8－氧-2＇-去氧鳥嘌呤核苷水解機(jī)理的理論研究

鄭 妍，尤 勇，梁曉琴

（四川師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，成都610066）

1 引 言

基因信息由DNA鏈上的堿基確定，這些堿基的任何改變都將大大的影響遺傳物質(zhì)的整體性．然而這些堿基可能被氧化損傷，這種氧化是由活性氧（reactive oxygen species，ROS）引起的一種化學(xué)修飾，不僅電離輻射或者長(zhǎng)波紫外線（UVA）照射可產(chǎn)生活性氧，而且由尼古丁和煙草煙霧引起的有機(jī)自由基也可產(chǎn)生活性氧．另外，正常細(xì)胞的新陳代謝也能引起堿基的損傷．

DNA中糖苷鍵的斷裂是一個(gè)重要的過(guò)程，在自然界中發(fā)生的頻率非常高．然而，DNA的穩(wěn)定性使得糖苷鍵斷裂成為一個(gè)高能量的反應(yīng)，需要各種酶的催化[1]．例如，參與DNA修復(fù)過(guò)程的DNA糖苷酶使糖苷鍵斷裂，從而將受損的核苷堿基從雙螺旋結(jié)構(gòu)中切除．已經(jīng)提出的不同酶催化DNA糖苷鍵斷裂的機(jī)理具有許多相似之處．特別的是由于核苷的穩(wěn)定性，所提出的機(jī)理包括一個(gè)親核試劑的進(jìn)攻（例如，在水解酶、蓖麻蛋白毒素A鏈和一些DNA糖苷酶中的水分子、一些DNA糖苷酶的一個(gè)活性部位氨基酸和磷酸酶的磷酸氫鹽）[1－6]．有些酶催化糖苷鍵斷裂的機(jī)理包括類氧碳正離子過(guò)渡態(tài)的形成．例如，已提出的DNA糖苷酶（尿嘧啶DNA糖苷酶，UDG）水解機(jī)理包括核苷堿基陰離子的形成，該陰離子的產(chǎn)生是由于堿基－核糖鍵的斷裂，并且假設(shè)酶通過(guò)其活性部位殘基與堿基陰離子中間體之間的氫鍵相互作用來(lái)穩(wěn)定堿基陰離子中間體．而且，盡管一些糖苷酶（MutY）被認(rèn)為在堿基離去之前質(zhì)子化嘌呤或嘧啶，但是有證據(jù)表明其他一些受損嘌呤（8-氧鳥嘌呤）能通過(guò)陰離子中間體的形成來(lái)修復(fù)受損核苷[7]．另外，機(jī)理包括或至少部分包括離去核苷堿基的穩(wěn)定，這種穩(wěn)定是通過(guò)離去核苷堿基與酶的活性位點(diǎn)氨基酸之間氫鍵相互作用來(lái)達(dá)到的．

計(jì)算化學(xué)能提供有關(guān)短期存在的過(guò)渡態(tài)的有用信息，這種過(guò)渡態(tài)在實(shí)驗(yàn)中很難得到．事實(shí)上，很多研究運(yùn)用計(jì)算化學(xué)方法來(lái)研究糖苷鍵斷裂的路徑．然而，這些研究通常僅僅集中在糖苷鍵被特定酶催化斷裂．由于這些酶催化反應(yīng)機(jī)理的相似性，我們認(rèn)為在不考慮核苷堿基在特定活性部位的相互作用的情況下，研究這種反應(yīng)，即研究酶催化糖苷鍵斷裂的基本原理是必要的．為了更好的了解核苷堿基在糖苷鍵裂解過(guò)程的活化作用，Wetmore[8]等人作了大量的工作．他們研究了氫原子結(jié)合到正常的核苷堿基或者是受損的核苷堿基對(duì)堿基酸性的影響以及尿嘧啶核苷的N-糖苷鍵的水解機(jī)理．在目前的工作中，用計(jì)算化學(xué)的方法研究了有單個(gè)水分子參與的8-氧-2＇-去氧鳥嘌呤核苷的N-糖苷鍵水解反應(yīng)機(jī)理．選擇水分子作為親核試劑不僅是由于水在生物體中的重要性，而且還由于水在由幾種酶催化的糖苷鍵斷裂過(guò)程中的重要作用．

