拉米夫定和阿德福韋酯抗乙型肝炎病毒耐藥位點(diǎn)檢測及臨床意義

賈德興，馮靜，李萍，倫秀英，于賢杰

·病毒性肝炎·

拉米夫定和阿德福韋酯抗乙型肝炎病毒耐藥位點(diǎn)檢測及臨床意義

賈德興，馮靜，李萍，倫秀英，于賢杰

目的對(duì)應(yīng)用拉米夫定或阿德福韋酯治療后耐藥的慢性乙型肝炎患者給予聯(lián)合治療，觀察治療前后乙型肝炎病毒（HBV）變異模式的變化及對(duì)療效的影響。方法在142例對(duì)拉米夫定耐藥患者中，給予72例拉米夫定聯(lián)合阿德福韋酯、70例給予恩替卡韋聯(lián)合阿德福韋酯冶療，在72例對(duì)阿德福韋酯耐藥患者中，給予36例聯(lián)合拉米夫定、另36例聯(lián)合恩替卡韋治療，各組均治療48 w，測定和比較治療前后所有患者HBV DNA聚合酶逆轉(zhuǎn)錄區(qū)相關(guān)變異位點(diǎn)變化。結(jié)果在拉米夫定初治發(fā)生耐藥的患者中，發(fā)生M204V和IL180M變異率分別為98.6%（140/142）和56.3%（80/142），接受拉米夫定聯(lián)合阿德福韋酯治療患者HBV DNA陰轉(zhuǎn)率為86.1%，與恩替卡韋聯(lián)合阿德福韋酯治療患者（97.1%）比，無顯著性差異；在阿德福韋酯初治發(fā)生耐藥的患者中，A181V和N236T變異頻率分別為63.9%（46/72）和52.8%（38/72），接受阿德福韋酯聯(lián)合拉米夫定治療患者HBV DNA陰轉(zhuǎn)率為52.8%，顯著低于阿德福韋酯聯(lián)合恩替卡韋組（77.8%，P＜0.05）；在阿德福韋酯聯(lián)合拉米夫定治療的36例患者中，19例（52.8%）HBV DNA陰轉(zhuǎn)，在阿德福韋酯聯(lián)合恩替卡韋治療的36例患者中，28例（77.8%）患者HBV DNA陰轉(zhuǎn)，差異具有顯著性（x2＝4.963，P＜0.05）。結(jié)論以rtM204變異為主的拉米夫定耐藥在聯(lián)合阿德福韋酯進(jìn)行挽救治療后療效確定；以rtA181變異為主的阿德福韋酯耐藥患者在接受阿德福韋酯聯(lián)合恩替卡韋治療后的療效優(yōu)于聯(lián)合拉米夫定。

慢性乙型肝炎；拉米夫定；阿德福韋酯；耐藥；挽救治療

在應(yīng)用核苷（酸）類藥物過程中，如發(fā)生病毒耐藥，挽救治療多采取聯(lián)合應(yīng)用另一種無交叉耐藥的抗病毒藥物。我們?cè)?42例應(yīng)用拉米夫定和72例應(yīng)用阿德福韋酯初始治療耐藥的慢性乙型肝炎患者，檢測了治療前后其耐藥模式的變化及其對(duì)療效的影響。

1 資料與方法

1.1 病例來源自2009年9月～2012年12月我院就診或住院的慢性乙型肝炎患者214例，診斷符合2005年發(fā)布的《慢性乙型肝炎防治指南》的標(biāo)準(zhǔn)。其中142例為初次接受拉米夫定抗病毒治療發(fā)生耐藥的患者，男115例，女27例；年齡為（33.9± 12.1）歲；72例為初次接受阿德福韋酯抗病毒治療發(fā)生耐藥的患者，男52例，女20例；年齡為（43.1± 15.7）歲。

