內含肽介導的鼠多瘤病毒樣顆粒生產(chǎn)表達和純化

董曉燕，劉曉丹，張 麟(天津大學化工學院，天津 300072)

內含肽介導的鼠多瘤病毒樣顆粒生產(chǎn)表達和純化

董曉燕，劉曉丹，張 麟
(天津大學化工學院，天津 300072)

鼠多瘤病毒樣顆粒(VLPs)可由結構蛋白VP1自組裝而成，可用于疫苗開發(fā)、基因治療、藥物傳遞和生物材料等方面．針對目前VP1生產(chǎn)中需要凝血酶去除谷胱甘肽S-轉移酶(GST)標簽，生產(chǎn)成本較高、操作復雜的問題，利用內含肽(intein)自剪切的特征，將內含肽插入到VP1與GST標簽之間進行融合表達，表達產(chǎn)物經(jīng)親和色譜純化，并通過改變柱內pH值、溫度誘導內含肽剪切，使VP1與GST-intein分離從而獲得VP1蛋白，產(chǎn)量為4,mg/(L培養(yǎng)基)．純化的VP1可自組裝成與天然鼠多瘤病毒樣顆粒一致的VLPs．結果表明，內含肽介導鼠多瘤病毒樣顆粒生產(chǎn)純化流程簡單易行，且無需凝血酶參與，大幅降低成本，為VLPs的高效制備奠定了基礎．

鼠多瘤病毒；病毒樣顆粒；親和色譜；VP1；自組裝；內含肽；自剪切

病毒樣顆粒(virus-like particles，VLPs)[1]是由一種或多種病毒結構蛋白自組裝所形成的空心顆粒，由于其缺乏病毒基因組，且具有與天然病毒接近的結構特征和免疫原性，因此它能誘導免疫應答反應而無感染性，特別適合進行相關疫苗的研發(fā)．目前已有多種不同VLPs疫苗的研究報道，其中能夠成功抵御乙型肝炎病毒[2]和人乳頭狀瘤病毒的VLPs疫苗已應用于臨床[3-4]．此外，其應用不僅限于自身病毒的VLPs疫苗研究，還可作為載體平臺用于其他病原的疫苗研究，形成嵌合VLPs疫苗[5]或偶聯(lián)VLPs疫苗[6]．同時，由于VLPs獨特的空殼結構，近年來在基因治療[7]、藥物傳遞[8]和新型生物材料[9-10]等方面的研究也取得了一定突破．

鼠多瘤病毒(murine polyomavirus，MPV)屬于多瘤病毒屬，為無包膜的閉環(huán)雙鏈DNA病毒，是二十面立體對稱(T=7d)結構，粒徑約為50,nm[11]；病毒衣殼包含3種結構蛋白，即VP1、VP2和VP3，其中VP1蛋白是最主要的結構蛋白[12]；5個VP1通過二硫鍵連接形成五聚體(capsomere)的衣殼粒，72個衣殼粒自組裝成VLPs[1]．由于對鼠多瘤病毒的研究較為深入，且其結構較為簡單、形成過程比較清楚，因此成為VLPs研究的重要模型．

VP1可在真核的酵母細胞[13]和昆蟲細胞[14]中表達并組裝成VLPs，但此類VLPs中常包裹雜質且粒徑不均一，在后期的分離純化過程中還需要對其進行去組裝和再組裝，不僅增加了操作的復雜性，降低了生產(chǎn)效率，且提高了成本，因此不適合大規(guī)模生產(chǎn)[15].然而，若在原核的大腸桿菌中表達VP1，雖然其能在胞內自組裝成衣殼粒，但不會繼續(xù)組裝成VLPs，這樣便可在分離純化后進行VLPs的體外組裝，從而提高生產(chǎn)效率、降低成本，是目前研究的重點[12,16]．研究人員嘗試使用各種方法提高VP1在大腸桿菌中的表達量，其中最有效的方法是將VP1與谷胱甘肽S-轉移酶(GST)標簽進行融合表達[17-18]，隨后利用GST親和色譜將融合蛋白與其他物質分離，再用凝血酶切去標簽得到VP1．此方法雖然可獲得較純的VP1，但凝血酶價格昂貴且容易導致對目標蛋白錯誤剪切，因此表達和純化成本高、效率低，阻礙其大規(guī)模生產(chǎn)和應用．

