草蓯蓉乙醇提取物對NAFLD大鼠肝臟炎性因子表達(dá)的影響

何松美，劉霞，吳煜良，劉旭明，殷思純，龍堯

·實驗性肝炎·

草蓯蓉乙醇提取物對NAFLD大鼠肝臟炎性因子表達(dá)的影響

何松美，劉霞，吳煜良，劉旭明，殷思純，龍堯

目的探討草蓯蓉乙醇提取物（BREE)對非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD)大鼠肝組織羥脯氨酸和炎性因子的影響。方法采用高脂飼料喂養(yǎng)構(gòu)建大鼠NAFLD模型，大鼠被隨機(jī)分為正常對照組、NAFLD模型組和BREE治療組（500 mg·kg-1·d-1）。在用藥8 w末，處死動物，留取血清，采用ELSIA法檢測肝組織白細(xì)胞介素（IL）-1β、腫瘤壞死因子（TNF）-α和白細(xì)胞介素（IL）-6水平；采用HE染色和免疫組化法分別觀察大鼠肝臟病理學(xué)變化和檢測肝組織NF-kB/p65表達(dá)。結(jié)果BREE治療組大鼠血清ALT[（39.47±20.26）U/L]和AST[（46.48±18.52）U/L]水平較模型組顯著下降[（79.32±19.05）U/L和（88.35±17.46）U/L，P＜0.01]，而血清還原性谷胱甘肽[（349.43±45.52）mg/L]水平較模型組明顯升高[（265.38±28.57）mg/L，P＜0.01]；BREE治療組大鼠肝組織NF-kB/p65陽性表達(dá)[（15.49±4.78）%]和羥脯氨酸含量[（14.28±3.08)mg/g]均較模型組顯著下降[分別為（87.54±6.59）%和（35.47± 4.53）mg/g，P＜0.01]，同樣，IL-1β、TNF-α和IL-6水平[分別為（34.51±5.61）pg/mL、（45.37±7.03）pg/mL）和（18.98±5.04）pg/mL]均較模型組顯著降低[分別為（78.25±6.51）pg/mL、（85.64±6.25）pg/mL、（29.19±4.82）pg/mL，P＜0.01]；BREE處理組動物肝組織病理學(xué)損害程度明顯減輕。結(jié)論BREE能明顯改善NAFLD大鼠肝功能和肝組織膠原沉積，其機(jī)制可能與通過下調(diào)NF-κB/p65和炎癥細(xì)胞因子表達(dá)有關(guān)。

非酒精性脂肪性肝?。徊萆惾匾掖继崛∥?；核轉(zhuǎn)錄因子κB/p65；炎性細(xì)胞因子

非酒精性脂肪性肝?。╪onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指由肝細(xì)胞脂肪變性發(fā)展到炎癥纖維化的一組疾病[1]，通常原發(fā)于與胰島素抵抗相關(guān)的肥胖、2型糖尿病、高脂血癥、高血壓等代謝紊亂性疾病[2]。研究報道[3]，核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factor-κB，NF-kB）、白介素1β（Interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）和白介素-6（Interleukin-6，IL-6）等炎性因子引起的炎癥反應(yīng)是NAFLD發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵事件，不僅可以引起脂肪性肝炎，還會進(jìn)一步促進(jìn)纖維化的進(jìn)程。草蓯蓉具有抗腫瘤、抗炎、清除自由基、抗脂質(zhì)過氧化等作用[4～6]。草蓯蓉（boschniakia rossica）可以通過抑制非酒精性脂肪肝大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)而起到保護(hù)肝臟的作用[7]，但其對非酒精性脂肪性肝病炎癥損傷有無抑制作用尚不清楚。因此，本文擬通過構(gòu)建NAFLD大鼠模型，觀察草蓯蓉對大鼠肝臟NF-kB、IL-1β、TNF-α和IL-6水平的影響，探討草蓯蓉對NAFLD大鼠治療的可能機(jī)制，為臨床使用草蓯蓉治療NAFLD提供新的實驗和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、試劑與儀器Sprague-Dawley（SD）大鼠30只，雌雄各半，體質(zhì)量（180±20）g，購自本校實驗動物中心（許可證號：粵A2011108）。草蓯蓉乙醇提取物（boschniakia rossica ethanol extract,BREE）購于安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理研究所；戊巴比妥鈉（美國Sigma公司，批號:P3761）;檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）及還原型谷胱甘肽（GSH）試劑盒（上海江萊生物科技有限公司）；檢測IL-1β、TNF-α和IL-6試劑（上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；兔抗大鼠NF-kB/p65多克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司）；檢測羥脯氨酸（Hyp）試劑（南京建成生物工程研究所提供）。UV-300型紫外分光光度計（日本島津）；可調(diào)高速組織勻漿機(jī)（IKATM18 Basic，德國）；電熱恒溫水浴箱（余姚東方電工儀器廠）；超速冷凍離心機(jī)（BECKMAN，USA）；EL30型酶標(biāo)儀（美國Bio-Tek公司）；奧林巴斯顯微鏡BX51（Image-Pro Plus6.0圖象分析軟件）；7600型全自動生化分析儀（日本日立公司）。

