěn)定性等因素定量研究鈾與氨基酸、多肽和蛋白質(zhì)的相互作用機(jī)理，對于理解鈾在生物體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)、吸收和沉積的分子機(jī)制等基本毒理問題至關(guān)重要。同時(shí)，該方向的研究將對設(shè)計(jì)高效低毒的錒系元素陽離子促排藥物及研發(fā)能特異性結(jié)合UO22+的分子并用于鈾生物監(jiān)測和修復(fù)亦具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

1 UO2+2與多肽相互作用研究

1.1 氨基酸

氨基酸作為構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單位，能賦予多肽及蛋白質(zhì)特定的分子結(jié)構(gòu)形態(tài)，使其分子具有生化活性。因此，在分子水平上研究氨基酸與鈾的相互作用將為研究多肽及蛋白質(zhì)等更復(fù)雜的生物大分子提供參考依據(jù)。

從20世紀(jì)50年代開始，UO22+與氨基酸的相互作用研究便已展開，該時(shí)期的研究主要關(guān)注UO22+與氨基酸配合物的結(jié)構(gòu)，即確定氨基酸是通過氨基還是羧基或者兩個(gè)基團(tuán)共同參與UO22+的配位。眾所周知，氨基酸屬于兩性電解質(zhì)，羧基和氨基都能與UO22+相互作用。而這些功能基團(tuán)屬于Lewis和Bronsted酸堿，其配位形式與pH值相關(guān)。氨基酸的氨基和羧基的lg K值分別為9和2。電位滴定的結(jié)果顯示，在較低的pH值(2～4)下，氨基的質(zhì)子化作用阻止其與UO22+的絡(luò)合，而只是通過羧基上的兩個(gè)氧原子與UO22+雙齒配位。pH較高時(shí)，氨基去質(zhì)子作用使得氨基酸的氨基氮原子和羧基氧原子同時(shí)參與配位。在幾乎所有關(guān)于UO22+與氨基酸的研究中都發(fā)現(xiàn)羧基基團(tuán)是比較活躍的UO22+結(jié)合位點(diǎn)。Lagrange等［8］通過電位滴定和紫外光譜以及紅外光譜證實(shí)了多種氨基酸中羧酸和氨基基團(tuán)同時(shí)與UO22+配位。通過晶體學(xué)和核磁共振對甘氨酸及其—SH—衍生物與UO22+配合在結(jié)構(gòu)上的研究證實(shí)了UO22+更傾向于與羧酸基團(tuán)配位［9］。不同的側(cè)鏈基團(tuán)也可能改變氨基酸與UO22+的配位形式。通過13C NMR結(jié)果表明，天冬氨酸(R=—CH2—COO－)的側(cè)鏈羧基上的氧原子替代氨基與UO22+配位，而半胱氨酸側(cè)鏈巰基并沒有參與配位［10］。這也印證了作為硬受體的鈾原子更傾向于與硬氧原子而不是軟硫原子配位。側(cè)鏈基團(tuán)為脂肪族羥基的絲氨酸和蘇氨酸同樣也并未發(fā)現(xiàn)側(cè)鏈羥基與UO22+配位［11］。表1總結(jié)了文獻(xiàn)中已報(bào)道的各種氨基酸與UO22+配合物穩(wěn)定常數(shù)值。從表1可以看出，文獻(xiàn)中都只考慮了四種配合物的累積穩(wěn)定常數(shù)值，分別為(UO2)LH2+、(UO2)L2H22+、(UO2)L+和(UO2)L02(L為氨基酸);α－氨基酸與UO22+配合物的穩(wěn)定常數(shù)幾乎都相同，根據(jù)平衡UO22++L=(UO2)L+，形成常數(shù)的加權(quán)平均值為lg K1=8.4±0.7(I= 0.1 mol/L)，其中氨基對該值的貢獻(xiàn)為5.8±0.5，羧基為2.6±0.2。

表1UO22+與氨基酸配合物的穩(wěn)定常數(shù)值Table 1Summarized stability constants of uranyl－amino acid complexes

通過對比表1中的UO22+與氨基酸的各種配位行為，UO22+－氨基酸配合物的穩(wěn)定性主要取決于以下因素:(1)羧酸和氨基基團(tuán)之間的—CH2—基團(tuán)的個(gè)數(shù)和最終形成螯合環(huán)尺寸的大小;(2)在氨基酸上α－碳上其它能與UO22+結(jié)合基團(tuán)的數(shù)量、種類及所處位置;(3)體系中的pH值、溫度、離子強(qiáng)度等條件。