2 計(jì)算原理和方法

為了減小去氧核糖糖環(huán)上羥基與親核試劑水分子和堿基的環(huán)外O8原子之間的氫鍵相互作用，在本文最終使用的計(jì)算模型中，用甲氧基代替了糖環(huán)上的O5＇-H羥基基團(tuán)和O3＇-H羥基基團(tuán)．

氣態(tài)中，用密度泛函B3LYP方法在標(biāo)準(zhǔn)的6－31＋＋G（d，p）基組對(duì)8-oxodG的水解反應(yīng)進(jìn)行了研究[9]．對(duì)各反應(yīng)途徑的反應(yīng)物、過(guò)渡態(tài)及產(chǎn)物的幾何構(gòu)型進(jìn)行了優(yōu)化，得到各駐點(diǎn)的能量，在優(yōu)化的幾何構(gòu)型基礎(chǔ)上進(jìn)行了振動(dòng)頻率計(jì)算，對(duì)各優(yōu)化駐點(diǎn)的總電子能量進(jìn)行了零點(diǎn)振動(dòng)能校正，并從過(guò)渡態(tài)分別向產(chǎn)物方向和反應(yīng)物方向進(jìn)行了內(nèi)稟反應(yīng)坐標(biāo)（IRC[10]）計(jì)算．所有的過(guò)渡態(tài)都通過(guò)振動(dòng)分析和IRC計(jì)算而得以確認(rèn)．非限制自旋UB3LYP方法用于開殼層體系的解析計(jì)算，穩(wěn)定點(diǎn)的性質(zhì)通過(guò)在相同水平上的振動(dòng)頻率分析來(lái)確認(rèn)：每個(gè)穩(wěn)定點(diǎn)的所有頻率為正，過(guò)渡態(tài)通過(guò)振動(dòng)模式分析，只含有一個(gè)虛頻，并且虛頻的振動(dòng)方向沿著反應(yīng)坐標(biāo)方向．在298．15K和一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓下通過(guò)頻率分析我們也得到零點(diǎn)能（ZPVE）、熱量校正、焓和吉布斯自由能．

在相同水平下，應(yīng)用自然鍵軌道（NBO）[11]計(jì)算了自然原子電荷和鍵級(jí)，并以氣態(tài)優(yōu)化結(jié)構(gòu)，考慮水作為溶劑，用極化連續(xù)模型[12，13]溶劑效應(yīng)．所有的計(jì)算用Gaussian03程序包計(jì)算[14]

3 結(jié)果與討論

3．1 各穩(wěn)定點(diǎn)的幾何結(jié)構(gòu)

對(duì)于8-oxodG與單個(gè)水分子作用的水解反應(yīng)中，一方面，我們考慮水分子有三種進(jìn)攻方式，即水分子可以從去氧核糖糖環(huán)的前方、下方和上方進(jìn)攻異頭碳C1＇（圖2）；另一方面，8-氧鳥嘌呤堿基的O8原子和N9原子都可以摘取去氧糖糖環(huán)的Ha2＇．

當(dāng)水分子按i）方向進(jìn)攻時(shí)，去氧核糖的環(huán)內(nèi)鍵O4＇-C1＇鍵斷裂，從而使糖環(huán)開環(huán)．因?yàn)樘黔h(huán)開環(huán)是雙功能DNA糖苷酶催化N-糖苷鍵斷裂的步驟之一．這些酶用其一個(gè)氮端的氨基基團(tuán)作為親核試劑，先打開糖環(huán)再與開環(huán)產(chǎn)物形成一個(gè)席夫堿，從而得到最終產(chǎn)物．然而，在我們的理論模型中，親核試劑不是氨基基團(tuán)，而是水分子，因此不可能形成席夫堿．而且，計(jì)算結(jié)果表明，水分子以i）方向親核進(jìn)攻得到的開環(huán)中間體能量非常高（約60kcal／mol），因此該反應(yīng)機(jī)理在后文中不予考慮，只考慮另外兩種進(jìn)攻方式．事實(shí)上，Zoltewicz[15]和他的的合作者的實(shí)驗(yàn)研究表明，一些嘌呤核苷的酸催化水解包括了C-O鍵斷裂，水解機(jī)理為：第一步是核苷堿基質(zhì)子化，第二步是N－糖苷鍵斷裂．