1.2 治療方法142例初次接受拉米夫定（葛蘭素史克公司）100 mg/d抗病毒治療，發(fā)生耐藥的平均時(shí)間為（42±19）w。將患者隨機(jī)分為兩組，1組給予拉米夫定聯(lián)合阿德福韋酯（葛蘭素史克公司）10 mg/d治療，另1組換用恩替卡韋（施貴寶公司）0.5 mg/d，聯(lián)合阿德福韋酯治療，共48 w；72例初次接受阿德福韋酯（葛蘭素史克公司）10 mg/d抗病毒治療，發(fā)生耐藥的平均時(shí)間為（74±21）w。將患者隨機(jī)分為兩組，1組給予阿德福韋酯聯(lián)合拉米夫定（葛蘭素史克公司）治療，另1組給予阿德福韋酯聯(lián)合恩替卡韋（施貴寶公司）治療，共48 w。

1.3 血清HBV DNA定量檢測采用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)法檢測（美國ABI公司PE-5700熒光定量PCR擴(kuò)增儀和深圳匹基公司試劑盒）。

1.4 HBV P區(qū)耐藥位點(diǎn)測序采用套式PCR法擴(kuò)增特異性HBV基因片段（BIO-RAD系列S1000 Thermal Cycler定性PCR儀，使用上海復(fù)星公司提供的HBV DNA提取試劑盒）。采用焦磷酸測序法進(jìn)行核苷酸序列測定，分析P區(qū)耐藥（PyroMark Q96 ID測序儀，PyroMark Gold Q96 Reagents焦磷酸測序試劑盒）。共檢測11個(gè)位點(diǎn)變異，即rtL180M、rtM204V/I、rtV173L、rtI169T、rtS202G（V/C/ I）、rtM250V（L/I）、rtA181V/T、rtN236T、rtT184A（G/I/ S/L/F）、rtA194T/M和rtI233V。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，兩組間均數(shù)差異的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用x2檢驗(yàn)及Fisher確切概率法，P＜0.05為具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 基線特征拉米夫定初治耐藥和阿德福韋酯初治耐藥患者基線資料見表1和表2。

表1 拉米夫定初治耐藥患者基線資料（±s）

表1 拉米夫定初治耐藥患者基線資料（±s）

例數(shù)年齡（歲）ALT（U/L）HBV DNA（lg copies/ml）拉米夫定聯(lián)合阿德福韋酯7233.1±12.767.1±40.55.4±0.9恩替卡韋聯(lián)合阿德福韋酯7033.5±9.873.8±57.05.3±1.0

表2 阿德福韋酯初治耐藥患者基線資料（±s）

表2 阿德福韋酯初治耐藥患者基線資料（±s）

例數(shù)年齡（歲）ALT（U/L）HBV DNA（lg copies/ml）阿德福韋酯聯(lián)合拉米夫定3642.5±18.345.8±28.04.3±0.9阿德福韋酯聯(lián)合恩替卡韋3639.7±20.150.5±31.74.3±0.7

2.2 初始治療發(fā)生耐藥后的變異模式初始應(yīng)用拉米夫定耐藥后，M204V/I變異頻率為98.6%（140/142），L180M為56.3%（80/142），V173L為16.9%（24/142），A181V為2.8%（4/142），N236T為2.8%（4/142），T184G為5.6%（8/142），S202G為5.6%（8/142）。以M204V/I和M204V＋L180 M為主。存在部分恩替卡韋耐藥變異；初始應(yīng)用阿德福韋酯耐藥后，A181V變異頻率為63.9%（46/72），N236T為52.8%（38/72），A181T為8.3%（6/72），L180 M為16.7（12/72），見表3。

