美洲大蠊提取液對(duì)大鼠難愈合創(chuàng)面TGF-β1/Smads通路調(diào)控機(jī)制的研究＊

曾娟妮，劉 筱，耿越飛，沈詠梅，何永恒＊＊

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院 長(zhǎng)沙 410000；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué) 長(zhǎng)沙 410208；3.成都高新好醫(yī)生第一醫(yī)院 成都 610202）

有研究表明[1-3]，Smads通路（Smads route）是TGF-β 1調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞合成ECM及凋亡的細(xì)胞內(nèi)主要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，是新近發(fā)現(xiàn)的TGF-β受體復(fù)合物下游一類(lèi)非常重要的信號(hào)傳導(dǎo)分子家族。Smad3介導(dǎo)的信號(hào)途徑在體內(nèi)抑制創(chuàng)傷愈合；Smad7[4]蛋白屬于抑制型Smad家族成員，能降低TGF-β1的生物學(xué)效應(yīng)，減少成纖維細(xì)胞的增殖，減少瘢痕形成。相關(guān)研究表明組織創(chuàng)傷愈合與肉芽組織的形成有很大關(guān)聯(lián)，新的肉芽組織對(duì)創(chuàng)口的閉合有很大促進(jìn)作用[5]。筆者前期將美洲大蠊提取液外用于肛管難愈合創(chuàng)面，取得滿(mǎn)意療效[6]。通過(guò)PCR實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)美洲大蠊提取液能提高難愈合創(chuàng)面中VEGF的表達(dá)而加速創(chuàng)面的修復(fù)[7]。免疫組化實(shí)驗(yàn)研究表明美洲大蠊提取液能提高大鼠難愈合創(chuàng)面中TGF-β的表達(dá)，從而促進(jìn)創(chuàng)面愈合[8]。但美洲大蠊提取液促進(jìn)創(chuàng)面愈合的機(jī)制仍不清楚。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察創(chuàng)面肉芽組織中TGF-β1和Smad3、Smad7及其磷酸化的表達(dá)，從分子水平探討該藥促進(jìn)創(chuàng)面愈合的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)Wistar大鼠（SPF Wistar Rat）60只，雄性，2月齡，體質(zhì)量200-250 g，由湖南景萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供（動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（湘）2013-0005，動(dòng)物合格證編號(hào)NO.43004700015135）。

1.2 藥品與試劑

貝復(fù)濟(jì)15 mL·瓶-1（珠海億勝生物制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字S10980075）；美洲大蠊提取液100 mL·瓶-1（商品名：康復(fù)新液，四川好醫(yī)生攀西藥業(yè)有限責(zé)任公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z51021834）。RIPA蛋白裂解液、Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒、超敏化學(xué)放光顯色試劑盒（江蘇碧云天）；彩色預(yù)染蛋白marker（Fermentas）；5X SDSPAGE loading buffer、羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗（vazyme）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

電泳儀、垂直板電泳槽、水平電轉(zhuǎn)槽、水平搖床（北京六一儀器廠）；恒溫?fù)u床金壇）；超純水儀（millipore公司）；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海spectrum公司）；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（Thermo）；壓片夾（koda）；掃描儀（日本Canon）。

1.4 方法

1.4.1 造模與分組

將60只雄性Wistar大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為急性全層皮膚缺損組（空白組）、模型組、貝復(fù)濟(jì)對(duì)照組（對(duì)照組）、美洲大蠊提取液實(shí)驗(yàn)組（實(shí)驗(yàn)組），每組15只。采用全層皮膚缺損+激素法制成大鼠慢性難愈合創(chuàng)面模型[9]，用20%烏拉坦（5 mL·kg-1）腹腔注射麻醉大鼠后，在其背中部脊柱兩側(cè)旁開(kāi)1 cm，距肩胛骨以下2 cm用外科方法作兩條深達(dá)筋膜、直徑為18 mm的全層皮膚缺損開(kāi)放性創(chuàng)面；模型組、對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組造模后即刻皮下注射醋酸氫化可的松（6 mg·100 g-1）。