內含肽(intein)[19-20]是蛋白質翻譯產(chǎn)物在成熟過程中靠自我剪切的方式從前體蛋白中分離出來的一段多肽．經(jīng)過定點突變修飾后的內含肽經(jīng)誘導能夠介導N端或C端單側肽鍵斷裂，已成功用于蛋白質的分離純化[21-22]．為了簡便且經(jīng)濟地得到VP1，本研究借助內含肽介導的蛋白質純化技術步驟少、避免使用凝血酶切割標簽的優(yōu)勢，構建內含肽介導的VP1表達純化流程，將內含肽基因序列插入到GST和VP1基因序列之間，通過大腸桿菌表達GST-intein-VP1融合蛋白，再利用GST親和色譜進行純化并誘導內含肽柱內剪切，將分離得到的VP1體外自組裝成VLPs．該流程有望簡化鼠多瘤病毒樣顆粒的生產(chǎn)純化流程并大幅降低成本，為VLPs的研究、生產(chǎn)和應用奠定基礎．

1 材料和方法

1.1 材料

質粒pTWINⅠ購自NEB；表達質粒pGEX-4T-1-VP1由北京華大基因公司構建，本實驗室保藏；E.coli DH5α、E.coli BL21(DE3)、T4,DNA連接酶、Fast-pfu DNA聚合酶、限制性內切酶BamHⅠ和EcoRⅠ、質粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒均購自TIANGEN公司；蛋白marker購自全式金公司；DNA marker購自TaKaRa公司；GSTrap HP column購自GE Healthcare Bio-sciences公司；胰蛋白胨、酵母提取物購自OXOID公司；異丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)購自Genview公司；丙烯酰胺、過硫酸銨、TEMED等試劑均為國產(chǎn)分析純；透析袋購自北京鼎國生物技術有限公司．

PCR引物合成由北京華大基因合成；重組質粒DNA序列由北京天一輝遠生物技術公司測定．

LB固體培養(yǎng)基：10,g/L胰蛋白胨，5,g/L酵母提取物，10,g/L NaCl，15,g/L瓊脂粉，含100,μg/mL氨芐青霉素．TB液體培養(yǎng)基：12,g/L胰蛋白胨，24,g/L酵母提取物，0.4%(體積分數(shù)，下同)甘油，2.31,g/L KH2PO4，12.54,g/L K2HPO4，含100,μg/mL氨芐青霉素．

1.2 方法

1.2.1 pGEX-4T-1-intein-VP1表達載體構建和鑒定

采用PCR法從pTWINⅠ質粒上擴增出Ssp DnaB intein基因片段，根據(jù)質粒情況設計引物：上游5’-CGGGATCC GCTATCTCTGGCGATAGTC-3’，下游5’-GGAATTC GTTGTGTACAATGATGATGTCATT C-3’(下劃線分別為BamHⅠ、EcoRⅠ酶切位點)．PCR反應體系為：2,ng pTWINⅠ模板，10,pmol上、下游引物，30,U Fast-pfu DNA聚合酶，ddH2O補齊至25,μL．反應條件為：94,℃預變性2.0,min，94,℃變性0.5,min，51,℃退火0.5,min，72,℃延伸0.5,min，30個循環(huán)后72,℃延伸10,min．PCR產(chǎn)物Ssp DnaB intein基因片段中第272位包含DraⅠ酶切位點，因此用DraⅠ酶切鑒定．

通過1.5%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物．將膠回收到的Ssp DnaB intein基因片段和pGEX-4T-1-VP1質粒分別用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切，酶切產(chǎn)物分別經(jīng)1.5%和1.0%瓊脂糖凝膠電泳純化后回收，之后將二者混合，加入T4,DNA連接酶于16,℃反應4,h，構建出pGEX-4T-1-intein-VP1表達載體(見圖1)．取連接產(chǎn)物轉化E.coli DH5α感受態(tài)細胞，通過氨芐青霉素抗性篩選陽性克隆，用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切鑒定陽性克隆，并對初步篩選出的陽性克隆的DNA序列進行測定．