1.2 多肽

在眾多能與UO22+相互作用的蛋白質(zhì)中，除特定的蛋白質(zhì)外，大部分蛋白質(zhì)與UO22+的結(jié)合都不是特異性的。蛋白質(zhì)分子往往可以非選擇性地結(jié)合多個(gè)UO22+，形成配合物的穩(wěn)定性各不相同;而且蛋白質(zhì)通常具有復(fù)雜的四級結(jié)構(gòu)，影響蛋白質(zhì)與UO22+結(jié)合的因素較多，因此要分別確定其結(jié)合位點(diǎn)和相應(yīng)的配合物結(jié)構(gòu)具有相當(dāng)?shù)碾y度。一個(gè)簡化問題的方式就是研究蛋白質(zhì)片段或模型多肽與UO22+的結(jié)合行為和機(jī)理，在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)合成能特異性識別UO22+的多肽。

(1)蛋白質(zhì)片段多肽

鈣調(diào)蛋白是真核生物細(xì)胞中的胞質(zhì)溶膠蛋白，每個(gè)蛋白分子內(nèi)有四個(gè)鈣離子結(jié)合位點(diǎn)，其主要功能為根據(jù)鈣離子濃度的變化來控制細(xì)胞內(nèi)重要的生化反應(yīng)。Le Clainche等［35］采用草履蟲鈣調(diào)蛋白中具有EF手圖像模體的第一鈣結(jié)合位點(diǎn)作為模版(CaM:EQAEFKEAFAALFDKDGDGTITTKELGTVMRSL)，設(shè)計(jì)合成了含33個(gè)氨基酸的模型多肽(CaM－M1c:EQAEFKEAFAALCDKDGDGTITTKELGTCMRSL)。再將該模型多肽的兩個(gè)天冬氨酸改造為蘇氨酸獲得對UO22+具有很強(qiáng)結(jié)合能力并且具有選擇性的新多肽分子(CaM－M3c: EQAEFKEAFAALCTKDGTGTITTKELGTC－MRSL)。時(shí)間分辨激光誘導(dǎo)熒光(TRLIF)滴定實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示單體的(CaM－M3c)(UO2)絡(luò)合物解離常數(shù)KD值達(dá)到了18 μmol/L。圓二色譜的結(jié)果表明結(jié)合UO22+后該多肽分子從無規(guī)則構(gòu)象到α－螺旋構(gòu)象的改變，而鈣離子和其它鑭系金屬離子都不能使其構(gòu)象改變，這說明CaM－M3c對UO22+具有特異性的結(jié)合。該多肽分子在被低濃度UO22+沾污的泉水中仍然表現(xiàn)出對鈾酰離子很強(qiáng)的結(jié)合能力和選擇性，使得該分子有望應(yīng)用于專門測定低濃度鈾污染的生物探針和傳感器。磷酸化(phosphorylation)或磷酸化作用，是指在蛋白質(zhì)或其他類型分子上，加入一個(gè)磷酸基團(tuán)，也可定義成“將一個(gè)磷酸基團(tuán)導(dǎo)入一個(gè)有機(jī)分子”，此作用在生物化學(xué)中占有重要地位。蛋白質(zhì)磷酸化可發(fā)生在許多種類的氨基酸上，其中以絲氨酸為多，其次是蘇氨酸和酪氨酸。磷酸化多肽即指通過磷酸化作用后的側(cè)鏈基團(tuán)含有磷酸基團(tuán)的多肽(序列中包含絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸)。通常，蛋白質(zhì)中的羰基、羧基、酚羥基和磷?；峁┭踉优cUO22+配位［36］。對比UO22+配合物結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，酚羥基、磷酰基中氧原子與鈾原子之間的鍵長最短，說明磷酰基對UO22+親和能力較強(qiáng)［37］。自然界中鈾酰與磷酸基團(tuán)天然共存的鈣鈾云母礦石和具有三腳架結(jié)構(gòu)雙磷酸鹽的Uranophiles錒系促排藥物［38］都印證了該觀點(diǎn)。Merroun等［39］則從鈾礦廢料堆中的球狀桿菌JG－A12中發(fā)現(xiàn)了磷酸化的蛋白質(zhì):卵黃高磷蛋白和S層蛋白。兩種蛋白都對UO22+表現(xiàn)出非常好的結(jié)合能力，而蛋白中磷酸基團(tuán)直接參與UO22+的配位。因此可以預(yù)見，磷酸基團(tuán)的引入將大大提高多肽結(jié)合UO22+的親合力。通過調(diào)節(jié)多肽序列，將多肽進(jìn)行磷酸化修飾，能達(dá)到提高選擇性結(jié)合UO22+的目的。Pardoux等［40］選取鈣調(diào)蛋白中其中一個(gè)EF－手性結(jié)構(gòu)的鈣離子結(jié)合位點(diǎn)，對其序列中的蘇氨酸進(jìn)行磷酸化修飾，將其用于研究UO22+的生物毒性。研究結(jié)果表明，在pH=6的條件下磷酸化多肽(DKDGDGYITpAAE)與UO22+的結(jié)合能力是其對應(yīng)原多肽(DKDGDGYITAAE)的5倍。在pH=7、即生理pH值條件下，UO22+與磷肽結(jié)合的解離常數(shù)達(dá)到亞納摩爾量級。通過傅立葉變換紅外光譜(FTIR)證實(shí)了在該條件下磷酸根基團(tuán)與UO22+的直接相互作用。因此，在生理?xiàng)l件下，磷酸根基團(tuán)直接決定了鈾酰與蛋白質(zhì)結(jié)合能力。

