生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

馬宗琪，衣 寧，趙文倩，邱念偉

生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

馬宗琪，衣 寧，趙文倩，邱念偉

（曲阜師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 曲阜 273165）

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作是生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的一項(xiàng)重要內(nèi)容，正確繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線是獲得準(zhǔn)確可靠實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的前提。文中以蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線為例，詳細(xì)介紹了標(biāo)準(zhǔn)曲線的數(shù)學(xué)求解方法和Excel操作方法，避免了以往徒手繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的誤差，從而快速地繪制出最好的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

標(biāo)準(zhǔn)曲線；生物學(xué)實(shí)驗(yàn)；繪制方法；直線回歸

很多生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中均需要繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如生物材料中各類化合物或礦質(zhì)元素含量的測(cè)定、酶活性的測(cè)定、細(xì)菌生物量的測(cè)定等。這些實(shí)驗(yàn)中標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制大多仍以傳統(tǒng)的坐標(biāo)紙法為主，這種徒手繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線主觀性較強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)誤差較大。如，手工繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，即使數(shù)據(jù)相同，每個(gè)人畫(huà)出的標(biāo)準(zhǔn)曲線都不相同，可以繪制出無(wú)數(shù)條回歸直線，哪條直線最好呢？統(tǒng)計(jì)學(xué)上的“最小二乘法”原理告訴我們，每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)距離回歸直線的離差平方和最小的直線是最好的回歸線［1］。根據(jù)這一原理，利用微積分學(xué)中的求極值的方法，可以求出回歸直線的斜率和截距，從而得到最好的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

由于部分生物類專業(yè)的學(xué)生未學(xué)習(xí)統(tǒng)計(jì)學(xué)方面的課程，或者對(duì)Excel中統(tǒng)計(jì)功能不熟悉，不能熟練掌握上述繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的數(shù)學(xué)原理雖然比較復(fù)雜，但數(shù)據(jù)運(yùn)算過(guò)程比較簡(jiǎn)單，具有中學(xué)數(shù)學(xué)知識(shí)的大學(xué)生均可輕松學(xué)會(huì)。尤其是有Excel辦公軟件的幫助，只需簡(jiǎn)單操作就可快速繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。本文將標(biāo)準(zhǔn)曲線的計(jì)算原理進(jìn)行簡(jiǎn)化，以生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常用到的可溶性蛋白含量測(cè)定法（考馬斯亮藍(lán)法）為例［2］，介紹Excel辦公軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的簡(jiǎn)單操作辦法，使讀者不僅知其然，也知其所以然。

1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的統(tǒng)計(jì)學(xué)原理和求解過(guò)程

在酸性環(huán)境中，棕紅色的考馬斯亮藍(lán)G250通過(guò)疏水力與蛋白質(zhì)相結(jié)合生成藍(lán)色化合物，在595mm處有最大光吸收，顏色深淺與蛋白質(zhì)含量呈正比［3］。該法測(cè)定可溶性蛋白含量操作簡(jiǎn)便、靈敏快速、干擾少，是生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)中使用率最高的方法之一。測(cè)定時(shí)，以牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)樣品，本文測(cè)得的標(biāo)準(zhǔn)樣品的A595數(shù)據(jù)如表1所示。

1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線一元一次回歸模型的說(shuō)明

因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)樣品中蛋白質(zhì)濃度與吸光度A595呈直線關(guān)系，因此，兩個(gè)變量間的關(guān)系可用Y=a+bX表示。其中，b稱為回歸系數(shù)；a稱為回歸截距。一般把可控變量作為自變量X，因此，把標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)濃度作為X，吸光度A595作為Y。根據(jù)最小二乘法原理，可用下式求出a值和b值。

表1 蛋白質(zhì)濃度與吸光度A595的相關(guān)性

1.2 a值和b值求解過(guò)程

分別代入式（1）和式（2）得：

所以，蛋白質(zhì)濃度（X）與吸光度A595（Y）的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：

這樣，測(cè)得未知濃度的蛋白質(zhì)樣品的吸光度后，就可以代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出樣品的蛋白質(zhì)濃度了。注意：X為蛋白質(zhì)濃度，Y為吸光度，是代入Y求X。

表2 a值和b值求解過(guò)程

1.3 過(guò)原點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線求解方法

繪制蛋白質(zhì)濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，一般要使直線通過(guò)原點(diǎn)，即當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度為零時(shí)，要將吸光度調(diào)零，以消除本底干擾。這時(shí)截距a=0，斜率b的計(jì)算公式如下：

b值的求解過(guò)程如表3所示。由表3得：

代入式（3）得：

所以，蛋白質(zhì)濃度（X）與吸光度A595（Y）過(guò)原點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：

表3 曲線過(guò)原點(diǎn)時(shí)b值求解過(guò)程

2 用Excel獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的方法

標(biāo)準(zhǔn)曲線可由a和b兩個(gè)參數(shù)決定，故只需求出a和b。雖然僅是加減乘除和開(kāi)方運(yùn)算，但運(yùn)算過(guò)程較煩瑣，手動(dòng)計(jì)算時(shí)容易出錯(cuò)。Excel辦公軟件中有編寫(xiě)好的運(yùn)算函數(shù)，可以幫助我們自動(dòng)求出a和b；也可以用Excel中的散點(diǎn)圖自動(dòng)求出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。操作過(guò)程既簡(jiǎn)便又快速。