1.2.2 融合蛋白表達

培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件參照文獻[18, 23]．將鑒定序列正確的重組質粒pGEX-4T-1-intein-VP1轉化至E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細胞，涂布于LB平板上37,℃過夜培養(yǎng)．挑取單菌落接種于25,mL的TB培養(yǎng)基中，置于37,℃搖床170,r/min過夜培養(yǎng)．將種子液按1∶100比例接種到250,mL TB培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，37,℃、170,r/min培養(yǎng)至OD600為0.5～0.6時加入IPTG(最終濃度0.3,mmol/L)，26,℃誘導24,h．

圖1 pGEX-4T-1-intein-VP1重組質粒的構建示意Fig.1 Construction strategyof recombinant plasmid pGEX-4T-1-intein-VP1

取培養(yǎng)后的菌液于4,℃、4,500,r/min離心，收集菌體，加入100,mL預冷的平衡緩沖液(40,mmol/L Tris-HCl，200,mmol/L NaCl，1,mmol/L EDTA，5%甘油，5,mmol/L DTT，pH 8.0)重懸菌體，置冰水浴中超聲破碎(400,Hz，40%輸出功率，工作4,s，間歇6,s，90個循環(huán))，4,℃、12,000,r/min離心30,min，分別取全菌、上清、沉淀用SDS-PAGE分析蛋白的表達情況．1.2.3 內含肽的剪切和VP1的親和純化

取30,mL上述破菌上清，首先以0.5,mL/min流速上樣至預先用平衡緩沖液平衡的GSTrap HP column色譜柱(5,mL)中，帶GST標簽的融合蛋白吸附在介質上，而雜蛋白洗脫，然后用5倍柱體積的平衡緩沖液沖洗色譜柱直至基線平穩(wěn)；之后改變柱內pH值，將流動相變?yōu)榧羟芯彌_液(40,mmol/L Tris-HCl，200,mmol/L NaCl，1,mmol/L EDTA，5%甘油，5,mmol/L DTT，pH 7.0)，待剪切液完全充滿色譜柱后關閉色譜柱出入口，誘導內含肽在柱內發(fā)生剪切，以分離得到VP1(見圖2)．

內含肽剪切需要合適的pH值和溫度，為了得到最佳的剪切效果，本文從剪切液pH值(7.0、8.0、9.0)、剪切溫度(4,℃、25,℃、37,℃)、剪切時間(0,h、14,h、24,h、36,h、48,h、60,h)3個方面進行了優(yōu)化．

圖2 內含肽介導的VP1純化過程Fig.2 Process of intein-mediated VP1 purification

1.2.4 VLPs的自組裝

使用截留分子質量為8,000～14,000,ku的透析袋[18]，通過兩步透析法使VP1組裝成VLPs：①將純化的VP1溶液加入透析袋，置于組裝緩沖液1(500,mmol/L(NH4)2SO4，20,mmol/L Tris-HCl，5%(體積分數(shù))甘油，1,mmol/L CaCl2，pH 7.4)中透析17,h；②將透析袋置于組裝緩沖液2(200,mmol/L NaCl，20,mmol/L Tris-HCl，5%甘油，1,mmol/L CaCl2，pH 7.4)中繼續(xù)透析24,h．

1.2.5 VLPs形態(tài)學分析

VP1經(jīng)兩步透析組裝成VLPs后，取10,μL VLPs樣品滴于碳膜包被的銅網(wǎng)上，室溫放置，待銅網(wǎng)干燥后，在銅網(wǎng)上滴2滴2%的磷鎢酸(pH 7.0)負染15,min，用Tecnai G2,F20場發(fā)射電子顯微鏡觀察樣品形態(tài)．

2 結果與討論

2.1 重組質粒pGEX-4T-1-intein-VP1的構建

利用第1.2.1節(jié)所述方法PCR擴增出的Ssp DnaB intein基因片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后發(fā)現(xiàn)條帶位于500,bp前方，與預期片段大小(462,bp)一致；PCR產(chǎn)物經(jīng)DraⅠ酶切后得到2個片段(200,bp和272,bp)在200,bp附近(見圖3(a))．因此初步判斷擴增的PCR產(chǎn)物是預期的目標片段．