(2)模型多肽

鈾主要沉積在腎臟和骨骼中，放射顯影研究發(fā)現(xiàn)鈾酰離子在骨骼中沉積分布情況與鈣離子比較相似，而在一些病例中發(fā)現(xiàn)鈾在骨骼的生長區(qū)域具有很高的濃度。骨橋蛋白是一種磷酸化的、非有序結(jié)構(gòu)的蛋白，其主要功能為調(diào)控骨骼的生長。最近研究表明，鈾在體內(nèi)的慢性毒性機(jī)理與鈾和體內(nèi)磷酸基團(tuán)的相互作用有關(guān)。骨橋蛋白可能對鈾在骨骼中的沉積起到至關(guān)重要的輔助作用。Safi等［41］選取骨橋蛋白中金屬結(jié)合位點(diǎn)處的磷酸化多肽片段“pSDEpSDE(H8V)”作為研究對象，結(jié)合熱力學(xué)、光譜學(xué)技術(shù)以及理論計(jì)算方法在熱力學(xué)、結(jié)構(gòu)性質(zhì)方面對該模型磷酸化多肽進(jìn)行了研究。通過量熱滴定及時(shí)間分辨熒光技術(shù)獲得了模型磷酸化多肽H8V與鈾酰離子配合物的化學(xué)計(jì)量比和結(jié)合能力以及種態(tài)分布。紅外光譜直接證實(shí)了H8V中磷酸基團(tuán)參與鈾酰離子的配位。密度泛函理論(DFT)計(jì)算結(jié)合U的L3邊擴(kuò)展X光吸收精細(xì)結(jié)構(gòu)譜(extended X－ray absorption fine structure，EXAFS)數(shù)據(jù)擬合分析表明，磷酸基團(tuán)的一個(gè)氧原子、羧酸基團(tuán)的兩個(gè)氧原子以及兩分子水與UO22+配位。對比H8V與其原型骨橋蛋白的EXAFS實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該模型多肽H8V和骨橋蛋白在pH=5.5的條件下與鈾酰的配位環(huán)境非常相似。兩者如此相似的可能原因在于骨橋蛋白不存在一種明確定義的三級結(jié)構(gòu)，蛋白序列具有很好的柔韌性，而H8V所在區(qū)域呈現(xiàn)出不折疊的完全展開的構(gòu)型。結(jié)合上述實(shí)驗(yàn)表明該模型多肽能夠很好地模擬全長序列的骨橋蛋白。研究人員也推測該蛋白的調(diào)節(jié)作用為鈾在人體中生物礦化的主要原因。因此，更多關(guān)于全長骨橋蛋白與UO22+相互作用、以及其對鈾在骨骼中沉積所起到的作用值得研究。在生理?xiàng)l件下，當(dāng)UO22+的濃度在微摩爾量級時(shí)，其在血清中的主要存在種態(tài)由［UO2(CO3)2］2－+CO23－=［UO2(CO3)3］4－表示。其中結(jié)合三個(gè)碳酸根的UO22+占主導(dǎo)地位，結(jié)合兩個(gè)碳酸根的UO22+也部分存在于體內(nèi)。在生理pH和碳酸根濃度下，與UO22+具有中等絡(luò)合能力的配體都需要與第三個(gè)碳酸根離子競爭才能與UO22+形成配合物。Huang等［42］發(fā)現(xiàn)多肽DAHK和GGH與UO22+能夠形成［UO2(CO3)2Ln］n－2類型的鈾酰－碳酸根－多肽的三元配合物。由于這兩種多肽上的羧基基團(tuán)與UO22+結(jié)合是非特異性的，其配合物UO2(CO3)2(GGH)和UO2(CO3)2(DAHK)的穩(wěn)定常數(shù)并不高，分別為lg K=2.2±0.4和lg K=3.1± 0.4。該研究結(jié)果表明羧酸基團(tuán)與UO22+的非特異性結(jié)合可能是UO22+在血清中輸運(yùn)的一種機(jī)制。但并不能排除在血清中有其他蛋白質(zhì)能與UO22+特異性結(jié)合而且配合物還具有高穩(wěn)定性。鑒于錒系陽離子趨向于與酸性氨基酸配位，Jeanson等［43］還研究了四價(jià)錒系陽離子Th(Ⅳ)、Pu(Ⅳ)和Np(Ⅳ)等與模型肽Ac－Asp－Asp－Pro－Asp－Asp－NH2的相互作用。研究發(fā)現(xiàn)，pH在生理?xiàng)l件下，以上四價(jià)錒系陽離子均可以直接與多肽絡(luò)合，而不至于產(chǎn)生水解。該模型多肽分子為設(shè)計(jì)在生理pH條件下能防止UO22+水解并具有較高結(jié)合常數(shù)的多肽序列提供了借鑒。