圖1 8－氧-2′-去氧鳥嘌呤核苷的結(jié)構(gòu)和原子編號(hào)Fig．1 Structures of 8-oxo-2＇-deoxyguanosine and atomic numbers

圖2 水分子進(jìn)攻8－氧-7，8-二氫-2′-去氧鳥嘌呤核苷的三種進(jìn)攻方式Fig．2 Three ways of 8-oxo-2＇-deoxyguanosine attacked by water

因此，在本研究工作中，我們考慮了四條反應(yīng)通道，即ii）進(jìn)攻方向上的O8摘?dú)浞磻?yīng)機(jī)理和N9摘?dú)浞磻?yīng)機(jī)理，以及iii）進(jìn)攻方向上的O8摘?dú)浞磻?yīng)機(jī)理和N9摘?dú)浞磻?yīng)機(jī)理．在去氧核苷的水解反應(yīng)中，最重要的步驟是N-糖苷鍵的斷裂，因此，我們將主要關(guān)注N-糖苷鍵的斷裂的能量和結(jié)構(gòu)，即反應(yīng)第一步的能量和結(jié)構(gòu)．

途徑一 在第一條反應(yīng)途徑中，親核試劑水分子從去氧核糖糖環(huán)的下方進(jìn)攻異頭碳C1＇原子并且由8-氧鳥嘌呤的N9原子摘取去氧糖糖環(huán)的Ha2＇，這條反應(yīng)途徑意味著異頭碳C1＇的結(jié)構(gòu)反轉(zhuǎn)．如圖3所示，在這種情況下，反應(yīng)的第一步通過(guò)將去氧核糖糖環(huán)的Ha2＇質(zhì)子轉(zhuǎn)移到堿基的N9原子產(chǎn)生一個(gè)類二氫呋喃中間體．第二步包括水分子加成到C-C雙鍵上，而勢(shì)能剖面圖和反應(yīng)物、過(guò)渡態(tài)、中間體和產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)見圖3．

水分子先與受損的去氧鳥苷作用形成8－氧去氧鳥苷－水復(fù)合物Ra，我們把Ra作為該反應(yīng)通道的反應(yīng)物．緊接著N-糖苷鍵發(fā)生扭轉(zhuǎn)，使二面角O4＇-C1＇-N9-C4逐漸減小，在反應(yīng)物中為261．46°，減小到第一個(gè)過(guò)渡態(tài)N-TSa1中的229．66°，但仍然保持反式結(jié)構(gòu)；同時(shí)N-糖苷鍵逐漸拉長(zhǎng)，由反應(yīng)物中的1．455到N-TSa1中的2．965，從圖中可看出，N-TSa1結(jié)構(gòu)的N9-C1＇鍵已經(jīng)斷裂，且鍵級(jí)為零．而Ha2＇氫原子與N9原子的距離也逐漸縮短，直到 N-TSa1中的1．879?．而從 NTSa1到第一個(gè)中間體N-INTa1的過(guò)程中，N9原子已與Ha2＇質(zhì)子相結(jié)合．而質(zhì)子化的受損堿基發(fā)生翻轉(zhuǎn)，不僅使二面角 O4＇-C1＇-N9-C4逐漸增大，由 N-TSa1中的229．66°，增加到 N-INTa1的254．32°，但仍然保持反式結(jié)構(gòu)；而且使堿基環(huán)外氨基的Ha2與OW之間發(fā)生氫鍵相互作用，OW與堿基上Ha2的距離為1．866?，鍵角OW－Ha2-N2為172．74°．

圖3 以途徑一進(jìn)行的8－氧-2′-去氧鳥嘌呤核苷水解吉布斯自由能剖面圖（kcal／mol）和優(yōu)化結(jié)構(gòu)及部分結(jié)構(gòu)參數(shù)（鍵長(zhǎng)：?）Fig．3 Gibbs free energy cross-section（kcal／mol）of 8-oxo-2＇-deoxyguanosine hydrolysis according to the first pathway and optimized structures along with their selected configuration parameters（bond lengths（in?））．