2.1 用Excel函數(shù)求a值和b值

首先，將X值和Y值依次輸入Excel表格，如圖1所示；然后，在任意空白單元格輸入Excel函數(shù)。求a值的Excel函數(shù)為“Intercept”，求b值的Excel函數(shù)為“Linest”。

具體方法如下：

1）求a值。在任意空白單元中輸入“=intercept（y's，x's）”，在“y's”處輸入Y值所在區(qū)域，在“x's”處輸入X值所在區(qū)域，按回車(chē)鍵就會(huì)自動(dòng)計(jì)算出a值。舉例來(lái)說(shuō)，如果蛋白質(zhì)濃度數(shù)據(jù)在單元格B1至H1，吸光度A595數(shù)據(jù)在單元格B2至H2，則輸入“=intercept（B2：H2，B1：H1）”，按回車(chē)鍵后，單元格顯示“0.014 5”，就是a值。

圖1 用Excel函數(shù)求a值和b值方法演示

2）求b值。在任意空白單元格輸入“=linest（y's，x's，true or false）”，在“y's”處輸入Y值所在區(qū)域，在“x's”處輸入X值所在區(qū)域，并輸入true或者false，按回車(chē)鍵就會(huì)自動(dòng)計(jì)算出b值?！皌rue”表示截距不為0，“false”表示截距必須為0。舉例來(lái)說(shuō)，如果在單元格中輸入“=linest（B2：H2，B1：H1，true）”，按回車(chē)鍵后，單元格顯示數(shù)字“0.757 6”；在單元格中輸入“=linest（B2：H2，B1：H1，false）”，按回車(chē)鍵后，單元格顯示數(shù)字“0.777 9”。

注意：Excel函數(shù)輸入時(shí)不分大小寫(xiě)，函數(shù)名稱前要輸入“=”號(hào)，名稱后要輸入“（）”號(hào)?！埃ǎ敝衁值在前，X值在后，不可顛倒，X值和Y值排列順序也要一致。

2.2 用Excel散點(diǎn)圖求a值和b值

用Excel中的散點(diǎn)圖同樣可以自動(dòng)求出標(biāo)準(zhǔn)曲線的a值和b值，并繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。具體操作方法為：將X值和Y值依次輸入Excel表格，按左鍵用鼠標(biāo)選中數(shù)據(jù)，點(diǎn)擊窗口上方的“插入”，選“圖表”，再選對(duì)話框中的“散點(diǎn)圖”，點(diǎn)擊“完成”。Excel就自動(dòng)畫(huà)出了標(biāo)準(zhǔn)曲線的散點(diǎn)圖，如圖2所示。

用鼠標(biāo)左鍵選中圖中數(shù)據(jù)點(diǎn)，點(diǎn)擊右鍵，選“添加趨勢(shì)線”，在對(duì)話框的回歸線“類型”中選“直線”。在“選項(xiàng)”中點(diǎn)擊“顯示公式”，若需要截距為零，則再點(diǎn)擊“設(shè)置截距=0”，也可以點(diǎn)擊“顯示R平方值”，以幫助判斷標(biāo)準(zhǔn)曲線的優(yōu)劣。點(diǎn)擊“確定”，就可得到蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖和曲線方程。

圖2 用Excel繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線

3 結(jié)束語(yǔ)

雖然用Excel辦公軟件可以快速準(zhǔn)確地獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，但學(xué)生也應(yīng)掌握標(biāo)準(zhǔn)曲線的運(yùn)算過(guò)程，才能做到“既知其然，又知其所以然”。至于最小二乘法原理，學(xué)生可以不必深究，只要知道用這種方法獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線與實(shí)驗(yàn)值誤差最小，是最好的回歸線就可以了。傳統(tǒng)的坐標(biāo)紙法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線已經(jīng)不適合現(xiàn)代生物學(xué)實(shí)驗(yàn)需要，本文介紹的方法可以在大學(xué)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中推廣。

［1］李春喜，邵云，姜麗娜.生物統(tǒng)計(jì)學(xué)［M］.4版.北京：科學(xué)出版社，2008：124－133.

［2］張志良，瞿偉菁，李小方.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)［M］. 4版.北京：高等教育出版社，2009：125－126.

［3］Bradford M M.A rapid and sensitive method for the quantization ofmicrogram quantities of protein utilizing the principle of protein－dye binding［J］.Anal.Biochem，1976，72：248－254.

Protract of Standard Curve in Biological Experiments

MA Zongqi，YINing，ZHAOWenqian，QIU Nianwei
（College of Life Science，Qufu Normal University，Qufu 273165，China）

Protract standard curve is an important content in biological experiments.Correct curvemaking is the basis to obtain accurate and reliable experimental data.In this paper，we take protein standard curve as an example and introduce the computingmethods and operation method by Excel.Thismethod can avoid the errors in freehand standard curve and can create the best standard curve quickly.

standard curve；biological experiments；creatingmethod；linear regression

Q－33；Q51

B

10.3969/j.issn.1672－4550.2014.05.003

2013－10－16

國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃資助項(xiàng)目（2013A048）；曲阜師范大學(xué)教學(xué)改革資助項(xiàng)目（JG－ZZ12053）。

馬宗琪（1964－），男，大學(xué)，實(shí)驗(yàn)師，主要從事實(shí)驗(yàn)室管理和生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)研究工作。