1.4.2 換藥及取材

空白組與模型組外敷層0.9%氯化鈉溶液（0.2 mL·cm-2）紗布；對(duì)照組用貝復(fù)濟(jì)（60 μ·cm-2）浸透的單層紗布外敷于創(chuàng)面；實(shí)驗(yàn)組以美洲大蠊提取液（0.2 mL·cm-2）浸透后的單層紗布外敷于創(chuàng)面。然后在創(chuàng)面上加蓋兩層消毒干紗布，用膠布“豐”字形固定，每日定時(shí)換藥2次。各組在藥物干預(yù)3天、8天、15天、20天后隨機(jī)取3只大鼠造模區(qū)深達(dá)真皮全層的創(chuàng)面組織備試管固定液中待用，所有大鼠在20 d取材后統(tǒng)一處死。

1.4.3 免疫組化測(cè)定

將固定的肉芽組織標(biāo)本進(jìn)行脫水，再浸蠟，然后包埋，最后切片。取4 μm石蠟切片，進(jìn)行脫蠟脫水后，用PBS洗滌，每次3 min，共3次；然后3%H2O2：室溫下20 min，PBS洗滌，每次3 min，共3次；再將切片浸入0.01 mol·L-1pH 6.0檸檬酸鹽緩沖液，微波爐（98℃）進(jìn)行抗原修復(fù)2次，每次10 min，然后取出在室溫下自然冷卻后滴加一抗，放4℃冰箱過(guò)夜；PBS洗滌3次，每次3 min，滴加Envision試劑，在37℃下30 min，PBS洗滌3次，每次3 min，用0.04%DAB+0.03%H2O2顯色8 min后用蘇木素襯染、鹽酸乙醇藍(lán)化2 s進(jìn)行流水洗，最后微波藍(lán)化后用樹(shù)脂封片。檢測(cè)目標(biāo)以胞漿出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒者判定為陽(yáng)性細(xì)胞，以PBS緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.4.4 Western blot檢測(cè)（Western Blot Test）

將所取組織塊置于1-2 mL勻漿器中球狀部位，用干凈的剪刀將組織塊盡量剪碎，加400 μL單去污劑裂解液裂（含PMSF）于勻漿器中，進(jìn)行勻漿，然后置于冰上，30 min后用移液器將裂解液移至1.5 mL離心管中，然后在4℃下12000 rpm離心5 min，取上清分裝于0.5 mL離心管中并置于-20℃保存，考馬亮藍(lán)染色測(cè)定樣品濃度并調(diào)整各上樣量至50 μg，加入2×加樣緩沖液，煮沸3 min后取上樣。在制備好的8%的SDS、PAGE凝膠上行垂直電泳分離。NC膜電轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)印跡。以含5%脫脂奶粉rIBS—T溶液(10 mmol/1。'l'ris-CI，100 retool/L NaCl+0.1%Tween 20)封閉，而后分別加入羊抗大鼠Smad3和Smad7多克隆抗體(1∶500稀釋)，再以辣根過(guò)氧化物酶（HRPO）偶聯(lián)兔抗羊lgG抗體（I∶1 000稀釋?zhuān)┓跤?，以上步驟間用TBS—T常溫下充分洗膜。最后用ECL系統(tǒng)感光顯像。

1.4.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)以x±s表示，滿(mǎn)足方差齊性檢驗(yàn)，采用單因素方差分析，多重比較采用LSD法，若方差不齊，采用秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化結(jié)果