2.3 耐藥后聯(lián)合治療的療效在治療48 w，在拉米夫定聯(lián)合阿德福韋酯治療的72例患者中，62例（86.1%）HBV DNA陰轉(zhuǎn)，在70例恩替卡韋聯(lián)合阿德福韋酯治療的患者中，68例（97.1%）HBV DNA陰轉(zhuǎn)（x2＝2.099，P＞0.05）；對(duì)所有患者再次進(jìn)行P區(qū)耐藥測序。結(jié)果顯示，在兩組患者中，治療前存在M204V、M204I、M204V＋L180M＋V173L、L180 M和M204V＋V173L變異的76例患者HBV DNA均陰轉(zhuǎn)，病毒變異位點(diǎn)消失。在拉米夫定聯(lián)合阿德福韋酯治療的患者中，在存在M204V/L180M變異的25例患者中，5例HBV DNA未陰轉(zhuǎn)，其中4例變異模式未發(fā)生改變，另1例改變?yōu)锳181T/M204V/L180 M/V173L變異。在4例M204V/L180 M/S202G變異者中，2例HBV DNA未陰轉(zhuǎn)，在4例M204V/ T184G/L180M變異者中，3例HBV DNA未陰轉(zhuǎn)，變異模式也未發(fā)生改變；在恩替卡韋聯(lián)合阿德福韋酯治療的70例患者，4例M204V/T184G/L180M變異患者中，2例HBV DNA未陰轉(zhuǎn)，其中1例改變?yōu)镸204V/L180M/T184G/I/A181T變異；在治療48 w，在阿德福韋酯聯(lián)合拉米夫定治療的36例患者中，19例（52.8%）HBV DNA陰轉(zhuǎn)，在阿德福韋酯聯(lián)合恩替卡韋治療的36例患者中，28例（77.8%）患者HBV DNA陰轉(zhuǎn)，差異具有顯著性（x2＝4.963，P＜0.05）。在36例阿德福韋酯聯(lián)合拉米夫定治療的患者中，治療前9例存在A181V/N236T和A181T/ N236T變異患者HBV DNA均未陰轉(zhuǎn)，變異模式也未發(fā)生改變。在17例A181V變異患者中，有9例HBV DNA陰轉(zhuǎn)，其中1例未陰轉(zhuǎn)患者出現(xiàn)A181V/ M204V/L180 M變異。在36例阿德福韋酯聯(lián)合恩替卡韋治療的患者，6例存在A181V/N236T變異患者中，5例HBV DNA未陰轉(zhuǎn)，在3例A181T/N236T變異患者中，HBV DNA均未陰轉(zhuǎn)，變異模式也未發(fā)生改變。

表3 初始治療發(fā)生耐藥后的變異模式

3 討論

核苷（酸）類似物已成為繼干擾素α（IFN-α）之后的又一類用于抗HBV治療的有效藥物。大多數(shù)接受核苷（酸）類似物治療的患者難以通過短期治療實(shí)現(xiàn)持久應(yīng)答，而需要接受長期治療，這必將增加病毒耐藥的風(fēng)險(xiǎn)。隨著核苷（酸）類似物種類的增加，HBV耐藥變異的復(fù)雜性也大大增加。HBV侵入人體后，與靶細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，脫去包膜，進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中，脫去核衣殼，部分雙鏈環(huán)狀HBV DNA進(jìn)入靶細(xì)胞核中，在DNA聚合酶作用下，以負(fù)鏈DNA為模板，延長正鏈，修補(bǔ)裂隙區(qū)，形成共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）。HBV DNA的復(fù)制首先以cccDNA為模板，在宿主RNA聚合酶的作用下，轉(zhuǎn)錄成3.5kb、2.4kb、2.1kb和0.7kb等大小不同的HBV mRNA，部分3.5kb的HBV mRNA作為前基因組RNA，在HBV逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，逆轉(zhuǎn)錄為負(fù)鏈DNA，再以此為模板，在HBV聚合酶的作用下合成正鏈DNA，形成子代病毒的部分雙鏈HBV DNA。其他的HBV mRNA在細(xì)胞漿中翻譯成病毒的各種蛋白成分，并與子代HBV DNA裝配成完整的病毒顆粒，釋放至細(xì)胞外。部分子代HBV DNA進(jìn)入靶細(xì)胞核中，補(bǔ)充cccDNA池，并繼續(xù)復(fù)制，周而復(fù)始。慢性HBV感染者肝細(xì)胞核中的cccDNA半壽期長，而現(xiàn)有核苷（酸）類似物對(duì)于cccDNA均無直接作用，這也是多數(shù)患者需用核苷（酸）類似物長期治療的原因之一。