上述研究表明:多肽與UO22+的配位可通過多肽序列和磷酸基團(tuán)的精細(xì)調(diào)節(jié)，提高對UO22+的選擇性。多肽本身為生物分子，具有一定的生理活性，將可提高其作用效率并降低其生理毒性。因此，多肽分子是未來理想的錒系促排藥物。

1.3 蛋白質(zhì)

隨著人類在基因和蛋白質(zhì)研究領(lǐng)域的巨大進(jìn)步，越來越多的研究開始關(guān)注錒系陽離子與DNA和蛋白質(zhì)的相互作用機(jī)理。蛋白質(zhì)是生命體系中的重要分子，它們參與調(diào)節(jié)各種新陳代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞周期等許多極其重要的生命過程。鑒于蛋白質(zhì)可能在UO22+在體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、沉積、排泄中扮演重要角色，研究UO22+與蛋白質(zhì)的相互作用機(jī)理無疑具有十分重要的意義。而UO22+與氨基酸和多肽相互作用研究則為研究UO22+與分子量更大、結(jié)構(gòu)更復(fù)雜的蛋白質(zhì)相互作用提供基礎(chǔ)。

(1)血漿蛋白質(zhì)

通常受污染的土壤和水源中的鈾通過吸入、食入以及皮下滲入等方式進(jìn)入人體細(xì)胞外的環(huán)境組織液，組織液中的鈾通過體液交換進(jìn)入血液循環(huán)。不管鈾以哪種方式進(jìn)入人體，只有以UO22+形式存在的可溶性鈾才能夠進(jìn)入人體的血液循環(huán)，其在血漿中的質(zhì)量濃度約為1 ng/L。進(jìn)入生物體內(nèi)后，UO22+的化學(xué)種態(tài)對其分布、代謝和排泄起著決定性的作用，也使其在不同組織器官上的作用機(jī)理和影響效果具有顯著差異。UO22+能與很多生物小分子配體形成絡(luò)合物，從而使鈾的種態(tài)變得非常復(fù)雜，增加研究的困難。相關(guān)研究數(shù)據(jù)表明，在血漿當(dāng)中UO22+主要與碳酸根(60%)和蛋白質(zhì)(30%)形成絡(luò)合物，而剩下的大多被吸附在紅細(xì)胞上［44］。所以普遍認(rèn)為UO22+與血漿中的一些蛋白質(zhì)相結(jié)合、并通過血液循環(huán)進(jìn)入到靶器官的細(xì)胞當(dāng)中是一種鈾在人體中轉(zhuǎn)運(yùn)比較合理的機(jī)制。因此在分子水平上UO22+與血漿中的蛋白質(zhì)相互作用的研究具有重要的意義。在眾多血漿蛋白質(zhì)中，具有金屬離子輸運(yùn)能力的轉(zhuǎn)鐵蛋白和含量最豐富的白蛋白是研究最多的兩種蛋白。轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferrin，Tf)，又稱運(yùn)鐵蛋白，是血漿中主要的含鐵蛋白質(zhì)。它是由670～700個(gè)氨基酸組成的單鏈糖基化蛋白，分子量為800 kDa左右。轉(zhuǎn)鐵蛋白最基本的生理功能為結(jié)合和運(yùn)輸三價(jià)鐵離子，從而控制血液中鐵離子含量。晶體結(jié)構(gòu)顯示轉(zhuǎn)鐵蛋白由兩個(gè)結(jié)構(gòu)相似的臂組成，分別稱為N－臂(N－lobe)和C－臂(C－lobe)，兩臂之間由一條短肽鏈相連。每個(gè)臂都由兩個(gè)大小相近的結(jié)構(gòu)域組成，兩個(gè)結(jié)構(gòu)域相交處便是一個(gè)鐵結(jié)合位點(diǎn)。N－臂和C－臂都有一個(gè)鐵結(jié)合位點(diǎn)，兩個(gè)鐵結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)也非常相似。三價(jià)鐵與來自兩個(gè)酪氨酸的氧原子、一個(gè)天冬氨酸的氧原子、一個(gè)組氨酸的氮原子以及作為協(xié)同陰離子的碳酸根離子上的兩個(gè)氧原子通過配位鍵形成八面體的幾何構(gòu)型［45］。每一個(gè)結(jié)構(gòu)域移動(dòng)位置便可使鐵結(jié)合位點(diǎn)處于開放狀態(tài)，鐵就會(huì)被釋放出來。轉(zhuǎn)鐵蛋白在構(gòu)象上處于開放或閉合的過程也就是其吸收或釋放鐵離子的過程。結(jié)合兩個(gè)三價(jià)鐵離子的轉(zhuǎn)鐵蛋白能與轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(transferrin receptor，TfR)形成穩(wěn)定的復(fù)合物，通過內(nèi)吞化作用形成內(nèi)吞小體，內(nèi)吞小體中的酸性環(huán)境使得轉(zhuǎn)鐵蛋白釋放出鐵。轉(zhuǎn)鐵蛋白通過其受體介導(dǎo)的胞吞作用是鐵進(jìn)入哺乳動(dòng)物的主要途徑，如圖1所示。