2.1.1 TGF-β1結(jié)果

空白組、實(shí)驗(yàn)組3-8天逐漸上升，8-20天逐漸下降，8天表達(dá)最高；模型組、對(duì)照組3-20 d無(wú)明顯規(guī)律性。3天，空白組較模型組（P=0＜0.01）、對(duì)照組（P=0.018＜0.05）表達(dá)高，與實(shí)驗(yàn)組無(wú)差異（P=0.076＞0.05），8天、15天、20天，高于模型組（P=0.011＜ 0.05，P=0.037＜0.05，P=0.005＜0.05），與對(duì)照組（P=0.206 ＞ 0.05，P=0.361＞ 0.05，P=0.511 ＞ 0.05）、實(shí)驗(yàn)組無(wú)差異（P=0.597＞0.05，P=0.409＞0.05，P=0.280 ＞ 0.05）；3 d、8 d、15 d、20 d，實(shí)驗(yàn)組較模型組（P=0.006＜ 0.01，P=0.005＜ 0.01，P=0.010＜ 0.05，P=0.001＜0.01）表達(dá)高，與對(duì)照組無(wú)差異（P=0.376＞0.05，P=0.090 ＞ 0.05，P=0.103 ＞ 0.05，P=0.102 ＞0.05）（表1，圖1）。

表1 TGF-β1表達(dá)水平（平均比值TGF-β1/actin，

表1 TGF-β1表達(dá)水平（平均比值TGF-β1/actin，

▲：P ＜ 0.05，與空白組；△：P ＜ 0.05，與模型組；*：P ＜ 0.05，與對(duì)照組。

20天72392.879±6273.675△16261.572±971.983▲*62451.804±25231.010△89135.549±23961.546△9.341組別空白組模型組對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組F值n 15 15 15 15 3天83525.117±16742.699△*21064.629±3595.978▲*51431.138±15225.560▲△61532.321±13126.405△11.582 8天93309.969±37601.725△18576.629±3841.071▲62009.998±24227.199 105820.48±33024.642△5.839 15天78774.331±29284.824△23759.483±10523.659▲57534.231±37615.652 97907.714±22504.281△4.192

圖1 4組TGF-β1、Smad3、Smad7免疫組化圖

2.1.2 Smad3結(jié)果

空白組、模型組3-20天逐漸上升，對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組逐漸下降。3天、8天，空白組與模型組（P=0.090＞0.05，P=0.124＞ 0.05）、對(duì)照組（P=0.127＞ 0.05，P=0.936＞0.05）、實(shí)驗(yàn)組（P=0.131＞0.05，P=0.470＞0.05）比較均無(wú)差異，15天、20天，較模型組（P=0.016＜0.05，P=0.000＜0.05）表達(dá)低，與對(duì)照組（P=0.573＞0.05，P=0.394＞0.05）、實(shí)驗(yàn)組無(wú)差異（P=0.807＞0.05，P=0.131＞0.05）。3天，實(shí)驗(yàn)組與模型組（P=0.810＞0.05）、對(duì)照組（P=0.985＞0.05）無(wú)差異，8天、15天，較模型組（P=0.038＜0.05，P=0.024＜0.05）表達(dá)低，與對(duì)照組（P=0.425＞ 0.05，P=0.747＞0.05）無(wú)差異，20天，較模型組（P=0.000＜ 0.05）、對(duì)照組（P=0.032＜0.05）均表達(dá)低（表2，圖1）。

2.1.3 Smad7結(jié)果

空白組、對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組3-20d逐漸下降，模型組逐漸上升。3天、8天、15天、20天，空白組較模型組（P=0.006＜ 0.05，P=0.003＜ 0.05，P=0.000＜ 0.05，P=0.034＜0.05）表達(dá)低，與對(duì)照組（P=0.384＞0.05，P=0.883 ＞ 0.05，P=0.230 ＞ 0.05，P=0.939 ＞ 0.05）、實(shí)驗(yàn)組（P=0.351＞0.05，P=0.819＞0.05，P=0.134＞0.05，P=0.906＞0.05）無(wú)差異，實(shí)驗(yàn)組均顯著低于模型組（P=0.001＜ 0.05，P=0.002＜ 0.05，P=0.000＜0.05，P=0.028＜0.05），與對(duì)照組（P=0.947＞0.05，P=0.934＞ 0.05，P=0.722＞ 0.05，P=0.845＞ 0.05）無(wú)差異（表3，圖1）。