HBV每24 h可復(fù)制1×1012～1013拷貝。HBV雖然屬于DNA病毒，但其復(fù)制過程并非DNA-DNA的直接復(fù)制過程，而是經(jīng)過前基因組RNA的中間過程，即DNA-RNA-DNA的復(fù)制過程。在前基因組RNA逆轉(zhuǎn)錄為負(fù)鏈DNA的過程中，由于HBV逆轉(zhuǎn)錄酶缺乏嚴(yán)格的校正機(jī)制，導(dǎo)致HBV復(fù)制過程中核苷酸錯(cuò)配率較高，介于其他DNA病毒和RNA病毒之間，大約為1/105。HBV復(fù)制的這種過程和特點(diǎn)，決定了同一患者體內(nèi)不同的HBV株基因序列之間也存在差別，因此，每一個(gè)患者體內(nèi)的病毒都是由存在基因序列差異的病毒株組成的動(dòng)態(tài)變化的病毒群，即HBV以準(zhǔn)種（quasispecies）的形式存在。

HBV病毒群的演變也符合達(dá)爾文進(jìn)化論的規(guī)律。有些位點(diǎn)的變異，可能是致死性的，發(fā)生這種變異的HBV不能存活。有些位點(diǎn)的變異對(duì)其復(fù)制能力沒有顯著影響，但很多位點(diǎn)變異導(dǎo)致子代病毒復(fù)制能力降低或增強(qiáng)。不同基因序列的病毒株在病毒群中所占的相對(duì)比例，一方面取決于病毒株自身的復(fù)制能力，另一方面也受到機(jī)體免疫系統(tǒng)或藥物的選擇性壓力的影響。

核苷（酸）類似物進(jìn)入機(jī)體后，形成三磷酸活性成分，與機(jī)體天然的脫氧三磷酸核苷（dNTP）競爭性結(jié)合到HBV聚合酶上。但由于三磷酸化的核苷（酸）類似物不具備天然的dNTP結(jié)構(gòu)，而使HBV的DNA鏈合成終止，從而抑制HBV復(fù)制。但如果患者體內(nèi)的HBV序列發(fā)生變異，導(dǎo)致產(chǎn)生的HBV聚合酶與核苷（酸）類似物結(jié)合力降低，那么變異的HBV即不受核苷（酸）類似物的抑制或抑制能力下降。因此，在繼續(xù)應(yīng)用核苷類似物治療的情況下，野生株病毒因?qū)塑眨ㄋ幔╊愃莆锩舾卸^續(xù)被抑制；變異株病毒因具備一定的復(fù)制能力，而且對(duì)核苷（酸）類似物不敏感而逐漸替代野生株，成為體內(nèi)HBV的優(yōu)勢株，從而導(dǎo)致患者對(duì)于核苷（酸）類似物的耐藥。

核苷類藥物的耐藥及管理是慢性乙型肝炎診治中十分重要的問題。一旦發(fā)生耐藥，導(dǎo)致疾病進(jìn)展（如病毒學(xué)反彈、生化學(xué)突破、肝炎復(fù)燃、肝臟失代償甚至肝衰竭），耐藥患者肝硬化和肝癌發(fā)生率增高，耐藥可使已取得的組織學(xué)改善逆轉(zhuǎn)，耐藥病毒株的傳播可能導(dǎo)致公共衛(wèi)生問題，耐藥突變可導(dǎo)致S基因突變，產(chǎn)生免疫逃逸株，既能感染未接種乙肝疫苗者，也可感染已接種乙肝疫苗者，耐藥使后續(xù)治療方案變得更為復(fù)雜和困難；耐藥將增加長期治療的醫(yī)療成本。近年來，我國、亞太、歐洲和美國肝病學(xué)會(huì)對(duì)慢性乙型肝炎診療指南及共識(shí)不斷地更新[1～6]，指導(dǎo)臨床醫(yī)生進(jìn)行有效的耐藥管理，以期達(dá)到降低疾病進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)、改善預(yù)后、降低治療成本的目的。

