幾種SDS睵AGE凝膠電泳染色方法的比較

林方養(yǎng)　楊耀東　萬婕等

摘要

[目的]對幾種SDSPAGE凝膠電泳染色方法進行比較。[方法]從凝膠背景顏色、染色時間及靈敏度的角度對6種SDSPAGE凝膠電泳快速染脫色方法進行比較研究，并對適用于椰子和油棕總蛋白質(zhì)SDSPAGE凝膠電泳的實用方法進行總結(jié)。[結(jié)果]方法F最快速，條帶清晰，染料及試劑都較少，是一種經(jīng)濟、快速、安全、實用的染色方法，整個過程僅需1 h左右。[結(jié)論]試驗比較了幾種SDSPAGE凝膠電泳染色方法，對進一步開展椰子和油棕蛋白質(zhì)組學(xué)研究具有重要意義。

關(guān)鍵詞 SDSPAGE凝膠電泳；染色方法；比較

中圖分類號 S188 文獻標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）08-02295-02

Comparison of Several SDSPAGE Gel Electrophoresis Staining Methods

LIN Fangyang， WU Yi et al

（Coconut Research Institute of Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/Hainan Provincial Key Laboratory of Tropical Oil Crops Biology， Wenchang， Hainan 571339）

Abstract [Objective] To compare several SDSPAGE gel electrophoresis staining methods. [Method] From perspective of gel background color， staining time and sensitivity， six SDSPAGE gel electrophoresis staining and destaining methods were compared， a suitable practical method of total protein SDSPAGE gel electrophoresis for coconut and oil palm was summarized. [Result] Method F is the fastest with clear band， less dyes and kit， which is an economy， rapid， safety， practical staining method. [Conclusion] The study has significance on further research of coconut and oil palm proteomics.

Key words SDSPAGE gel electrophoresis； Staining methods； Comparison

SDSPAGE（即十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺）凝膠電泳是對蛋白質(zhì)進行量化、比較及特性鑒定的常用方法，具有經(jīng)濟、快速和可重復(fù)等特點，可依據(jù)蛋白質(zhì)的分子量對其進行分離技術(shù)。該技術(shù)在蛋白質(zhì)分析中，具有設(shè)備簡單、操作方便、所需的樣品少和分辨率高等優(yōu)點，在分析或研究中應(yīng)用范圍廣泛，可用于蛋白質(zhì)、酶、核酸等生物大分子的分離、定性、定量及少量的制備，還可用于測定分子量、等電點等[1]。

目前，對蛋白質(zhì)進行電泳染色分析的方法有許多種，如：程冬梅等的氯化鈣和氯化鎂溶液能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)進行有效的染色[2]；許文濤等的氯化鉀染色方法[3]；常勝合等的考馬斯亮藍染色、銀染、熒光染色和負染方法[4]。在實際運用中，運用較多的是銀染和考馬斯亮藍染色法。銀染法是目前蛋白質(zhì)凝膠電泳中最敏感的方法之一，但硝酸銀具有腐蝕性，并對環(huán)境造成一定的污染，且對技術(shù)要求較高?？捡R斯亮藍染色法操作簡便，污染性較低，染色效果較好，近年來應(yīng)用較為廣泛[5-7]。筆者以考馬斯亮藍G250為染料，通過同一條件處理的蛋白質(zhì)凝膠進行不同方法的染色，試圖找出一種經(jīng)濟、節(jié)時、高效的快速染色方法，以期為今后深入開展蛋白質(zhì)組學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

以椰子和油棕的嫩葉片作為蛋白質(zhì)提取材料，葉片采自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所試驗基地。