表2 Smad3表達(dá)情況（平均值Smad3/actin，

表2 Smad3表達(dá)情況（平均值Smad3/actin，

▲：P ＜ 0.05，與空白組；△：P ＜ 0.05，與模型組；*：P ＜ 0.05，與對(duì)照組。

20天41269.992±8205.107△100522.621±13038.594▲*47457.652±6698.329△29710.137±825.310*△41.813組別空白組模型組對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組F值n 15 15 15 15 3天22612.791±14350.346 58752.752±23192.982 54453.484±22099.670 54101.921±29515.078 1.593 8天43378.052±35766.782 73997.794±19272.023 44851.124±7930.386 29861.459±13845.585△2.175 15天37974.528±18979.562△118962.615±57506.854▲*53691.842±23716.857△44746.892±8389.019△3.884

表3 Smad7表達(dá)情況（平均值Smad7/actin，

表3 Smad7表達(dá)情況（平均值Smad7/actin，

▲：P ＜ 0.05，與空白組；△：P ＜ 0.05，與模型組；*：P ＜ 0.05，與對(duì)照組。

20天14773.743±8639.168△116536.588±96902.748▲*17938.908±3838.563△9902.136±4038.100△3.322組別空白組模型組對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組F值n 15 15 15 15 3天39777.056±25870.388△93882.519±20520.756▲*26486.450±8204.196△25489.137±9498.545△10.040 8天22523.865±16282.681△85775.809±32313.052▲*20261.077±3513.526△18988.951±4460.120△9.521 15天31685.206±15674.246△97811.086±10564.203▲*20397.770±7877.807△17189.495±5794.842△38.004

表4 TGF-β1表達(dá)水平（平均比值TGF-β1/actin，x

表4 TGF-β1表達(dá)水平（平均比值TGF-β1/actin，x

▲：P ＜ 0.05，與空白組；△：P ＜ 0.05，與模型組；*：P ＜ 0.05，與對(duì)照組。

20 d 0.702±0.009△*0.356±0.021▲*0.533±0.036▲△0.534±0.037△72.698組別空白組模型組對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組F值n 15 15 15 15 3 d 0.686±0.003△*0.410±0.011▲0.425±0.027▲0.461±0.011▲△*195.164 8 d 0.671±0.019△*0.388±0.105▲*0.626±0.135▲△0.637±0.150▲△224.817 15 d 0.689±0.005△*0.380±0.320▲*0.641±0.006▲△0.698±0.008△*233.579

2.2 Western blot結(jié)果

2.2.1 TGF-β1結(jié)果

TGF-β1表達(dá)水平比較，空白組3-20天逐漸上升，模型組逐漸下降，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組3-15天逐漸上升，15-20天逐漸下降；空白組3天、8天、15天、20天較其他三組表達(dá)高（P＜0.05）；實(shí)驗(yàn)組3天、15天，較模型組（P=0.005＜0.05，P=0.000＜0.05）、對(duì)照組（P=0.027＜ 0.05，P=0.003＜ 0.05）表達(dá)高，8天、20天，較模型組（P=0＜0.01，P=0＜0.01）表達(dá)水平高，與對(duì)照組無(wú)差異（P=0.409＞ 0.05，P=0.967＞ 0.05）（表4，圖2，圖3）。

2.2.2 Smad3結(jié)果

Smad3的表達(dá)水平比較，3-20天均逐漸升高?？瞻捉M3天、15天，與模型組（P=0.095＞0.05，P=0.060＞0.05）、對(duì)照組（P=0.102＞0.05，P=0.171＞0.05）、實(shí)驗(yàn)組（P=0.818＞0.05，P=0.773＞0.05）無(wú)差異，8天，較模型組（P=0.011＜0.05）、對(duì)照組（P=0.024＜0.05）表達(dá)低，與實(shí)驗(yàn)組無(wú)差異（P=0.305＞0.05），20天，較模型組（P=0.043＜ 0.05）表達(dá)低，與對(duì)照組（P=0.075＞0.05）、實(shí)驗(yàn)組（P=0.499＞0.05）無(wú)差異；實(shí)驗(yàn)組3天、8天、15天、20天，與模型組（P=0.137 ＞ 0.05，P=0.059 ＞ 0.05，P=0.096 ＞ 0.05，P=0.129＞0.05）、對(duì)照組（P=0.147＞0.05，P=0.131＞0.05，P=0.262＞ 0.05，P=0.217＞ 0.05）均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表5，圖2，圖3）。