圖1 TfR介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鐵的吸收［46］Fig.1TfR－mediated intracellular iron uptake［46］

除了鐵，其他的二價(jià)或三價(jià)金屬離子也能結(jié)合到轉(zhuǎn)鐵蛋白的金屬結(jié)合位點(diǎn)上。研究表明，錒系金屬離子钚、镎、釷和鋦都能與轉(zhuǎn)鐵蛋白相互作用，且具有較強(qiáng)的結(jié)合能力［46－47］。鑒于轉(zhuǎn)鐵蛋白可能在錒系陽離子進(jìn)入人體組織細(xì)胞中扮演重要角色，在分子水平上研究UO22+與轉(zhuǎn)鐵蛋白之間的相互作用也非常重要。相關(guān)工作的早期研究主要關(guān)注UO22+與轉(zhuǎn)鐵蛋白配合物的穩(wěn)定常數(shù)以及它們之間的化學(xué)計(jì)量數(shù)。Scapolan等［48］采用時(shí)間分辨熒光技術(shù)研究鈾酰離子與轉(zhuǎn)鐵蛋白的相互作用。熒光滴定結(jié)果表明兩者能夠形成化學(xué)計(jì)量比(U/Tf)為2∶1的絡(luò)合物，并且首次在低鈾濃度c(UO22+)=1×10－6mol/L及生理pH條件下，采用非線性回歸數(shù)學(xué)模型得到UO22+與轉(zhuǎn)鐵蛋白絡(luò)合常數(shù)為lg K=16。Ansoborlo等［49］綜合考慮金屬離子的水解常數(shù)和轉(zhuǎn)鐵蛋白中存在的兩個(gè)獨(dú)立的金屬結(jié)合位點(diǎn)，分別得到了C臂和N臂對UO22+的結(jié)合常數(shù)為lg K1=14.1和lg K2=12.6。Montavon等［50］則結(jié)合時(shí)間分辨熒光和紫外光譜發(fā)現(xiàn)在生理pH條件下轉(zhuǎn)鐵蛋白上兩個(gè)金屬結(jié)合位點(diǎn)對UO22+的結(jié)合能力并不相同，絡(luò)合常數(shù)分別為lg K1=12.4，lg K2=11.4。在有碳酸根存在的條件下，UO22+會(huì)與兩個(gè)或三個(gè)碳酸根形成絡(luò)合物，然后與轉(zhuǎn)鐵蛋白或其它蛋白形成鈾酰－轉(zhuǎn)鐵蛋白質(zhì)－碳酸根多元絡(luò)合物。隨著研究技術(shù)的不斷發(fā)展，研究人員更加關(guān)注轉(zhuǎn)鐵蛋白的結(jié)合位點(diǎn)是怎樣調(diào)整構(gòu)型以適應(yīng)鈾酰離子的進(jìn)入、結(jié)合了鈾酰離子后轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)構(gòu)上發(fā)生了哪些變化、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變后還能不能被受體識別等問題。這些因素都將直接決定鈾酰離子能不能像三價(jià)鐵離子一樣被轉(zhuǎn)鐵蛋白運(yùn)輸?shù)饺梭w細(xì)胞當(dāng)中。Vidaud等［51］采用紫外可見光譜、紅外光譜以及微量滲析的方法發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)鐵蛋白金屬結(jié)合位點(diǎn)中的兩個(gè)酪氨酸都參與了配位，與三價(jià)鐵離子不同的是組氨酸并沒有參與配位，結(jié)構(gòu)模型示于圖2。通過圓二色譜和差示掃描量熱技術(shù)發(fā)現(xiàn)Tf－UO22+絡(luò)合物的整體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性弱于Tf－Fe3+。采用標(biāo)記的方法則發(fā)現(xiàn)Tf－UO22+絡(luò)合物并不能被轉(zhuǎn)鐵蛋白受體所識別。其主要原因可能是Tf－UO22+絡(luò)合物并不像Tf－Fe3+絡(luò)合物一樣呈現(xiàn)閉合構(gòu)象，而依然呈現(xiàn)開放式構(gòu)象，從而無法進(jìn)入細(xì)胞。Benavides－Garcia等［52］則采用密度泛函理論(DFT)計(jì)算的方法研究了UO22+與轉(zhuǎn)鐵蛋白的相互作用以及Tf－UO22

圖2 轉(zhuǎn)鐵蛋白N－臂結(jié)合三價(jià)鐵(A和A')和鈾酰后(B和B')的結(jié)構(gòu)模型［51］Fig.2Structural model of metal binding in Tf，F(xiàn)e3+N－lobe of transferrin(A and A')and proposed model of uranyl－N－lobe(B and B')［51］

