瀘州引種金銀花與山東金銀花HPLC指紋圖譜的比較

何兵 彭鋒 田吉

摘要：采用ＨＰＬＣ法分析瀘州引種金銀花及山東金銀花ＨＰＬＣ指紋圖譜，評(píng)價(jià)瀘州引種金銀花質(zhì)量。采用Ｋｒｏｍａｓｉｌ Ｃ１８色譜柱（２５０ ｍｍ×４．６ ｍｍ，５ μｍ），以乙腈和０．１％（Ｖ／Ｖ）磷酸水溶液梯度洗脫，柱溫３０ ℃，流速１．０ ｍＬ／ｍｉｎ。結(jié)果表明，瀘州引種金銀花與山東金銀花ＨＰＬＣ指紋圖譜的相似度大于０．９７０，提示引種金銀花與山東金銀花質(zhì)量相近，符合藥典要求，建議推廣栽培。

關(guān)鍵詞：金銀花；引種；指紋圖譜；ＨＰＬＣ

中圖分類號(hào)：Ｑ８１５文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號(hào)：0439－８114（２０14）08－1905-04

Ｃｏｍｐａｒｉng ｔｈｅ Ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｓ ｏｆ Fｌｏｗｅｒｓ ｏｆ Ｌｏｎｉｃｅｒａ ｊａｐｏｎｉｃａ Iｎｔｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ Ｌｕｚｈｏｕ ａｎｄ Oｒｉｇｉｎａｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｓｈａｎｄｏｎｇ

ＨＥ Ｂｉｎｇ１， ＰＥＮＧ Ｆｅｎｇ２， ＴＩＡＮ Ｊｉ１

（１． Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ， Ｌｕｚｈｏｕ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｌｕｚｈｏｕ６４６０００， Ｓｉｃｈｕａｎ， Ｃｈｉｎａ；

２． Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｕｚｈｏｕ， Ｌｕｚｈｏｕ ６４６０００， Ｓｉｃｈｕａｎ， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａ ＨＰＬＣ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ used ｗｉｔｈ Ｋｒｏｍａｓｉｌ Ｃ１８（２５０ ｍｍ×４．６ ｍｍ，５ μｍ）ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ ｏｆ ｆｌｏｗｅｒｓ ｏｆ Ｌｏｎｉｃｅｒａ ｊａｐｏｎｉｃａ（ｈｏｎｅｙｓｕｃｋｌｅ） ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ Ｌｕｚｈｏｕ ａｎｄ ｏｒｉｇｉｎａｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｓｈａｎｄｏｎｇ ｔｏ ｅｖａｌｕａｔｅ ｔｈｅ ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ ｈｏｎｅｙｓｕｃｋｌｅ． Ｔｈｅ ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ ｗａｓ ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ ｗｉｔｈ ０．１％（Ｖ／Ｖ） ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ ａｃｉｄ ａｑｕｅｏｕｓ， ａｎｄ ｔｈｅ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｅｌｕｔｉｏｎ ｐｒｏｇｒａｍ ｗａｓ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｆｌｏｗ ｒａｔｅ of １．０ ｍＬ／ｍｉｎ ａｔ ３０ ℃． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｏｒｉｇｉｎａｔｅｄ ｗａｓ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ０．９７０． Ｔｈｅ ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ ｈｏｎｅｙｓｕｃｋｌｅ ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ Ｌｕｚｈｏｕ ｗａｓ ｓｉｍｉｌａｒ ｗｉｔｈ ｔｈｏｓｅ ｏｒｉｇｉｎａｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｓｈａｎｄｏｎｇ， meeting ｔｈｅ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ ｔｈａｔ ｉｔ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｐｌａｎｔed on large scale ｉｎ ｔｈｅ ｆｕｔｕｒｅ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｈｏｎｅｙｓｕｃｋｌｅ； ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ； ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ； ＨＰＬＣ

金銀花為忍冬科植物忍冬（Ｌｏｎｉｃｅｒａ ｊａｐｏｎｉｃａ Ｔｈｕｎｂ．）的干燥花蕾或帶初開(kāi)的花［１］，是常用清熱解毒中藥，也是家喻戶曉的保健飲品。傳統(tǒng)以山東、河南產(chǎn)金銀花為優(yōu)，常稱為濟(jì)銀花，歷來(lái)銷量大、價(jià)格高［２］。四川也是金銀花的主要產(chǎn)地，主栽品種包括忍冬科灰氈毛忍冬（Ｌｏｎｉｃｅｒａ ｍａｃｒａｎｔｈｏｉｄｅｓ Ｈａｎｄ-Ｍａｚｚ．）、細(xì)氈毛忍冬（Ｌｏｎｉｃｅｒａ ｓｉｍｉｌｉｓ Ｈｅｍｓｌ．）及紅腺忍冬（Ｌｏｎｉｃｅｒａ ｈｙｐｏｇｌａｕｃａ Ｍｉｑ．）等［３］，通常稱之為山銀花，市場(chǎng)價(jià)格遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于山東金銀花。川南瀘州為丘陵地帶，比較適合金銀花生長(zhǎng)，本地栽培以灰氈毛忍冬為主。為提高本地金銀花的質(zhì)量、增加藥農(nóng)收入、推動(dòng)地方經(jīng)濟(jì)發(fā)展，筆者從山東平邑引種了２ ０００株山東金銀花，分別栽培于瀘州市江陽(yáng)區(qū)和瀘縣，并于第二年進(jìn)行了扦插分株，經(jīng)過(guò)３年的培育，將收獲的干花與濟(jì)銀花比較，二者外觀相近。為分析引種與原產(chǎn)地金銀花的主要功能成分差異，采用ＨＰＬＣ法同時(shí)測(cè)定了４種主要活性成分（綠原酸、木犀草苷、異綠原酸Ａ和異綠原酸Ｃ）［４］的含量，二者基本一致；并通過(guò)對(duì)比分析指紋圖譜考察了引種金銀花的質(zhì)量，為瀘州地區(qū)推廣種植山東金銀花提供試驗(yàn)依據(jù)。