1.2 NAFLD大鼠模型的建立取大鼠30只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后，隨機(jī)分為正常對照組10只和NAFLD模型組20只。模型建立方法參考文獻(xiàn)[8]，給予高脂飼料（88%基礎(chǔ)飼料+10%豬油+2%膽固醇），8 w后造模成功。根據(jù)體質(zhì)量隨機(jī)分為模型組和草蓯蓉處理組。給予草蓯蓉組動物草蓯蓉500 mg·kg-1，連續(xù)灌胃8 w，正常對照組和模型組均給予蒸餾水（10 mL·kg-1）灌胃。在用藥8 w末，處死各組大鼠，處死前稱體質(zhì)量，給予3%巴比妥那300 mg·kg-1腹腔注射麻醉，打開腹腔，自心臟取血，離心、留取血清，置-20℃保存，備檢。取部分肝臟，置中性甲醛液中固定，行病理學(xué)切片。剩余肝組織置于-80℃冰箱保存，備檢。

1.3 血生化指標(biāo)的檢測采用Henry法測定AST和ALT；采用比色法測定GSH。

1.4 肝組織細(xì)胞因子測定取凍存肝組織，制成肝勻漿，離心，取上清，采用ELISA法測定肝組織IL-1β、TNF-α和IL-6水平。

1.5 肝組織NF-kB/p65蛋白表達(dá)的檢測取肝組織，用10%中性緩沖福爾馬林液固定，石蠟包埋，切片。將切片浸入0.1 mol/L PBS（pH 7.4）中浸泡、微波修復(fù)抗原；先后加兔抗大鼠NF-kBp65和山羊抗兔IgG，滴加鏈霉抗生物素-過氧化物酶溶液；滴加Strept avidin-biotin complex（SABC）；二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，滴加蘇木素輕度復(fù)染后，脫水、透明、中性膠封片。結(jié)果判斷：以細(xì)胞核或細(xì)胞漿出現(xiàn)黃褐色細(xì)顆粒狀著色為陽性細(xì)胞，在400倍顯微鏡下，每張切片隨機(jī)選10個視野，數(shù)500個細(xì)胞，計算陽性率。