表5 Smad3表達(dá)水平（平均值Smad3/actin，x）

表5 Smad3表達(dá)水平（平均值Smad3/actin，x）

▲：P ＜ 0.05，與空白組；△：P ＜ 0.05，與模型組；*：P ＜ 0.05，與對(duì)照組。

20d 71.680±14.030△88.393±1.925▲85.920±0.130 76.606±9.464 2.544組別空白組模型組對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組F值n 15 15 15 15 3 d 65.526±2.670 75.133±5.985 74.890±9.770 66.733±4.040 2.059 8 d 67.250±11.630△*83.250±1.140▲80.725±1.425▲72.570±1.610 4.624 15 d 72.350±12.230 85.186±3.485 81.193±1.395 74.100±6.580 2.103

表6 Smad7表達(dá)水平（平均值Smad7/actin，

表6 Smad7表達(dá)水平（平均值Smad7/actin，

▲：P ＜ 0.05，與空白組；△：P ＜ 0.05，與模型組；*：P ＜ 0.05，與對(duì)照組。

20 d 56.860±5.710△72.290±10.610▲*59.401±5.435△57.300±3.070△3.475組別空白組模型組對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組F值n 15 15 15 15 3 d 49.133±0.835△66.633±16.555▲52.890±1.165 50.333±2.265△2.784 8 d 62.381±12.288 70.840±11.920 58.970±4.170 56.035±4.715 1.479 15 d 63.860±4.900△76.470±9.080▲*59.595±3.875△59.396±4.080△9.005

2.2.3 Smad7結(jié)果

Smad7的表達(dá)水平比較，3-15天逐漸上升，15-20天逐漸降低?？瞻捉M3天、15天、20天，較模型組（P=0.034 ＜ 0.05，P=0.002 ＜ 0.05，P=0.024 ＜ 0.05）表達(dá)低，與對(duì)照組（P=0.598＞0.05，P=0.584＞0.05，P=0.659＞0.05）、實(shí)驗(yàn)組（P=0.865＞0.05，P=0.282＞0.05，P=0.939＞ 0.05）無(wú)差異，8天，比模型組（P=0.289＜0.05）、對(duì)照組（P=0.659＜0.05）表達(dá)低，與實(shí)驗(yàn)組無(wú)差異（P=0.419＞0.05）；3天、8天，實(shí)驗(yàn)組與模型組（P=0.044＞0.05，P=0.082＞0.05）、對(duì)照組（P=0.719＞ 0.05，P=0.704＞ 0.05）比較無(wú)差異，15天、20天，比模型組（P=0.007＜0.05，P=0.027＜0.05）表達(dá)低，與對(duì)照組（P=0.575＞0.05，P=0.714＞0.05）無(wú)差異（表6，圖2，圖3）。

2.2.4 psmad3結(jié)果

psmad3表達(dá)水平比較，空白組3-15天逐漸降低，模型組逐漸升高，對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組3-8天逐漸升高，8-20天逐漸降低?？瞻捉M3天、15天、20天，較模型組（P=0.005 ＜ 0.05，P=0.000 ＜ 0.05，P=0.000 ＜ 0.05）表達(dá)低，與對(duì)照組（P=0.145＞0.05，P=0.478＞0.05，P=0.355＞0.05）、實(shí)驗(yàn)組（P=0.391＞0.05，P=0.498＞ 0.05，P=0.950＞0.05）無(wú)差異，8天，與模型組（P=0.098＞0.05）、對(duì)照組（P=0.458＞0.05）、實(shí)驗(yàn)組均無(wú)差異（P=0.231＞ 0.05）；實(shí)驗(yàn)組3天、15天、20天，較模型組（P=0.001＜0.05，P=0.000＜0.05，P=0.000＜0.05）表達(dá)低，與對(duì)照組（P=0.500＞0.05，P=0.184＞0.05，P=0.325＞0.05）無(wú)差異，8天，與模型組（P=0.583＞0.05）、對(duì)照組（P=0.618＞0.05）均無(wú)差異（表7，圖2，圖3）。