+絡(luò)合物在結(jié)構(gòu)上的特征。通過優(yōu)化Tf－UO22+絡(luò)合物的幾何構(gòu)型以及計(jì)算的紅外圖譜發(fā)現(xiàn)UO22+主要與轉(zhuǎn)鐵蛋白中結(jié)合位點(diǎn)處的兩個(gè)酪氨酸(Tyr 95和Tyr 188)、一個(gè)天冬氨酸還有一個(gè)碳酸根離子配位，而組氨酸并未參與配位，這與文獻(xiàn)［51］的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。另外還發(fā)現(xiàn)天冬氨酸和一個(gè)酪氨酸之間形成非常強(qiáng)的氫鍵，該氫鍵在Tf－UO22+絡(luò)合物的形成及維持絡(luò)合物穩(wěn)定上起到了非常重要的作用。計(jì)算得到的拉普拉斯電荷圖譜則表明UO22+－轉(zhuǎn)鐵蛋白絡(luò)合物可以同時(shí)充當(dāng)親核試劑和親電試劑，可以與不同的受體進(jìn)一步作用，這可能是鈾順利進(jìn)入人體不同器官的原因。Mulliken電荷密度圖以及3－D密度圖則表明Tf－UO22+絡(luò)合物的形成機(jī)制為供體－受體機(jī)制。

血清白蛋白是人體血液中含量最為豐富的蛋白質(zhì)，其質(zhì)量濃度約為30～50 g/L，約占整個(gè)血液中蛋白質(zhì)的一半，其主要功能為運(yùn)輸脂肪酸。最早關(guān)于UO22+與血清白蛋白相互作用的研究始于1948年，Barron等［53］發(fā)現(xiàn)UO22+與血清白蛋白之間的相互作用是可逆的，同時(shí)會(huì)受到碳酸根及檸檬酸根等競爭性配體的影響。Chevari等［54］則采用Shubert－type方法算出在pH=6條件下UO22+與血清白蛋白絡(luò)合物的穩(wěn)定常數(shù)為lg K=10。采用微量熱的方法得到了在pH=5.5條件下白蛋白中高親和力位點(diǎn)和低親和力位點(diǎn)分別與UO22+結(jié)合的穩(wěn)定常數(shù)達(dá)到了K=1.6×107L/mol和K=2.8× 105L/mol［55］。Montavon等［50］同樣證實(shí)在血漿中UO22+與白蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白都會(huì)形成鈾酰－蛋白質(zhì)－碳酸根的多元絡(luò)合物，同時(shí)Ca2+會(huì)和UO22+與白蛋白競爭性配位。根據(jù)建立的模型計(jì)算發(fā)現(xiàn)，盡管兩種蛋白與UO22+結(jié)合能力相似，但與UO22+結(jié)合的血漿蛋白中80%是白蛋白，20%是轉(zhuǎn)鐵蛋白，其主要原因在于血漿中白蛋白的含量要比轉(zhuǎn)鐵蛋白高一個(gè)數(shù)量級。Yang等［56］則取與人血清白蛋白相似的牛血清白蛋白作為研究對象，采用熒光和全反射傅里葉紅外光譜(ATR－FTIR)的方法不僅得到了牛血清白蛋白與UO22+的結(jié)合常數(shù)，而且發(fā)現(xiàn)結(jié)合UO22+后蛋白質(zhì)構(gòu)象也發(fā)生了顯著變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在溶液體系中隨著UO22+濃度的增加，蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中的α－螺旋(α－h(huán)elix)結(jié)構(gòu)成分不斷減少，而β折疊(β－sheets)、翻轉(zhuǎn)及無序纏繞等成分增多，因此可推測結(jié)構(gòu)上的變化可能直接導(dǎo)致白蛋白在生理功能上的變化。

除了轉(zhuǎn)鐵蛋白和血清白蛋白外，血漿中是否還有其他蛋白質(zhì)會(huì)與UO22+結(jié)合，而這些相互作用會(huì)不會(huì)更好解釋鈾在生物體內(nèi)動(dòng)力學(xué)及毒理學(xué)?為了更好地回答這些問題，Vidaud等［57］設(shè)計(jì)了一種結(jié)合時(shí)間分辨熒光和蛋白質(zhì)組學(xué)分析的二維色層分析方法來篩選血漿中除了轉(zhuǎn)鐵蛋白和血清白蛋白外能與UO22+相互作用的蛋白質(zhì)，并采用等離子質(zhì)譜進(jìn)行確認(rèn)。結(jié)果表明血漿銅藍(lán)蛋白、血色素結(jié)合蛋白和另外兩種補(bǔ)體蛋白與UO22+結(jié)合的化學(xué)計(jì)量比大于1。然而這四種蛋白質(zhì)都不是金屬蛋白，說明UO22+能通過各種各樣的結(jié)合位點(diǎn)及配位模式與很多蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用。Basset等［58］測得了13種血漿蛋白質(zhì)與UO22+結(jié)合的解離常數(shù)，從中發(fā)現(xiàn)參與骨骼新陳代謝的胎球蛋白A (fetuin A)表現(xiàn)出對UO22+最強(qiáng)的結(jié)合能力。盡管其在血漿中含量較低，但結(jié)合了80%的UO22+?？紤]到相對濃度，作者認(rèn)為白蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白都并非血漿中主要的UO22+輸運(yùn)者，而是胎球蛋白A。熒光分析表明胎球蛋白A具有三個(gè)UO22+結(jié)合位點(diǎn)，其中較強(qiáng)的結(jié)合位點(diǎn)的解離常數(shù)達(dá)到了10 μmol/L。圓二色譜結(jié)果顯示胎球蛋白A結(jié)合UO22+后，其蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)并未發(fā)生變化，相應(yīng)的生理功能也沒有發(fā)生變化。該研究結(jié)果不僅改變了以往認(rèn)為白蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白是血漿中UO22+的主要輸運(yùn)者的認(rèn)識，同時(shí)也提出了鈾從血液到骨骼轉(zhuǎn)運(yùn)以及在骨骼中沉積的一種可能的新機(jī)制。