1.6 肝組織Hyp水平測定采用氯仿-T法測定，取肝組織50 mg，加950 ml/L乙醇脫脂0.5 d，于脫脂器中用丙酮脫脂2 d，取出,置10℃烤箱烘干，研磨成粉。再精確稱取肝粉10 mg，放入加帶塞試管內(nèi)，加入6 mol/L鹽酸0.3 mL，放在125℃烤箱水解5 h。自然冷卻后，移入50 mL容量瓶，加6 mol/L氫氧化鈉,調(diào)pH至6.0。用蒸餾水稀釋至50 mL，過濾、取1.0 mL測定。各管加1.0 mL氯氨T溶液，搖勻，室溫下放置20 min，繼續(xù)加入1.0 mL過氯酸，5 min后加入1.0 mL 100 ml/L對二甲氨基苯甲醛溶液。65℃水浴，保溫20 min，取出后冷卻。20 min后在550 nm波長處比色。根據(jù)已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)的Hyp，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定肝組織Hyp水平。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SPSS11.6統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素分析，計量資料以（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BREE對NAFLD大鼠血清ALT、AST和GSH水平的影響在治療8周末，BREE治療組大鼠血清ALT和AST水平均顯著低于模型組（P＜0.010），而血清GSH水平明顯高于模型組（P＜0.01，表1），提示BREE可明顯改善NAFLD大鼠肝功能。

表1 各組大鼠血生化指標(biāo)（±s）的比較

表1 各組大鼠血生化指標(biāo)（±s）的比較

與正常組比，①P＜0.01；與模型組比，②P＜0.01

只數(shù)ALT（U/L）AST（U/L）GSH（mg/L）正常組109.05±2.1919.27±5.09394.61±51.62模型組1079.32±19.05①88.35±17.46①265.38±28.57①草蓯蓉1039.47±20.26②46.48±18.52②349.43±45.52②

2.2 BREE對NAFLD大鼠肝組織IL-1β、TNF-α和IL-6水平的影響NAFLD模型大鼠肝組織IL-1β、TNF-α和IL-6水平均顯著高于正常組（P＜0.01）；BREE處理組動物肝組織IL-1β、TNF-α和IL-6水平較模型組均顯著下降（P＜0.01，表2）。

表2 BREE對NAFLD大鼠肝組織IL-1β、TNF-α和IL-6水平（pg/mL，±s）的影響

表2 BREE對NAFLD大鼠肝組織IL-1β、TNF-α和IL-6水平（pg/mL，±s）的影響

與正常組比，①P＜0.01；與模型組比，②P＜0.01

只數(shù)IL-1βTNF-αIL-6正常組1030.51±4.2440.38±4.5716.31±1.92模型組1078.25±6.51①85.64±6.25①29.19±4.82①草蓯蓉1034.51±5.61②45.37±7.03②18.98±5.04②

2.3 BREE對NAFLD大鼠肝組織NF-κB/p65蛋白表達(dá)和Hyp水平的影響NAFLD模型組大鼠肝組織陽性染色細(xì)胞明顯，NF-κB/p65蛋白陽性表達(dá)率和Hyp水平較正常組顯著升高（P＜0.01）；BREE處理組動物肝組織內(nèi)棕黃色顆粒較模型組明顯減少，陽性表達(dá)率較NAFLD大鼠明顯下降（P＜0.01，表3）。

表3 BREE對NAFLD大鼠肝組織NF-κBp65和Hyp水平（±s）的影響

表3 BREE對NAFLD大鼠肝組織NF-κBp65和Hyp水平（±s）的影響

與正常組比，①P＜0.01；與模型組比，②P＜0.01

只數(shù)NF-κBp65（%）Hyp（mg/g）正常組1012.54±6.5912.54±3.06模型組1087.54±6.59①35.47±4.53①草蓯蓉1015.49±4.78②14.28±3.08②

3 討論

NAFLD是一類與酒精性肝病相似的肝臟組織學(xué)改變,但無過量飲酒史（攝入酒精＜40 g/d）的臨床病理綜合征[9]，是在脂肪沉積的基礎(chǔ)上異常的細(xì)胞因子、脂質(zhì)過氧化和氧化應(yīng)激等參與的炎癥反應(yīng)形成的脂肪性肝炎，但其確切機(jī)制尚不清楚。既往認(rèn)為,脂肪肝為良性病變,不會發(fā)展成肝纖維化、肝硬化,但大量臨床肝活檢研究證實NAFLD在脂肪性肝炎的基礎(chǔ)上約40%～50%會發(fā)展為肝纖維化,15%～20%可發(fā)展為肝硬化,甚至?xí)?dǎo)致肝細(xì)胞癌的發(fā)生[10]。

祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為草蓯蓉具有通絡(luò)作用，可能有助于改善肝功能。研究提示，草蓯蓉可明顯改善二甲基亞硝胺誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化[11]。草蓯蓉對NAFLD大鼠肝臟的保護(hù)作用如何？本實驗結(jié)果顯示，用藥8 w后，與NAFLD模型大鼠比，BREE處理組肝組織ALT和AST水平明顯降低，GSH明顯提高（P＜0.01），說明BREE對NAFLD大鼠肝臟同樣具有保護(hù)作用。

NF-κB在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的基因中起關(guān)鍵作用,是一種具有轉(zhuǎn)錄激活功能的蛋白質(zhì)，是多種信號傳導(dǎo)途徑的匯聚點。當(dāng)細(xì)胞處于靜息狀態(tài)時，NF-κB的P65亞基與其抑制蛋白IkB結(jié)合，覆蓋P50蛋白的核定位信號，組成無活性的NF-κB/IkB，以p50-p65-IkBα或p50-p65-IkB三聚體的形式存在。當(dāng)機(jī)體受到外界因素刺激時，IκB發(fā)生磷酸化，并從NF-κB二聚體上解離，暴露p50的核定位信號，NF-κB得以激活并移位進(jìn)入細(xì)胞核，促進(jìn)核轉(zhuǎn)錄，參與許多炎癥因子如TNF-α、IL-6、CRP和TGF等基因的表達(dá)調(diào)控[12]，產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng),而TNF-α和IL-1β不僅是NF-κB調(diào)節(jié)的產(chǎn)物，又能反過來激活NF-κB，加重機(jī)體炎癥反應(yīng)，從而加重胰島素抵抗（IR）的肝臟損傷，引起糖尿病癥狀。研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α可抑制葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn),干擾胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致IR，它還能促進(jìn)脂肪細(xì)胞的脂肪分解及FFA的釋放[13]。越來越多的證據(jù)表明炎癥與IR相關(guān)，至少是IR的一部分機(jī)制。Boden et al[14]給大鼠輸注脂肪乳／肝素，造成了明顯的肝臟IR和肝臟NF-κB激活，與NF-κB相關(guān)的一些炎癥因子如MCP-1、TNF-α、IL-1β和IL-6等明顯升高，進(jìn)一步激活炎癥通路，炎癥反應(yīng)擴(kuò)大，造成惡性循環(huán)。由上可知，NF-κB、TNF-α、IL-1β和IL-6在NAFLD的發(fā)展過程中起著重要作用。本實驗結(jié)果證實，NAFLD模型大鼠肝組織細(xì)胞核內(nèi)棕黃色顆粒明顯比其他組增多且著色深、肝組織IL-1β、TNF-α和IL-6水平明顯增高（P＜0.01），BREE處理動物肝組織NF-κB/p65表達(dá)明顯被抑制、肝組織IL-1β、TNF-α和IL-6水平明顯降低（P＜0.01），提示TGF可能通過直接或間接作用下調(diào)NF-κB/p65表達(dá)，降低肝組織IL-1β、TNF-α和IL-6的產(chǎn)生，從而對NAFLD大鼠發(fā)揮治療作用，而高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD大鼠肝臟NF-κB的激活可能是產(chǎn)生肝臟和全身胰島素抵抗的根源。

在NAFLD的發(fā)展過程中往往伴有不同程度的肝纖維化病變，肝纖維化的細(xì)胞外基質(zhì)成分主要為膠原纖維，而羥脯氨酸常是膠原的特異氨基酸，在膠原蛋白的成分中約占14%，在非膠原蛋白中則很少。因此，測定肝組織Hyp含量可間接反映肝纖維化的程度[15]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，與正常組比NAFLD模型大鼠肝臟Hyp含量明顯增高（P＜0.01）；與NAFLD模型大鼠比，BREE處理動物肝臟Hyp含量明顯減低（P＜0.01），提示BREE可通過減少肝臟Hyp含量，減輕局部組織炎癥，從而改善肝纖維化病變。