表7 psmad3表達(dá)水平（平均比值psmad3/actin，

表7 psmad3表達(dá)水平（平均比值psmad3/actin，

▲：P ＜ 0.05，與空白組；△：P ＜ 0.05，與模型組；*：P ＜ 0.05，與對(duì)照組。

20天0.263±0.093△0.802±0.008▲*0.222±0.028△0.275±0.024△87.490組別空白組模型組對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組F值n 15 15 15 15 3天0.310±0.005△0.424±0.050▲*0.262±0.499△0.283±0.014△11.781 8天0.284±0.995 0.432±0.026 0.345±0.128 0.386±0.102 1.262 15天0.263±0.082△0.747±0.033▲*0.228±0.068△0.295±0.014△56.155

2.2.5 psmad7結(jié)果

psmad7表達(dá)水平比較，空白組3-8天逐漸降低，8-20天逐漸升高，模型組3-20天逐漸升高，對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組3-20天逐漸降低?？瞻捉M3天、8天、20天，較模型組（P=0.007＜0.05，P=0.009＜0.05，P=0.000＜0.05）表達(dá)低，與對(duì)照組（P=0.062＞0.05，P=0.070＞0.05，P=0.246＞ 0.05）、實(shí)驗(yàn)組（P=0.186＞ 0.05，P=0.077＞ 0.05，P=0.141＞0.05）無(wú)差異，15天，比模型組（P=0.000＜0.05）、對(duì)照組（P=0.003＜0.05）、實(shí)驗(yàn)組（P=0.004＜0.05）表達(dá)低；3天、8天，實(shí)驗(yàn)組與模型組（P=0.066＞0.05，P=0.200＞0.05）、對(duì)照組（P=0.493＞0.05，P=0.955＞0.05）比較無(wú)差異，15天、20天，較模型組（P=0.000＜0.05，P=0.000＜0.05）表達(dá)低，與對(duì)照組（P=0.915＞0.05，P=0.711＞0.05）無(wú)差異（表8，圖2，圖3）。

3 討論

難愈合創(chuàng)面是指創(chuàng)面在各種內(nèi)外因素作用下不能通過(guò)正常的愈合進(jìn)程達(dá)到解剖和功能上的完整，從而進(jìn)入一種病理性炎癥反應(yīng)狀態(tài)，最終導(dǎo)致經(jīng)久難愈[10]。

現(xiàn)代藥理研究證明美洲大蠊提取液能促進(jìn)肉芽組織生長(zhǎng)，促進(jìn)血管增生，加速壞死組織脫落，迅速修復(fù)各類(lèi)潰瘍及創(chuàng)傷創(chuàng)面；抗感染、消除炎性水腫，提高機(jī)體免疫功能；外用可快速激活局部免疫細(xì)胞，縮短創(chuàng)面愈合時(shí)間[11,12]。貝復(fù)濟(jì)是一種堿性成纖維化細(xì)胞生長(zhǎng)因子[13]，其在血管生成的過(guò)程中有很大作用。

表8 psmad7表達(dá)水平（平均比值psmad7/actin

表8 psmad7表達(dá)水平（平均比值psmad7/actin

▲：P ＜ 0.05，與空白組；△：P ＜ 0.05，與模型組；*：P ＜ 0.05，與對(duì)照組。

20天0.397±0.045△1.032±0.151▲*0.479±0.017△0.504±0.196△39.469組別空白組模型組對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組F值n 15 15 15 15 3天0.328±0.014△0.871±0.293▲0.657±0.226 0.548±0.026 4.438 8天0.295±0.002△0.883±0.186▲0.644±0.269 0.644±0.262 3.993 15天0.319±0.048△*0.917±0.124▲*0.538±0.005▲△0.544±0.002▲△41.200