途徑二 在第二條反應(yīng)途徑中，水分子從糖環(huán)的上方進(jìn)攻異頭碳C1＇原子并且由8-氧鳥嘌呤的N9原子摘取去氧糖糖環(huán)的Ha2＇，這條反應(yīng)途徑意味著異頭碳C1＇的結(jié)構(gòu)保持．從圖4中可以看出，在這種情況下，反應(yīng)的第一步通過(guò)將去氧核糖糖環(huán)的Ha2＇質(zhì)子轉(zhuǎn)移到堿基的N9原子產(chǎn)生一個(gè)類二氫呋喃中間體．第二步包括水分子加成到C-C雙鍵上，而勢(shì)能剖面圖和反應(yīng)物、過(guò)渡態(tài)、中間體和產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)見圖4．

水分子先與受損的去氧鳥苷作用形成8-氧去氧鳥苷－水復(fù)合物Rb，我們把Rb作為該反應(yīng)通道的反應(yīng)物．緊接著N-糖苷鍵發(fā)生扭轉(zhuǎn)，使二面角O4＇-C1＇-N9-C4逐漸減小，在反應(yīng)物中為257．81°，減小到第一個(gè)過(guò)渡態(tài)N-TSb1中的229．30°，但仍然保持反式結(jié)構(gòu)；同時(shí)N-糖苷鍵逐漸拉長(zhǎng)，由反應(yīng)物中的1．456?到N-TSb1中的3．034?，從圖中可看出，N-TSb1結(jié)構(gòu)的N9-C1＇鍵已經(jīng)斷裂，且鍵級(jí)為零．而 Ha2＇氫原子與OW間的距離以及HaW原子與N9原子的距離也逐漸縮短，分別由反應(yīng)物中的2．626?和3．808?縮短到N-TSb1中的1．427?和1．398?，鍵角 OW－HaW－N9和C2＇-Ha2＇-OW分別為173．10°和171．06°．而從 N-TSb1到第一個(gè)中間體N-INTb1的過(guò)程中，N9原子與HaW質(zhì)子相結(jié)合，而OW與Ha2＇質(zhì)子相結(jié)合．二面角 O4＇-C1＇-N9-C4逐漸增大，由 N-TSb1中的229．30°，增加到N-INTb1的253．39°，但仍然保持反式結(jié)構(gòu)；堿基環(huán)與新形成的水分子之間發(fā)生氫鍵相互作用，OW與堿基N9上的HaW（由親核試劑水分子轉(zhuǎn)移到堿基上的質(zhì)子）的距離為1．875?，鍵角 OW－HaW－N9為174．30°．

途徑三 在第三條反應(yīng)途徑中，親核試劑水分子從去氧核糖糖環(huán)的下方進(jìn)攻異頭碳C1＇原子并且由8－氧鳥嘌呤的O8原子摘取去氧糖糖環(huán)的Ha2＇，這條反應(yīng)途徑意味著異頭碳C1＇的結(jié)構(gòu)反轉(zhuǎn)．從圖5中可以看出，在這種情況下，反應(yīng)的第一步通過(guò)將去氧核糖糖環(huán)的Ha2＇質(zhì)子轉(zhuǎn)移到堿基的O8原子產(chǎn)生一個(gè)類二氫呋喃中間體．第二步包括水分子加成到C-C雙鍵上，而勢(shì)能剖面圖和反應(yīng)物、過(guò)渡態(tài)、中間體和產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)見圖5．

圖4 以途徑二進(jìn)行的8-氧-2′-去氧鳥嘌呤核苷水解吉布斯自由能剖面圖（kcal／mol）和優(yōu)化結(jié)構(gòu)及部分結(jié)構(gòu)參數(shù)（鍵長(zhǎng)：?）Fig．4 Gibbs free energy cross-section（kcal／ mol）of 8-oxo-2＇-deoxyguanosine hydrolysis according to the second pathway and optimized structures along with their selected configuration parameters（bond lengths（in?））．