將Ssp DnaB intein基因片段插入pGEX-4T-1-VP1質粒后，轉化感受態(tài)細胞，篩選出的陽性克隆重組質粒用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切進行驗證，酶切后在500,bp前方有Ssp DnaB intein目標條帶(見圖3(b))，表明Ssp DnaB intein基因已經(jīng)正確插入表達質粒中．對酶切鑒定后的陽性克隆進行全基因測序，結果100%正確(結果未顯示)．

圖3 PCR產(chǎn)物及重組質粒的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.3 Agarose gel electrophoresis of PCR product and recombinant plasmid

2.2 融合蛋白GST-intein-VP1的表達

用篩選出的陽性克隆挑取單菌落接種于TB培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，之后擴大培養(yǎng)，在OD600達到0.5～0.6時加入IPTG誘導GST-intein-VP1融合蛋白表達(見圖4條帶1～3)．從條帶2看出融合蛋白多數(shù)在沉淀中形成包涵體，而且在預實驗中發(fā)現(xiàn)，融合蛋白中內含肽的剪切效率較低，僅為10%．因為與內含肽C端相鄰的目標蛋白的第1個氨基酸對內含肽切割效率有很大影響[24]，為了提高切割效率，隨后將與內含肽C端相鄰的第1個氨基酸由Gln突變?yōu)橛欣诩羟械腉ly[20]．研究發(fā)現(xiàn)突變后融合蛋白可溶表達(見圖4條帶4～6)，表達量為(95±5),mg/(L培養(yǎng)基)．

圖4 融合蛋白表達結果的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of fusion protein expression

2.3 切割條件的確定

為了得到最佳的剪切效果，從剪切時間、剪切液pH值、溫度3方面對剪切條件進行優(yōu)化(見圖5)．從圖5中可以看出，融合蛋白切割量隨時間的延長而增加，但切割時間超過36,h后不再增加；在pH7.0、37,℃時，切割效率與其他條件相比較高，但考慮到37,℃長時間放置蛋白容易變性，且37,℃與25,℃相比切割效率相差不大，因此選擇在pH 7.0、25,℃切割36,h．

圖5 內含肽自剪切條件優(yōu)化Fig.5 Optimal conditions of intein self-cleavage

2.4 融合蛋白的剪切和親和純化

剪切液在吸附有融合蛋白的親和色譜中停留36,h后用平衡緩沖液洗脫剪切下來的VP1，收集洗脫液，并對洗脫液做SDS-PAGE分析(見圖6)．

圖6 內含肽柱內剪切后純化VP1的結果Fig.6Result of purificated VP1 after intein cleavage in column

剪切后在色譜柱中收集到的在40,ku和50,ku間的產(chǎn)物電泳條帶，與VP1標準品分子質量相同，即為融合蛋白上剪切下來的VP1；此外還有一條雜帶，可能是因為非特異性吸附在色譜介質上的雜蛋白融入了剪切液中．通過Bradford法測洗脫液中VP1的濃度，計算得VP1產(chǎn)量為4,mg/(L培養(yǎng)基)，與目前直接表達GST-VP1融合蛋白之后用凝血酶切割的方法(90,mg/(L培養(yǎng)基))相比表達量低[18]．VP1產(chǎn)量較低的原因可能是：①在融合蛋白的表達過程中，有一部分融合蛋白在胞內發(fā)生了自剪切，導致破菌上清液中含有較多不帶GST標簽的VP1蛋白，在后續(xù)的分離純化過程中這部分VP1蛋白不能吸附在親和色譜介質上，從而降低了VP1蛋白的得率；②因為GST(26,ku)和VP1(42.5,ku)的空間結構較內含肽(17,ku)而言大很多，這二者可能會影響到內含肽的空間結構，從而影響內含肽的剪切效率．

2.5 VLPs形態(tài)學分析

為證明所得VP1蛋白結構正確，按照第1.2.4節(jié)所述方法通過兩步透析法進行VLPs自組裝，并使用透射電鏡觀察(見圖7)．結果表明，結構蛋白VP1組裝成了直徑40～50,nm的球狀VLPs，與天然鼠多瘤病毒樣顆粒大小一致，證明所得VP1結構正確．

圖7 VP1組裝的VLPs的透射電鏡圖Fig.7 Transmission electron micrograph of VLPs assembled from VP1