創(chuàng)傷后TGF-β參與了皮膚愈合的炎癥期、肉芽組織形成期和瘢痕形成期全過(guò)程。TGF-β對(duì)單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞具有很強(qiáng)的趣化作用，引起炎癥細(xì)胞的局部募集，分泌細(xì)胞生長(zhǎng)因子等促進(jìn)創(chuàng)面愈合；TGF-β還能趨化并作用于成纖維細(xì)胞，刺激多種基質(zhì)蛋白如纖維粘連蛋白和膠原基因的轉(zhuǎn)錄。并可通過(guò)調(diào)節(jié)蛋白酶的表達(dá)抑制基質(zhì)降解；刺激成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，促進(jìn)創(chuàng)口收縮。Smad是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的重要組成部分，它可以將TGF-β信號(hào)直接由細(xì)胞膜通過(guò)TβRⅠ、TβRⅡ受體結(jié)合形成的復(fù)合物，使其自身被磷酸化，并通過(guò)誘導(dǎo)結(jié)合形成的復(fù)合物轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核內(nèi)。當(dāng)細(xì)胞受到TGF-β刺激時(shí)，Smads與β-微管蛋白分離，Smad2或Smad3就會(huì)與SARA蛋白結(jié)合，被呈遞給TGF-β受體復(fù)合物而被活化[14,15]。內(nèi)源性的Smad7表達(dá)受TGF-β誘導(dǎo)，也可由作用于內(nèi)皮細(xì)胞的液體剪切力誘導(dǎo)表達(dá)[16]。蘇麗婷等[17]研究發(fā)現(xiàn)Smad7蛋白有抑制TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用，Smad7屬于抑制型Smad，可以通過(guò)干擾Smad磷酸化[18]，影響TGF-β超家族信號(hào)通路的傳導(dǎo)。

本研究結(jié)果顯示，兩種實(shí)驗(yàn)方法均表現(xiàn)為空白組創(chuàng)面愈合速度最快，模型組愈合緩慢，表明慢性難愈合創(chuàng)面的愈合速度明顯低于一般的創(chuàng)面。免疫組化發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組與模型組TGF-β1、Smad7的表達(dá)比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），Smad3的表達(dá)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組與模型組比較，3天無(wú)明顯差異（P ＞0.05），8天、15天、20天有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Western blot實(shí)驗(yàn)顯示TGF-β 1、Smad7、psmad3的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；各組間Smad3的表達(dá)比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），psmad7的表達(dá)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組與模型組比較，3-8天無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），15-20天有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。美洲大蠊提取液能通過(guò)降低Smad7的表達(dá)，減少Smad7的自身磷酸化來(lái)提高TGF-β1的表達(dá)，從而促進(jìn)創(chuàng)面愈合；Smad3結(jié)果顯示3-20天均逐漸上升，各組間比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），psmad3的表達(dá)結(jié)果發(fā)現(xiàn)空白組3-15天逐漸降低，模型組逐漸升高，對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組3-8天逐漸升高，8-20天逐漸降低，實(shí)驗(yàn)組與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明美洲大蠊提取液下調(diào)Smad3的現(xiàn)象不顯著，但能引起Smad3的磷酸化。

綜上所述，本次研究結(jié)果提示美洲大蠊提取液下調(diào)Smad3的現(xiàn)象不顯著，而能有效降低Smad7的表達(dá)，減少Smad7的自身磷酸化，從而減弱Smad7對(duì)TGF-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制，提高TGF-β1的表達(dá)而促進(jìn)創(chuàng)面愈合。進(jìn)一步證實(shí)了運(yùn)用美洲大蠊提取液后，慢性難愈合創(chuàng)面與一般創(chuàng)面的愈合速度差異不明顯，為中醫(yī)外治法提供了新的方法和思路。