水分子先與受損的去氧鳥苷作用形成8-氧去氧鳥苷－水復(fù)合物Ra，我們把Ra作為該反應(yīng)通道的反應(yīng)物．緊接著N－糖苷鍵發(fā)生扭轉(zhuǎn)，使二面角O4＇-C1＇-N9-C4逐漸增加，在反應(yīng)物中為261．46°，增加到第一個(gè)過(guò)渡態(tài)中O-TSa1的263．36°，但仍然保持反式結(jié)構(gòu)；同時(shí)N-糖苷鍵逐漸拉長(zhǎng)，由反應(yīng)物中的1．468?到O-TSa1中的2．644?，從圖中可看出，O-TSa1結(jié)構(gòu)的N9-C1＇鍵已經(jīng)斷裂，且鍵級(jí)為零．而Ha2＇氫原子與O8原子的距離也逐漸縮短，直到 O-TSa1中的1．395?．而從 OTSa1到第一個(gè)中間體O-INTa1的過(guò)程中，O8原子已與 Ha2＇質(zhì)子相結(jié)合．二面角 O4＇-C1＇-N9-C4繼續(xù)逐漸增大，由O-TSa1中的263．36°，增加到OINTa1的287．86°，從而使堿基與糖環(huán)間的相對(duì)位置由反式變?yōu)榱隧槃?shì)．

途徑四 在第四條反應(yīng)途徑中，水分子從糖環(huán)的上方進(jìn)攻異頭碳C1＇原子并且由8-氧鳥嘌呤的O8原子摘取去氧糖糖環(huán)的Ha2＇，這條反應(yīng)途徑意味著異頭碳C1＇的結(jié)構(gòu)保持．從圖6中可以看出，在這種情況下，反應(yīng)的第一步通過(guò)將去氧核糖糖環(huán)的Ha2＇質(zhì)子轉(zhuǎn)移到堿基的O8原子產(chǎn)生一個(gè)類二氫呋喃中間體．第二步包括水分子加成到C-C雙鍵上，而勢(shì)能剖面圖和各條反應(yīng)通道的反應(yīng)物、過(guò)渡態(tài)、中間體和產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)見圖6．

水分子先與受損的去氧鳥苷作用形成8－氧去氧鳥苷－水復(fù)合物Rb，我們把Rb作為該反應(yīng)通道的反應(yīng)物．緊接著N－糖苷鍵發(fā)生扭轉(zhuǎn)，使二面角O4＇-C1＇-N9-C4逐漸增大，在反應(yīng)物中為257．81°，增大到第一個(gè)過(guò)渡態(tài)O-TSb1中的274．36°，從而使堿基與糖環(huán)間的相對(duì)位置由反式變?yōu)榱隧槃?shì)；同時(shí)N－糖苷鍵逐漸拉長(zhǎng)，由反應(yīng)物中的1．456到O-TSb1中的2．715，從圖中可看出，OTSb1結(jié)構(gòu)的N9-C1＇鍵已經(jīng)斷裂，且鍵級(jí)為零．而Ha2＇氫原子與OW間的距離以及HaW與O8原子的距離也逐漸縮短，分別由反應(yīng)物中的2．626?和3．808? 縮短到 O-TSb1中的1．365? 和1．272 ?，鍵角 OW－HaW－O8和 C2＇-Ha2＇-OW分別為168．91°和179．85°．

圖5 以途徑三進(jìn)行的8－氧-2′-去氧鳥嘌呤核苷水解吉布斯自由能剖面圖（kcal／mol）和優(yōu)化結(jié)構(gòu)及部分結(jié)構(gòu)參數(shù)（鍵長(zhǎng)：?）Fig．5 Gibbs free energy cross-section（kcal／mol）of 8-oxo-2＇-deoxyguanosine hydrolysis according to the third pathway and optimized structures along with their selected configuration parameters（bond lengths（in?））．

圖6 以途徑四進(jìn)行的8-氧-7，8-二氫-2′-去氧鳥嘌呤核苷水解吉布斯自由能剖面圖（kcal／mol）和優(yōu)化結(jié)構(gòu)及部分結(jié)構(gòu)參數(shù)（鍵長(zhǎng)：?）Fig．6 Gibbs free energy cross-section（kcal／mol）of 8-oxo-2＇-deoxyguanosine hydrolysis according to the fourth pathway and optimized structures along with their selected configuration parameters（bond lengths（in?））．