(2)其他蛋白質(zhì)

除了血漿蛋白外，其它金屬蛋白和磷酸化蛋白也是研究熱點(diǎn)。UO22+與金屬蛋白的結(jié)合與其他金屬離子處于競爭關(guān)系，蛋白質(zhì)與何種金屬離子結(jié)合取決于形成配合物的穩(wěn)定常數(shù)。Michon等［59］對比四種金屬蛋白發(fā)現(xiàn)，與UO22+結(jié)合能力由強(qiáng)到弱依次為轉(zhuǎn)鐵蛋白、人血清白蛋白、金屬硫蛋白和鐵蛋白。Li等［60］采用紅外光譜(ATRFTIR)的方法對高度磷酸化蛋白(卵黃高磷蛋白)結(jié)合UO22+的行為進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)該蛋白對UO22+表現(xiàn)出非常強(qiáng)的結(jié)合能力。蛋白質(zhì)中的磷酸基團(tuán)對UO22+具有較高的親和性。Brown等［61］亦發(fā)現(xiàn)UO22+可以選擇性識別α－酪蛋白、卵白蛋白和β－酪蛋白的磷酸化位點(diǎn)，并且利用UO22+的光學(xué)特性對以上蛋白進(jìn)行了光致切割。最值得關(guān)注的是: Wegner等［62］采用基因突變技術(shù)，針對UO22+赤道面的配位特性，對鎳離子結(jié)合蛋白NikR進(jìn)行了特殊改造。NikR是nikABCDE鎳離子吸收系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄因子，如圖3(a)所示。在該結(jié)合位點(diǎn)的基礎(chǔ)上，將76位的組氨酸和96位的半胱氨酸突變?yōu)榧饶茏鳛閱锡X配體又能作為雙齒配體的天冬氨酸以滿足UO22+赤道平面配位數(shù)的要求。同時(shí)將72位的纈氨酸變?yōu)榻z氨酸，這樣絲氨酸上的羥基有可能與UO22+上一個(gè)氧原子形成氫鍵，從而增強(qiáng)蛋白質(zhì)與UO22+的結(jié)合能力(圖3(b)所示)。突變后的蛋白質(zhì)在和二甘醇酸與UO22+的競爭性絡(luò)合實(shí)驗(yàn)表明，突變后的NikR’與UO22+的結(jié)合能力是二甘醇酸的50多倍，其解離常數(shù)為10－7.27±0.20mol/L。EXAFS結(jié)果表明兩個(gè)組氨酸和兩個(gè)天冬氨酸的殘基都參與配位。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明只有結(jié)合了UO22+的NikR’蛋白才能與DNA形成蛋白質(zhì)－DNA的絡(luò)合物，而其它二價(jià)金屬Ni2+、Zn2+、Co2+、Cu2+、Gd2+、Mn2+和Fe2+與該蛋白結(jié)合后都不能被DNA識別。該現(xiàn)象表明突變后的NikR蛋白表現(xiàn)出對UO22+的特異性結(jié)合?；趯︹欟ｋx子配位特性的了解，可以通過改變蛋白質(zhì)骨架來選擇性結(jié)合UO22+，為設(shè)計(jì)具有高效選擇性結(jié)合錒系陽離子的蛋白質(zhì)提供了重要的借鑒意義?；谠摾砟?，Zhou等［63］發(fā)展了能在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(protein data bank(PDB))中篩選出具有潛在UO22+結(jié)合位點(diǎn)蛋白質(zhì)的程序(URANTEIN)，并利用該程序發(fā)現(xiàn)了甲烷桿菌體內(nèi)一個(gè)功能未知的蛋白質(zhì)具有較強(qiáng)UO22+結(jié)合能力，并針對UO22+的配位特性對該蛋白進(jìn)行改造從而得到了具備良好的熱穩(wěn)定性和超強(qiáng)UO22+結(jié)合能力的超級鈾酰結(jié)合蛋白(super uranyl－binding protein(SUP))。SUP－UO22+配合物晶體結(jié)構(gòu)如圖4所示，研究發(fā)現(xiàn)，SUP對UO22+有優(yōu)越的選擇性，能提取模擬海水中30%～60%的UO22+并能反復(fù)使用。該研究對理解UO22+與蛋白的作用機(jī)制以及利用生物技術(shù)進(jìn)行海水提鈾均具有重要意義，為今后錒系元素結(jié)合蛋白的設(shè)計(jì)合成指明了方向。