3 結 語

研究利用內含肽自剪切作用，構建內含肽介導的VP1表達純化流程，即將內含肽插入到GST標簽和VP1之間，通過親和色譜分離純化并改變色譜柱內pH值和溫度誘導內含肽自剪切以獲得VP1蛋白，經(jīng)體外自組裝得到具有天然結構的VLPs．本文構建的生產(chǎn)純化流程無需昂貴的凝血酶參與，極大地降低了生產(chǎn)成本且簡化了流程，為VLPs的高效制備奠定了基礎．

［1］ Pattenden L K，Middelberg A P J，Niebert M，et al. Towards the preparative and large-scale precision manufacture of virus-like particles [J]. Trends in Biotechnology，2005，23(10)：523-529.

［2］ Wheeler C M，Bautista O M，Tomassini J E，et al. Safety and immunogenicity of co-administered quadrivalent human papillomavirus(HPV)-6/11/16/18,L1 viruslike particle(VLP)and hepatitis B(HBV)vaccines [J]. Vaccine，2008，26(5)：686-696.

［3］ Lai W B，Middelberg A P J. The production of human papillomavirus type 16 L1 vaccine product from Escherichia coli inclusion bodies[J]. Bioprocess and Biosystems Engineering，2002，25(2)：121-128.

［4］ Koutsky L A，Ault K A，Wheeler C M，et al. A controlled trial of a human papillomavirus type 16 vaccine [J]. New England Journal of Medicine，2002，347(21)：1645-1651.

［5］ Gleiter S，Lilie H. Coupling of antibodies via protein Z on modified polyoma virus-like particles [J]. Protein Science，2001，10(2)：434-444.

［6］ Stubenrauch K，Bachmann A，Rudolph R，et al. Purification of a viral coat protein by an engineered polyionic sequence [J]. Journal of Chromatography B，2000，737(1/2)：77-84.

［7］ Braun H，Boller K，Lower J，et al. Oligonucleotide and plasmid DNA packaging into polyoma VP1 viruslike particles expressed in Escherichia coli [J]. Biotechnology and Applied Biochemistry，1999，29(1)：31-43.

［8］ Yamada T，Iwasaki Y，Tada H，et al. Nanoparticles for the delivery of genes and drugs to human hepatocytes[J]. Nature Biotechnology，2003，21(8)：885-890.

［9］ Wang Q，Lin T W，Tang L，et al. Icosahedral virus particles as addressable nanoscale building blocks [J]. Angewandte Chemie International Edition，2002，41(3)：459-462.

［10］ Mao C B，Solis D J，Reiss B D，et al. Virus-based toolkit for the directed synthesis of magnetic and semiconducting nan owires [J]. Science，2004，303 (5655)：213-217.

［11］ Rayment I，Baker T S，Caspar D L，et al. Polyoma virus capsid structure at 22. 5 ? resolution [J]. Nature，1982，295(5845)：110-115.

［12］ Salunke D M，Caspar D L，Garcea R L. Self-assembly of purified polyomavirus capsid protein VP1[J]. Cell，1986，46(6)：895-904.

［13］ Cook J C，Joyce J G，George H A，et al. Purification of virus-like particles of recombinant human papillomavirus type 11 major capsid protein L1 from Saccharomycescerevisiae [J]. Protein Expression and Purification，1999，17(3)：477-484.

［14］ Pushko P，Tumpey T M，Van Hoeven N，et al. Evaluation of influenza virus-like particles and Novasome adjuvant as candidate vaccine for avian influenza [J]. Vaccine，2007，25(21)：4283-4290.

［15］ Montross L，Watkins S，Moreland R B，et al. Nuclear assembly of polyomavirus capsids in insect cells expressing the major capsid protein VP1 [J]. Journal of Virology，1991，65(9)：4991-4998.

［16］ Chen X J S，Casini G，Harrison S C，et al. Papillomavirus capsid protein expression in Escherichia coli：Purification and assembly of HPV11 and HPV16 L1 [J]. Journal of Molecular Biology，2001，307(1)：173-182.

［17］ Smith D B，Johnson K S. Single-step purification of polypeptides expressed in Escherichia coli as fusions with glutathione S-transferase [J]. Gene，1988，67 (1)：31-40.