而從O-TSb1到第一個(gè)中間體O-INTb1的過(guò)程中，O8原子與HaW質(zhì)子相結(jié)合，而OW與Ha2＇質(zhì)子相結(jié)合．二面角 O4＇-C1＇-N9-C4再逐漸減小，由 O-TSb1 中的 274．36°，減小 到 O-INTb1 的256．30°，從而使堿基與糖環(huán)間的相對(duì)位置再由順式變回原來(lái)的反勢(shì)；堿基環(huán)與新形成的水分子之間發(fā)生弱相互作用，OW與堿基上O8原子的HaW（由親核試劑水分子轉(zhuǎn)移到堿基上的質(zhì)子）的距離為1．598 ?，鍵角 OW－HaW－O8 為 152．55°，且NBO分析表明，OW的孤對(duì)電子供給HaW－O8反鍵軌道的二階穩(wěn)定化能為37．79kcal／mol．

3．2 NBO分析

鍵級(jí)分析 鍵級(jí)的變化反映了化學(xué)鍵強(qiáng)度的變化，它與化學(xué)反應(yīng)有著密切的聯(lián)系，反映了化學(xué)反應(yīng)的實(shí)質(zhì)．對(duì)于該模型體系的所有駐點(diǎn)，我們?cè)贐3LYP／6-31＋＋G（d，p）水平上計(jì)算所得的部分鍵級(jí)分別列于表1中．從表1中可以發(fā)現(xiàn)，對(duì)于途徑一，反應(yīng)物中的C1-C2鍵和O4＇-C1鍵正常成鍵，其鍵級(jí)分別是0．9922和0．9012，到第一個(gè)過(guò)渡態(tài)時(shí)，由于N-糖苷鍵斷裂及C2＇-H的削弱，C1＇原子與C2＇原子間的相互作用和C1＇原子與O4＇原子間的相互作用增加，鍵級(jí)分別增加到1．1302和1．3898，已具有部分雙鍵性質(zhì)．最后在第一個(gè)中間體中，由于N－糖苷鍵斷裂及C2＇-H鍵的完全斷裂，C1＇原子與C2＇原子間的相互作用進(jìn)一步增加，C1＇-C2＇鍵的鍵級(jí)增加到1．8171，且成鍵軌道分析表明，C1＇-C2＇鍵確實(shí)包括一個(gè)σ鍵和一個(gè)π鍵，是典型的雙鍵；由于C1＇-C2＇鍵雙鍵的形成，C1＇原子與C2＇原子間的相互作用進(jìn)一步增加，從而C1＇原子與O4＇原子間的相互作用減小，使其鍵級(jí)減小到1．0091，恢復(fù)到單鍵．而反應(yīng)物、過(guò)渡態(tài)和中間體中C1＇-C2＇鍵的鍵長(zhǎng)分別為1．537?、1．452 ?和1．339?，O4＇-C1＇鍵的鍵長(zhǎng)分別為1．437?、1．275?和1．371?，這與其鍵級(jí)的變化是一致的．其他反應(yīng)途徑的相應(yīng)鍵長(zhǎng)和鍵級(jí)的變化與途徑一的相似．

表1 8-氧-2′-去氧鳥嘌呤核苷水解過(guò)程中部分物質(zhì)結(jié)構(gòu)參數(shù)（原子凈電荷：a．u．；鍵長(zhǎng)：?；鍵級(jí)）Table 1 Selected configuration parameters of 8-oxo-2＇-deoxyguanosine hydrolysis．（atomic charge（in a．u．），bond length（in?）and bond order（in a．u．））