拉米夫定應(yīng)用廣泛，但其耐藥率高。對(duì)于初治的慢性乙型肝炎患者，拉米夫定1～5年耐藥率可由14%升至70%[7～9]。拉米夫定耐藥的主要變異位點(diǎn)為HBV聚合酶區(qū)rtM204V/I/S，并可伴有L180M、V173L等位點(diǎn)的代償變異[10，11]。也有報(bào)道拉米夫定耐藥后篩選出對(duì)其它核苷類藥物的耐藥變異[12，13]。針對(duì)拉米夫定耐藥曾一度選擇序貫阿德福韋酯或恩替卡韋挽救治療，但此后發(fā)現(xiàn)序貫治療增加了多重耐藥的發(fā)生[14，15]。本研究發(fā)現(xiàn)在未應(yīng)用阿德福韋酯之前，在拉米夫定耐藥患者中已出現(xiàn)拉米夫定與恩替卡韋的雙重耐藥變異，變異模式為M204V＋L180 M＋S202G、M204V＋T184G＋L180M。給予耐藥患者聯(lián)合阿德福韋酯或換用恩替卡韋聯(lián)合阿德福韋酯治療48周后，2組患者HBV DNA陰轉(zhuǎn)率無顯著性差異。但值得注意的是，在拉米夫定聯(lián)合阿德福韋酯組中，不應(yīng)答的患者出現(xiàn)對(duì)拉米夫定及阿德福韋酯的雙重耐藥，而在恩替卡韋聯(lián)合阿德福韋酯組中，不應(yīng)答的患者出現(xiàn)對(duì)拉米夫定、阿德福韋酯及恩替卡韋的多重耐藥。阿德福韋酯耐藥的主要變異位點(diǎn)為rtA181V/T和rtN236T，而rt181位點(diǎn)突變較rt236多見。

體外實(shí)驗(yàn)表明，rtA181V/T變異對(duì)拉米夫定敏感性下降，對(duì)阿德福韋酯敏感性也顯著下降；rtA181V+rtN236T對(duì)拉米夫定敏感性下降35～43倍，對(duì)阿德福韋酯敏感性下降18倍[16，17]；而單一rtN236T變異對(duì)拉米夫定敏感，對(duì)阿德福韋酯敏感性顯著下降[18]。2009年歐洲肝病學(xué)會(huì)CHB診療指南提示，rtA181耐藥株對(duì)恩替卡韋和替比夫定敏感[19]。韓國學(xué)者Cho et al報(bào)道，對(duì)阿德福韋酯耐藥的慢性乙型肝炎患者存在rtA181V/T突變，應(yīng)用阿德福韋酯聯(lián)合恩替卡韋治療，治療12個(gè)月時(shí)病毒學(xué)應(yīng)答率為95.8%[20]。國內(nèi)也有研究證實(shí)應(yīng)用阿德福韋酯出現(xiàn)rtA181耐藥時(shí)加用或換用恩替卡韋的療效好于加用替比夫定[21]。我們對(duì)初始阿德福韋酯治療發(fā)生耐藥的患者給予聯(lián)合恩替卡韋或聯(lián)合拉米夫定治療，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合恩替卡韋的療效的確優(yōu)于聯(lián)合拉米夫定，未發(fā)現(xiàn)不應(yīng)答的患者出現(xiàn)廣泛的耐藥位點(diǎn)。