［18］ Chuan Y P，Lua L H L，Middelberg A P J. High-level expression of soluble viral structural protein in Escherichia coli[J]. Journal of Biotechnology，2008，134(1/2)：64-71.

［19］ Chong S R，Montello G E，Zhang A H，et al. Utilizing the C-terminal cleavage activity of a protein splicing element to purify recombinant proteins in a single chromatographic step [J]. Nucleic Acids Research，1998，26(22)：5109-5115.

［20］ Mathys S，Evans T C，Chute I C，et al. Characteriza tion of a self-splicing mini-intein and its conversion into autocatalytic N- and C-terminal cleavage elements：Facile production of protein building blocks for protein ligation[J]. Gene，1999，231(1/2)：1-13.

［21］ 許成鋼，范曉軍，張志云，等. Intein介導的重組昆蟲毒素BmK IT在大腸桿菌中的可溶性表達、純化及活性分析[J]. 生物工程學報，2007，23(6)：989-994. Xu Chenggang，F(xiàn)an Xiaojun，Zhang Zhiyun，et al. Soluble expression，purfication and characterization of BmK IT in Escherichia coli by Intein-mediated system[J]. Chinese Journal of Biotechnology，2007，23(6)：989-994(in Chinese).

［22］ 狄 洌，張宏偉，徐朗萊. Ssp dnaB蛋白質內含子介導的重組人腦鈉素的制備[J]. 生物工程學報，2006，22(2)：180-186. Di Lie，Zhang Hongwei，Xu Langlai. Use of Ssp dnaB mini-intein as a fusion partner for preparation of recombinant human brain natriuretic peptide[J]. Chinese Journal of Biotechnology，2006，22(2)：180-186(in Chinese).

［23］ Lipin D I，Lua L H L，Middelberg A P J. Quaternary size distribution of soluble aggregates of glutathione-S-transferase-purified viral protein as determined by asymmetrical flow field flow fractionation and dynamic light scattering[J]. Journal of Chromatography A，2008，1190(1/2)：204-214.

［24］ Xu M Q，Evans T C. Intein-mediated ligation and cyclization of expressed proteins[J]. Methods，2001，24(3)：257-277.

(責任編輯：田 軍)

Intein-Mediated Expression and Purification of Murine Polyomavirus Virus-Like Particles

Dong Xiaoyan，Liu Xiaodan，Zhang Lin
(School of Chemical Engineering and Technology，Tianjin University，Tianjin 300072，China)

Virus-like particles(VLPs)of murine polyomavirus can be manufactured through in vitro self-assembly of structural protein VP1. VLPs have been utilized in the development of vaccines，gene therapy，drug delivery，biomaterials，etc. However，removing of GST-tag by thrombin in VP1 purification has the problems of high cost and complicated procedures. Therefore，the self-cleavage feature of intein was utilized by inserting the gene segment of intein between VP1 and GST. Then，affinity chromatography was used in the purification process and temperature and pH value were changed to induce the self-cleavage of intein. Thus，GST-intein tag and VP1 were separated. The production of VP1 was 4 mg/(L culture). Purified VP1 was assembled in vitro into VLPs，which were consistent with the natural VLPs of murine polyomavirus. Hence，the intein-mediated expression and purification process of murine polyomavirus VLPs are successfully developed，which is helpful for lower-cost，higher-efficiency production of VLPs without the involvement of thrombin.

murine polyomavirus；virus-like particles；affinity chromatography；VP1；self-assembly；intein；self-cleavage

O629.73

A

0493-2137(2014)04-0315-06

DOI 10.11784/tdxbz201308041

2013-08-19；

2013-09-25.

國家自然科學基金資助項目(21236005，21006069)；國家高技術研究發(fā)展計劃(863計劃)資助項目(2012AA020206)；天津市應用基礎及前沿技術研究計劃重點資助項目(13JCZDJC31100)；天津市國際科技合作項目(11ZCGHHZ00600)；天津大學自主創(chuàng)新基金資助項目．

董曉燕（1962— ），女，博士，教授，d_xy@tju.edu.cn.

張 麟，linzhang@tju.edu.cn.

時間：2013-10-15.

http：//www.cnki.net/kcms/detail/12.1127.N.20131015.1055.001.html．