電荷分析 原子凈電荷的變化反映了該原子在化學(xué)反應(yīng)過(guò)程中所起的作用，甚至是直接參與成鍵、斷鍵，它與化學(xué)反應(yīng)有著密切的聯(lián)系，反映了化學(xué)反應(yīng)的實(shí)質(zhì)．對(duì)于該模型體系的所有駐點(diǎn)，我們?cè)贐3LYP／6-31＋＋G（d，p）水平上計(jì)算所得的部分原子凈電荷分別列于表1中．從表1中可以發(fā)現(xiàn)，對(duì)于途徑一，反應(yīng)物中的C1＇原子、C2＇原子和 O4＇原子的原子凈電荷分別為0．2567、-0．4992和-0．6041．隨著反應(yīng)的進(jìn)行，三個(gè)原子的原子凈電荷也發(fā)生了改變．在第一個(gè)過(guò)渡態(tài)中，由于N-糖苷鍵斷裂是以異裂過(guò)程進(jìn)行，異頭碳C1＇原子帶正電荷，有利于O4＇原子的孤對(duì)電子離域到C1＇原子的空軌道，從而使O4＇原子的原子凈電荷減小到-0．4278，而C1＇原子的原子凈電荷增加到0．5288．由二階穩(wěn)定化能分析發(fā)現(xiàn)，由O4＇孤對(duì)電子C1＇的p空軌道的穩(wěn)定化能為5．71kcal／mol．又由于C2＇-H的削弱，使C2＇原子的原子凈電荷增加到-0．62116．最后在第一個(gè)中間體中，由于C2＇-H鍵的完全斷裂，Ha2＇以質(zhì)子形式脫離糖環(huán)，使C2＇原子的負(fù)電荷增加，從而C1＇原子與C2＇原子間的相互作用進(jìn)一步增加，正負(fù)電荷部分抵消，結(jié)果是C1＇原子與C2＇原子間形成雙鍵，且C1＇原子與C2＇原子的凈電荷分別降低到0．1592和-0．3850．由于C1＇＝C2＇雙鍵的形成，C1＇原子的凈電荷降低，則O4＇原子的孤對(duì)電子離域到C1＇原子的空軌道的能力減低，結(jié)果O4＇原子的原子凈電荷又增加到-0．5603．用相同的方法可以分析其他反應(yīng)途徑的相應(yīng)原子凈電荷的變化，可得出與途徑一相似的結(jié)論．

其實(shí)，這四個(gè)反應(yīng)途徑中，C1＇原子上的正電荷和 O4＇-C1＇鍵 及 C1＇-C2＇鍵的縮短都可以用過(guò)渡態(tài)中去氧核糖糖環(huán)的氧碳正離子性質(zhì)來(lái)解釋．從圖3—圖6中可看出，這四條反應(yīng)途徑中，第一個(gè)過(guò)渡態(tài)結(jié)構(gòu)的N9-C1＇鍵已經(jīng)斷裂，鍵級(jí)為零．因此，在堿基和去氧核糖糖環(huán)之間存在重要的電荷分離．在反應(yīng)途徑一中，整個(gè)8-鳥嘌呤和去氧核糖糖環(huán)的電荷分別為-0．857和＋0．850，而在反應(yīng)途徑二中，則分別為-0．752和＋0．743，在反應(yīng)途徑三中，則分別為-0．700和＋0．717，在反應(yīng)途徑四中，則分別為-0．733和＋0．704．

3．3 能量分析

根據(jù)在B3LYP／6-31＋＋G（d，p）水平上計(jì)算所得的相對(duì)能量的變化趨勢(shì)所描繪的能級(jí)示意圖如圖3-圖6所示．從圖中可以發(fā)現(xiàn)，四條反應(yīng)途徑中，第一步即糖苷鍵斷裂的相對(duì)能量最高，分別為49．34、47．31、42．50和41．99kcal／mol．第三條和第四條反應(yīng)途徑的活化能壘相近，只相差0．51kcal／mol；而第一條和第二條反應(yīng)途徑的活化能壘相近，相差2．03kcal／mol，且二者所需活化能較高．因此，從動(dòng)力學(xué)上看，第三條和第四條反應(yīng)途徑比另外兩條途徑具有優(yōu)勢(shì)，反應(yīng)主要通過(guò)途徑三和途徑四進(jìn)行水解．