１材料與方法

１．１材料

山東金銀花１０批（山東平邑縣２０１２年７月采收），引種山東金銀花１０批（瀘州醫(yī)學(xué)院藥用植物園引種第３年，２０１２年７月采收）。藥材均經(jīng)作者鑒定為忍冬科忍冬的干燥花蕾。

綠原酸（批號(hào)０８０６２０）、木犀草苷（批號(hào)０９１０２６）、異綠原酸Ａ（批號(hào)０８０５３０）、異綠原酸Ｃ（批號(hào)０７１１１５）均由成都普瑞法有限公司提供（純度＞９８％）。乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為去離子水。

１．２儀器

ＤＩＯＮＥＸ高效液相色譜儀（Ｐ６８０Ａ四元梯度泵，ＰＤＡ－１００二極管陣列檢測(cè)器，ＴＣＣ－１００型柱溫箱，Ｃｈｒｏｍｅｌｅｏｎ色譜工作站）；瑞士Ｐｒｅｃｉｓａ電子天平（ＸＲ ２０５ＳＭ－ＤＲ）；ＣＱＸ２５－０６型超聲波清洗器（上海必能信超聲有限公司，功率２５０ Ｗ，頻率２５ ｋＨz）。

１．３方法

１．３．１色譜條件色譜柱：Ｋｒｏｍａｓｉｌ Ｃ１８（２５０ ｍｍ×４．６ ｍｍ，５ μｍ）；流動(dòng)相：乙腈－０．１％（V/V）磷酸溶液，梯度洗脫：０ ｍｉｎ→２０ ｍｉｎ→２１ ｍｉｎ→２５ ｍｉｎ，乙腈１０％→３０％→１０％→１０％（Ｖ／Ｖ，下同）；流速：１．０ ｍＬ／ｍｉｎ；分段變波長(zhǎng)測(cè)定：０～１２.0 ｍｉｎ為３２６ ｎｍ，１２.0～１６．５ ｍｉｎ為３５０ ｎｍ，１６．５～２５.0 ｍｉｎ為３２６ ｎｍ。柱溫３０ ℃；進(jìn)樣量１０ μＬ。理論塔板數(shù)按綠原酸計(jì)不低于５ ０００。

１．３．２標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備稱取各對(duì)照品適量于棕色容量瓶中，加７０％甲醇（Ｖ／Ｖ），搖勻，定容，配制得到不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

１．３．３供試品溶液的制備稱取金銀花粉末約０．２ ｇ于帶塞錐形瓶中，加入７０％甲醇２５ ｍＬ，稱定重量，超聲處理４５ ｍｉｎ，放冷，再稱重，用７０％甲醇補(bǔ)足損失，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

２結(jié)果與分析

２．１穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，分別于制備后０、４、８、１６、２４、４８ ｈ進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。以綠原酸峰的保留時(shí)間和峰面積為參照，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和７號(hào)色譜峰的峰面積比值基本一致，其ＲＳＤ均小于３．０％，相似度均在０．９９以上，符合指紋圖譜的技術(shù)要求［３］，表明供試品溶液在４８ ｈ內(nèi)穩(wěn)定。

２．２精密度試驗(yàn)

取同一供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣６次，檢測(cè)指紋圖譜。以綠原酸峰的保留時(shí)間和峰面積為參照，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及７號(hào)色譜峰的峰面積比值基本一致，其ＲＳＤ小于３．０％，相似度均在０．９９以上，符合指紋圖譜的技術(shù)要求，表明儀器精密度良好。

２．３重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批金銀花樣品６份，按“１．３．３”制備供試品溶液，分別檢測(cè)指紋圖譜。以綠原酸峰的保留時(shí)間和峰面積為參照，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及７號(hào)色譜峰的峰面積比值基本一致，其ＲＳＤ均小于３．０％，相似度均在０．９９以上，符合指紋圖譜的技術(shù)要求，表明本法重復(fù)性較好。