目前，在我國慢性乙型肝炎初治的患者中，應(yīng)用核苷類藥物抗病毒治療仍以低效、高耐藥的藥物為主，因可出現(xiàn)不應(yīng)答，被迫挽救治療，聯(lián)合或序貫應(yīng)用多種核苷類藥物，可出現(xiàn)針對(duì)多種藥物的耐藥突變。如何盡可能地避免多重耐藥的發(fā)生，我們認(rèn)為對(duì)服用核苷類藥物出現(xiàn)耐藥的患者，應(yīng)盡可能檢測所有相關(guān)的變異位點(diǎn)，而不應(yīng)局限于已服用藥物的變異位點(diǎn)。根據(jù)檢測結(jié)果調(diào)整治療方案以提高療效。以rtM204變異為主的拉米夫定耐藥，聯(lián)合阿德福韋酯進(jìn)行挽救治療療效確定，如換用恩替卡韋聯(lián)合阿德福韋酯，未能增加療效，且產(chǎn)生更為復(fù)雜而難以處理的耐藥模式。以rtA181變異為主的阿德福韋酯耐藥，聯(lián)合恩替卡韋的療效優(yōu)于聯(lián)合拉米夫定。我們未在阿德福韋酯耐藥聯(lián)合恩替卡韋治療的患者中發(fā)現(xiàn)更廣泛的耐藥位點(diǎn)，是否與觀察時(shí)間不是足夠長（僅48周）有關(guān)，有待在以后的工作中進(jìn)一步觀察。

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（收稿：2013-11-18）

（校對(duì)：陳從新）

Rescued antivira ltherapy of patients with hepatitis B virus rtM204/rtA181 mutants resistant to lamivudine or adefovir

JiaDexing，F(xiàn)engJing，LiPing，etal.DepartmentofInfectiousDiseases，People’s Hospital，Weifang 261041，Shandong Province，China

ObjectiveTo evaluate hepatitis B virus（HBV）mutations and its impact on antiviral effects in chronic hepatitis B（CHB）patients with mutants resistant to lamivudine or adefovir.Methods142 nucleos（t）idenaive CHB patients treated with lamivudine were switched to lamivudine plus adefovir（n=72）or entecavir plus adefovir（n=70）because of lamivudine resistance and 72 nucleos（t）ide-naive CHB patients treated with adefovir were switched to adefovir plus lamivudine（n=36）or adefovir plus entecavir（n=36）after resistance occurred. HBV DNA polymerase reverse transcriptase mutations were analyzed before and after 48 weeks of rescue therapy. ResultsAmong CHB patients with lamivudine resistance，mutation patterns were mainly M204V and IL180M，with a frequency of 98.6%（140/142）and 56.3%（80/142），respectively；Undetectable serum HBV DNA were noted in 86.1%of patients in lamivudine and adefovir treatment group，and 97.1%of patients in entecavir and adefovir treatment group（P＞0.05）；Among CHB patients with adefovir resistance，A181V and N236T mutation rates were 63.9%（46/72）and 52.8%（38/72），respectively；Undetectable serum HBV DNA were found in 52.8%（19/36）of patients in adefovir and lamivudine treatment group，significantly lower than that[77.8%（28/36），x2＝4.963，P＜0.05]of patients in adefovir and entecavir treatment group.ConclusionsAddition of adefovir dipivoxil to lamivudine is effective rescue therapy in patients with rtM204 mutation resistance to lamivudine，but in patients with rtA181 mutation resistance to adefovir dipivoxil，the addition of entecavir is superior to lamivudine.

Hepatitis B；Lamivudine；Adefovir；Drug resistance；Rescue therapy

261041山東省濰坊市人民醫(yī)院感染性疾病科

賈德興，男，52歲，主任醫(yī)師。主要從事感染性疾病診斷與治療學(xué)研究。E-mail:jiadexing@medmail.com.cn

馮靜，E-mail:fengjing201001@aliyun.com

10.3969/j.issn.1672-5069.2014.05.013