圖3 鎳(Ⅱ)－響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子(NikR)［62］Fig.3Nickel(Ⅱ)－responsive transcriptional regulator(NikR)［62］

圖4 超級鈾酰結(jié)合蛋白SUP的晶體結(jié)構(gòu)［63］Fig.4Uranyl－SUP crystal structure［63］

2 結(jié)論與展望

核能的快速發(fā)展及公眾對于核安全的日益重視，使得作為重要核材料的鈾對于人體健康的影響倍受關(guān)注。在分子水平上對鈾與生物分子的相互作用研究是鈾在人體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)、沉積機(jī)制及毒理和解毒機(jī)制研究的基礎(chǔ)，對錒系元素生物毒理學(xué)、錒系元素配位化學(xué)、錒系元素促排藥物的研發(fā)以及核環(huán)境安全均具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

本文綜述了在分子水平上定量分析UO22+與氨基酸、多肽和蛋白質(zhì)相互作用的研究進(jìn)展。主要結(jié)論如下:(1)由于氨基酸分子結(jié)構(gòu)較為簡單，其與UO22+相互作用的研究已較為系統(tǒng)，為研究多肽及蛋白質(zhì)等大分子奠定了基礎(chǔ);(2)適當(dāng)選取蛋白質(zhì)金屬結(jié)合位點(diǎn)處多肽片段能夠較好地模擬蛋白質(zhì)與UO22+的相互作用;合理地設(shè)計(jì)氨基酸序列和恰當(dāng)引入磷酸基團(tuán)能使模型多肽達(dá)到特異性結(jié)合UO22+的效果;(3)在眾多血漿蛋白質(zhì)中，轉(zhuǎn)鐵蛋白、白蛋白和胎球蛋白A均表現(xiàn)出對UO22+較強(qiáng)的結(jié)合能力，都是血液中可能的UO22+輸運(yùn)者;運(yùn)用基因技術(shù)改造蛋白質(zhì)金屬結(jié)合位點(diǎn)同樣能使其達(dá)到特異性結(jié)合UO22+的效果而不改變蛋白質(zhì)生理功能?？偟膩碚f，在分子水平上定量研究鈾與特定生物分子相互作用研究仍處于起步階段，還有大量科學(xué)問題有待解決，而設(shè)計(jì)合成專門針對UO22+的多肽和蛋白質(zhì)類的生物探針、促排藥物及細(xì)胞內(nèi)或體內(nèi)UO22+與生物分子相互作用研究將是未來分子水平上生物分子與UO22+確稱取一定量相互作用研究的發(fā)展方向。

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Recent Research Progress of Interactions Between Uranyl Ions and Peptides/Proteins

LIU Yang1，2，XIAO Cheng－liang2，MEI Lei2，QU Guo－pu1，*，SHI Wei－qun2，*
1.School of Nuclear Science and Technology，University of South China，Hengyang 421001，China; 2.Key Lab of Nuclear Radiation and Nuclear Technology，Institute of High Energy Physics，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100049，China

With the rapid development of nuclear energy industry，the bio－toxicities of actinides have drawn more and more attention with respect to their potential harmful effects on ecological environment and bio－organisms.Studying the interaction mechanisms of actinide cations with biomolecules，especially peptides or proteins，can provide useful information in molecular level for understanding the transportation，absorption and deposition pathways of actinides in vivo.Uranium，as a central actinide in nuclear fuel cycle，deserves more research endeavors.In this work，recent progresses about the interaction mechanisms between uranyl(UO22+)and amino acids，peptides and proteins are reviewed.The coordination modes，molecular structures and thermodynamic data of UO22+－peptide complexes are selectively highlighted.The possible roles of the plasma proteins playin UO22+transportation，absorption and deposition are discussed.In addition，the basic principles for designing UO22+specific binding peptides and proteins are presented.

uranyl;amino acid;peptide;protein;interactions;molecular level

Q506

A

0253－9950(2014)03－0129－11

10.7538/hhx.2014.36.03.0129

2013－12－06;

2014－04－01

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(11275219)

劉洋(1989—)，男，四川成都人，碩士研究生，輻射防護(hù)及環(huán)境保護(hù)專業(yè)

*通信聯(lián)系人:屈國普(1964—)，男，湖南衡陽人，教授，從事核輻射探測方法研究，E－mail:quguopu@usc.edu.cn石偉群(1976—)，男，湖北黃梅人，博士，副研究員，從事核能放射化學(xué)研究，E－mail:shiwq@ihep.ac.cn