２．４指紋圖譜的建立及共有指紋峰的標(biāo)定

精密吸取綠原酸參照溶液、瀘州引種金銀花及山東金銀花供試品溶液１０ μＬ，分別注入液相色譜儀。比較不同批次樣品的色譜圖，確定８?jìng)€(gè)共有指紋峰，見(jiàn)圖１和圖２。分別吸取適當(dāng)濃度的的新綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、木犀草苷、異綠原酸Ｂ、異綠原酸Ａ及異綠原酸Ｃ對(duì)照品溶液進(jìn)樣測(cè)定，并掃描對(duì)比其紫外可見(jiàn)光吸收光譜，同時(shí)在樣品溶液中分別添加上述對(duì)照品溶液，鑒別相應(yīng)色譜峰。結(jié)果表明，１號(hào)峰為新綠原酸，３號(hào)峰為隱綠原酸，４號(hào)峰為咖啡酸，５號(hào)峰為木犀草苷，６號(hào)峰為異綠原酸Ｂ，７號(hào)峰為異綠原酸Ａ，８號(hào)峰為異綠原酸Ｃ。

２．５共有指紋峰技術(shù)參數(shù)的確定

比較１０個(gè)批次金銀花樣品的色譜圖，根據(jù)中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求［３］，以綠原酸峰作為參照峰（Ｓ峰），計(jì)算各共有指紋峰的保留時(shí)間、相對(duì)保留時(shí)間、峰面積、峰面積百分比、峰面積比值，見(jiàn)表１和表2。結(jié)果表明，各共有指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間、峰面積比值相對(duì)固定，符合中藥注射劑指紋圖譜的技術(shù)要求。

２．６指紋圖譜的相似度評(píng)價(jià)

根據(jù)《中藥注射劑色譜指紋圖譜實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)指南（試行）》［４］，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)２００４Ａ版》，對(duì)１０批瀘州引種金銀花和山東金銀花藥材的指紋圖譜進(jìn)行相似度分析，１０批山東金銀花與對(duì)照指紋圖譜相似度分別為：１．０００，０．９９９， ０．９９８，０．９９９，０．９９８，０．９９９，０．９９９，０．９９７，０．９９８，１．０００。若以１０批山東金銀花平均值為對(duì)照指紋圖譜，１０批瀘州引種金銀花與其相似度分別為：０．９９７，０．９８５，０．９７７，０．９９８，０．９９５，０．９８３，０．９９１，０．９７２，０．９６８，０．９８４。符合指紋圖譜技術(shù)要求。１０批瀘州引種金銀花和山東金銀花ＨＰＬＣ指紋圖譜疊加圖譜見(jiàn)圖３和圖４。

３小結(jié)與討論

綠原酸、木犀草苷、異綠原酸Ａ及異綠原酸Ｃ色譜峰的最大吸收波長(zhǎng)分別為： ３２６．４、３４８．３、３２７．７及３２７．５ ｎｍ。采用分段變波長(zhǎng)法測(cè)定，根據(jù)各成分保留時(shí)間差異，分別設(shè)定檢測(cè)波長(zhǎng)：在０～１２.0 ｍｉｎ為３２６ ｎｍ， １２.0～１６．５ ｍｉｎ為３４８ ｎｍ，１６．５～２５.0 ｍｉｎ為３２８ ｎｍ，可使各色譜峰獲得最大豐度，可有效提高分析方法的靈敏度。

文獻(xiàn)［５－１０］建立金銀花指紋圖譜普遍采用乙腈-０．４％（V/V，下同）磷酸溶液，但其梯度條件不合適，分離時(shí)間普遍在４０ ｍｉｎ以上，且由于０．４％磷酸溶液ｐＨ偏低，對(duì)色譜柱有一定傷害。試驗(yàn)采用０．１％磷酸水溶液和乙腈，梯度洗脫，２０ ｍｉｎ內(nèi)分離完主要色譜峰，分離度、拖尾因子、理論板數(shù)均符合要求。在適用性方面，分別采用不同廠家的液相色譜儀（Ｄｉｏｎｅｘ Ｐ６８０、Ｗａｔｅｒｓ ２６９５）和不同品牌的色譜柱（Ｋｒｏｍａｓｉｌ Ｃ１８，Ｓｐｕｒｓｉｌ Ｃ１８，Ｌｕｎａ Ｃ１８）測(cè)定，均能獲得較好的色譜結(jié)果，各色譜峰均能達(dá)到分離度要求，表明本方法適用性良好。

對(duì)比引種的１０批金銀花和山東金銀花指紋圖譜對(duì)比可見(jiàn)，雖然各個(gè)色譜圖的小峰有一定差異，但均檢測(cè)出主要的８?jìng)€(gè)化學(xué)成分，且瀘州引種金銀花與山東金銀花ＨＰＬＣ指紋圖譜相似度均在０．９７０以上，相似度較高，表明二類樣品的整體質(zhì)量相近。與前期測(cè)得的二者主要化學(xué)成分含量基本一致，說(shuō)明瀘州引種山東金銀花質(zhì)量達(dá)到藥典要求，可作藥用，表明瀘州地區(qū)具有進(jìn)一步推廣引種山東金銀花的可行性。

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