綜上所述，BREE可能是通過直接或間接下調(diào)NF-κB/p65表達(dá)、降低肝組織IL-1β、TNF-α和IL-6水平、抑制肝臟Hyp的產(chǎn)生，從而具有保護(hù)肝細(xì)胞的作用，表現(xiàn)為ALT和AST水平降低，GSH水平升高。BREE能減輕NAFLD大鼠肝臟病理學(xué)變化，改善肝功能和糖脂代謝，發(fā)揮對NAFLD大鼠的保護(hù)作用。

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（收稿：2014-03-12）

（校對：陳從新）

Impact of boschniakia rossica ethanol extract on hepatic expression of inflammatory cytokines in rats with NAFLD

He Songmei，Liu Xia，Wu Yuliang，et al.Department of Infectious Disease，Peaple’s Hospital，Dongguan，523008，Guangdong Province，China

ObjectiveToinvestigatetheeffectofboschniakiarossicaethanolextract（BREE）on hydroxyproline（Hyp）and inflammatory cytokines in rats with non-alcoholic fatty liver diseases（NAFLD）. MethodsThe model of NAFLD in rats was established by hight-fat diet administration.Rats were randomly divided into control，model and BREE treatment group（500 mg·kg-1·d-1）.All rats were sacrificed to harvest serum and liver tissues at the end of eighth week.Serum levels of AST，ALT and reduced glutathione（GSH）were measured，and the levels of interleukin（IL）-1β，tumor necrosis factor（TNF）-α and IL-6 in liver tissues were detected by ELSIA.HE staining and immunohistochemistry were performed for evaluation of liver pathological changes and the expression of NF-kB/p65 in liver tissues，respectively.ResultsSerum levels of ALT[（39.47± 20.26）U/L]and AST[（46.48±18.52）U/L]in rats subjected to BREE treatment significantly decreased as compared to in the model group[（79.32±19.05）U/L and（88.35±17.46）U/L，respectively，P＜0.01]；Serum GSH levels in BREE-treated rats[（349.43±45.52）mg/L]significantly increased than in the model[（265.38±28.57）mg/L，P＜0.01]；The positive rates of NF-kB/p65[（15.49±4.78）%]and Hyp contents[（14.28±3.08）mg/g]in liver tissues in BREE-treated rats significantly decreased than in the model[（87.54±6.59）%and（35.47±4.53）mg/g，respectively，P＜0.01]；the IL-1β，TNF-α and IL-6 levels[（34.51±5.61）pg/mL，（45.37±7.03）pg/mL，（18.98±5.04）pg/mL，respectively]in liver tissues in BREE-treated rats were significantly lower than in the model[（78.25±6.51）pg/mL，（85.64±6.25）pg/mL，（29.19±4.82）pg/mL，respectively，P＜0.01]；BREEalsosignificantlyalleviated pathological changes in the liver.ConclusionsBREE significantly improves liver function and collagen deposition in rats with NAFLD by down regulation of NF-κB/p65 and inflammatory cytokines in the liver.

Non-alcoholic fatty liver disease；Boschniakia rossica ethanol extract；Nuclear transcription factor κB/p65；Inflammatory cytokines

10.3969/j.issn.1672-5069.2014.05.018

523008廣東省東莞市人民醫(yī)院感染病科（何松美，劉旭明，殷思純）；腫瘤科（吳煜良）；廣東醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院生理科學(xué)實驗室（劉霞）；廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院感染病科（龍堯）

何松美，女，34歲，碩士研究生，主治醫(yī)師。主要從事病毒性肝炎及常見傳染病的診治研究。E-mail:270951394@qq.com