另一方面，這兩種進(jìn)攻方式的重要區(qū)別在于水分子在反應(yīng)過(guò)程所起的作用不同．對(duì)N9原子摘取質(zhì)子的反應(yīng)而言，在途徑一中，水分子沒(méi)有直接參與到反應(yīng)中，N9原子直接從去氧核糖糖環(huán)的C2＇原子摘取 Ha2＇質(zhì)子，然而，在途徑二中，C2＇原子的Ha2＇質(zhì)子遷移到水分子，而后水分子的另一個(gè)質(zhì)子再遷移到N9原子．后者是一種“溶劑輔助”效應(yīng)，與反轉(zhuǎn)方式相比較，降低活化能壘大約2 kcal／mol．這個(gè)過(guò)程降低能壘的程度不如其他過(guò)程降低活化能的程度大[16]，因?yàn)檫@一步所需的能量主要作用于N－糖苷鍵的裂解．

由于真實(shí)的水解反應(yīng)都是在溶劑中進(jìn)行的，所以對(duì)于模型反應(yīng)我們也考慮了溶劑化效應(yīng)．我們選取水作為溶劑，在PCM／B3LYP／6-31＋＋G（d，p）／／B3LYP／6-31＋＋G（d，p）水平上計(jì)算了各駐點(diǎn)的單點(diǎn)能，其相對(duì)能量變化如圖3-圖6所示．從圖中可以看出，溶劑水對(duì)上述反應(yīng)的溶劑化效應(yīng)不明顯，其相對(duì)自由能有所下降，但總的反應(yīng)趨勢(shì)沒(méi)有發(fā)生改變，與氣態(tài)中的反應(yīng)趨勢(shì)相同．所以，在水溶劑中，途徑三和途徑四仍然是優(yōu)勢(shì)途徑．

4 小 結(jié)

本文用密度泛函DFT方法研究了N－糖苷鍵水解的反應(yīng)機(jī)理．對(duì)模型體系采用了B3LYP方法在6-31＋＋G（d，p）基組上對(duì)所有駐點(diǎn)進(jìn)行了全優(yōu)化．為了更好的理解水解反應(yīng)機(jī)理，我們還研究了反應(yīng)過(guò)程中鍵級(jí)和原子凈電荷的變化、溶劑水對(duì)反應(yīng)的溶劑化效應(yīng)．研究結(jié)果表明，從水分子的進(jìn)攻方向來(lái)看，8-oxodG與單個(gè)水分子作用的水解反應(yīng)中，水分子有兩個(gè)進(jìn)攻方向，即水分子可以從去氧核糖糖環(huán)的上方和下方進(jìn)攻異頭碳C1＇．結(jié)果，當(dāng)水分子從去氧核糖糖環(huán)的下方進(jìn)攻異頭碳C1＇時(shí)，異頭碳C1＇反應(yīng)前后構(gòu)型發(fā)生反轉(zhuǎn)，而當(dāng)水分子從去氧核糖糖環(huán)的上方進(jìn)攻異頭碳C1＇時(shí)，異頭碳C1＇反應(yīng)前后構(gòu)型保持不變．另一方面，8-氧鳥嘌呤堿基的O8原子和N9原子都可以摘取去氧核糖糖環(huán)的 Ha2＇．因此，8-oxodG與單個(gè)水分子作用的水解反應(yīng)有四條不同的反應(yīng)通道，且每條反應(yīng)通道都包括兩步，都形成類雙氫呋喃中間體．計(jì)算結(jié)果表明，O8原子摘取去氧糖糖環(huán)Ha2＇的反應(yīng)的兩條反應(yīng)途徑的第一步的活化能相近，途徑三的活化能為42．50kcal／mol，比途徑四的高0．51kcal／mol；而N9原子摘取去氧糖糖環(huán)Ha2＇的反應(yīng)的兩條反應(yīng)途徑的第一步的活化能也相近，反轉(zhuǎn)過(guò)程的活化能為49．34kcal／mol，比保留過(guò)程的活化能（47．31kcal／mol）高2．03kcal／mol．

由于N-糖苷鍵異裂的裂解能太高，N-糖苷鍵水解所需的活化能仍然相當(dāng)高，因此，N-糖苷鍵的水解需要有催化劑的參與，而在人體內(nèi)，存在各種酶參與N-糖苷鍵的水解．事實(shí)上，類二氫呋喃中間體的形成是一種保持生物體系內(nèi)電中性的有利途徑．

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