1.2 方法

1.2.1

蛋白質(zhì)的提取。參考王旭初的方法[8]。

1.2.2

6種染色及脫色方法。①A方法。參考汪家政的方法[9]。電泳后先將凝膠用蒸餾水（約100 ml）洗1～2遍，加100 ml的染色液染色6 h或過夜，蒸餾水（約100 ml）洗1次，加100 ml脫色液脫色30 min，2次，移至保存液保存。②B方法。參考王旭初的方法[8]。操作方法同A（染色液和脫色液不同）。③C方法。參考于保峰等人的方法[10]。電泳后先將凝膠浸入100 ml蒸餾水中，微波爐內(nèi)強火加熱約3 min（剛好沸騰停止），待稍冷卻后再重復(fù)1次，然后將凝膠浸入100 ml染色液中，微波爐中加熱3 min，振蕩30 min，完成染色過程；脫色時，蒸餾水洗去多余的染色液，將凝膠浸入100 ml蒸餾水中，微波爐內(nèi)強火加熱3 min，重復(fù)2～3次，冷卻后即完成脫色過程，放入蒸餾水中保存。④D方法。參考G. Hervieu的方法[11]。用100 ml的蒸餾水洗凝膠1～2次，將100 ml染色液置微波爐高火2～3 min（剛好沸騰停止），振蕩30 min；倒掉染色液水洗1次，加100 ml脫色液置微波爐高火2～3 min（剛好沸騰停止），振蕩30 min，重復(fù)1次；將脫色好的凝膠置保存液中保存。⑤E方法。參考J. E.科林根等人的方法[12]。從電泳儀中取出聚丙烯酰胺凝膠，用100 ml的蒸餾水洗凝膠1～2次，放入塑料或玻璃容器中，容器內(nèi)含有100 ml凝膠的異丙醇固定液，1.5 mm厚的凝膠則搖動60 min；棄去固定液，加100 ml快速考馬斯亮藍G250染色液，1.5 mm的凝膠則搖動3 h；棄去染色液，加100 ml濃度10%乙酸洗脫液洗脫2次，直到清晰的背景上能看見清楚的蛋白條帶。⑥F方法。參考查德 J的方法[13]。電泳結(jié)束后，用100 ml的蒸餾水洗凝膠1～2次，將凝膠置于盛有100 ml試劑a的微波爐專用塑料容器中；用微波爐的強火加熱凝膠劑試劑a直到溶液沸騰，約2～3 min；室溫搖床上搖動凝膠30 min，棄去用過的試劑a，用水快速地沖洗一下凝膠，這時，即使在藍色的背景下也可以看到蛋白質(zhì)含量在100 ng以上的蛋白條帶顯現(xiàn)出來；加入100 ml試劑b，用微波爐的高火加熱凝膠直至溶液沸騰；棄去熱試劑b，用蒸餾水沖洗凝膠，此步完成后可見蛋白含量在50 ng以上的條帶；加入100 ml試劑c，并用微波爐高火加熱凝膠至沸騰；棄去加熱試劑c，用蒸餾水漂洗凝膠，這樣，蛋白含量在25 ng以上的蛋白條帶可顯現(xiàn)；加熱100 ml試劑d，并用微波爐高火加熱凝膠至沸騰；在溶液中放入紙巾，吸取多余染料；室溫冷卻凝膠5 min，此時蛋白含量大于5 ng的條帶也能顯現(xiàn)；重復(fù)步驟“加熱100 ml試劑d”后面操作2次以上，或?qū)⒛z放在試劑d中于室溫搖動15 min以上，這時某些僅含有2.5 ng的蛋白條帶也能顯現(xiàn)。

2 幾種方法的比較分析

圖1表明，方法A的條帶也比較清晰，但凝膠背景較深，較難脫色。方法B的效果很好，唯一的缺陷就是所需的時間較長，大概需要7～8 h才能完成分析過程。方法C試劑只有蒸餾水加染料，其他試劑完全省去，條帶也可以顯現(xiàn)，但效果不夠清晰。方法D采用的是微波快速染色脫色的方法，較A～C法速度快，但條帶不夠清晰。方法E所用的染料是所有的方法中最少的（200 ml中僅有0.012 g的考馬斯亮藍G250），但此方法需要固定后才能染色，整個過程需要5～6 h，效果和F法區(qū)別不大。方法F最快速，條帶清晰，染料及試劑都較少，是一種經(jīng)濟、快速、安全、實用的染色方法，整個過程僅需1 h左右。

3 結(jié)論

綜上所述，通過幾種SDSPAGE凝膠電泳染色方法的比較，圍繞染色方法的優(yōu)化，集中在以下幾個方面：提高染色靈敏度；簡化操作過程；減少試劑及染料的用量；朝著低毒的方向發(fā)展。上述的幾種方法中，F(xiàn)法較其他的方法快速，靈敏度較高，所以試劑及染料少，但F法中使用了異丙醇，其是一種有毒物質(zhì)，葉長春[14]在文章中用無水乙醇來代替無水甲醇進行染色優(yōu)化，取得了較好的效果。今后對于F法的研究，將嘗試用無水乙醇來代替異丙醇進行優(yōu)化。試驗中，F(xiàn)法是以上6種染色方法中效果較好的一種凝膠染色方法，值得在實驗室推廣和運用。

參考文獻

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