藍莓花青素通過下調(diào)p53基因DNA甲基化抑制口腔癌KB細胞增殖及誘導細胞凋亡

陳琦, 李少偉, 賈宇臣, 王利

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學分子生物學研究中心, 呼和浩特 010059

藍莓花青素通過下調(diào)p53基因DNA甲基化抑制口腔癌KB細胞增殖及誘導細胞凋亡

陳琦, 李少偉, 賈宇臣, 王利

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學分子生物學研究中心, 呼和浩特 010059

文章從內(nèi)蒙古野生藍莓(Vaccinium uliginosum Lim)中提取花青素, 觀察其對口腔癌細胞株KB的增殖及凋亡的作用, 探討其作用機制與p53基因甲基化的相關(guān)性。利用含0.1%鹽酸的甲醇提取花青素, 用高效液相色譜-質(zhì)譜(High performance liquid chromatography-mass spectrometry, HPLC-MS )鑒定花青素的成分。利用四甲基偶氮唑藍(Methylthiazolyl-tetrazolium, MTT)比色法、流式細胞術(shù)、免疫熒光法、免疫細胞化學法和Western blot法分析藍莓花青素對 KB細胞增殖、細胞周期、細胞凋亡和 p53蛋白表達的影響; 利用甲基化特異性 PCR法(Methylation-specific PCR, MSP)分析藍莓花青素誘導細胞凋亡與p53基因甲基化的關(guān)系。結(jié)果顯示, 內(nèi)蒙古自治區(qū)的野生藍莓中至少存在14種花青素成分; 藍莓花青素呈劑量依賴的方式抑制KB細胞增殖, 誘導細胞周期阻滯在 G2/M 期, 而且能誘導細胞凋亡; 藍莓花青素處理后 Caspase-9蛋白和細胞色素 C的表達明顯增加; Western blot結(jié)果表明藍莓花青素可以誘導KB細胞中p53蛋白表達上調(diào); MSP結(jié)果表明隨藍莓花青素濃度增加,未甲基化的p53的比例增加, 說明p53的甲基化狀態(tài)有所下調(diào)。

花青素; 抗癌; 藍莓; 口腔癌; DNA甲基化

口腔癌是頭頸部常見的惡性腫瘤, 手術(shù)是目前治療口腔癌的主要手段, 但由于其發(fā)病部位解剖學上的復雜性, 一般通過手術(shù)很難完全地去除腫瘤,術(shù)后容易發(fā)生轉(zhuǎn)移。因此, 發(fā)展一種有效的抗癌劑是臨床上防治口腔癌面臨的重大課題[1]。從天然動植物中尋找可以防治腫瘤的有效成分是目前和今后癌癥研究領(lǐng)域的前沿和熱點。

花青素是一類天然色素, 不但賦予水果、蔬菜以顏色, 對人類健康也有重要的意義[2]。研究表明,花青素具有許多生物活性[3], 如控制肥胖[4]和糖尿病[5]、預防心血管疾病[6]、改善視力[5]和大腦功能[7]等, 特別是在抗腫瘤治療方面具有巨大的潛力[8]。花青素廣泛存在于多種水果和蔬菜中, 其中屬藍莓(Vaccinium uliginosum Lim)中的花青素含量最高9]。

研究發(fā)現(xiàn), 花青素可以抑制多種腫瘤細胞生長,包括胃癌[10]、乳腺癌[11]、肺癌[12]、結(jié)腸癌[13]等, 但國內(nèi)對內(nèi)蒙古自治區(qū)野生藍莓的研究主要集中在藍莓加工、提取花青素及檢測方法方面, 對其生物活性的研究還很少, 藍莓花青素發(fā)揮抗口腔癌作用的分子機制也尚未明確。因此, 為了研究藍莓花青素對人口腔癌 KB細胞的生長抑制作用及細胞凋亡的誘導效應, 本研究從內(nèi)蒙古自治區(qū)野生藍莓中提取花青素, 用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(High performance liquid chromatography-mass spectrometry, HPLCMS)技術(shù)鑒定其成分, 利用不同濃度的藍莓花青素處理口腔癌 KB細胞, 用四甲基偶氮唑藍(Methylthiazolyl-tetrazolium, MTT)比色法、流式細胞術(shù)、免疫細胞化學法和甲基化特異性 PCR(Methylationspecific PCR)法分析藍莓花青素對KB細胞增殖、細胞周期和細胞凋亡的影響, 并從表觀遺傳學角度探索其誘導細胞凋亡的機制。

1 材料和方法

1.1 材料

人口腔癌 KB細胞為內(nèi)蒙古醫(yī)科大學分子生物學研究中心保存; 內(nèi)蒙古自治區(qū)呼倫貝爾根河市野生藍莓, 品系為杜鵑花科越橘屬矮叢藍莓, 液氮速凍-80℃保存。

1.2 方法

1.2.1 藍莓花青素的提取及鑒定

藍莓花青素的提取純化方法參照文獻[14], 并略作修改。具體方法如下：藍莓從液氮中取出, 稱重后研磨, 利用含有 0.1% HCl 的甲醇作為提取溶劑, 按照藍莓與提取溶劑 1:4 的比例, 將研磨后的藍莓溶于提取溶劑中2 h。將混合物4000 r/min離心15 min, 0.25 μm濾器進行過濾, 然后通過40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除殘留的甲醇和鹽酸。利用大孔樹脂 AB-8對粗提物進行純化, 純化后的花青素利用HPLC-MS鑒定, 通過與質(zhì)譜庫中的數(shù)據(jù)進行比較, 分析藍莓花青素的成分。

1.2.2 細胞增殖分析

取對數(shù)生長期的 KB細胞經(jīng)過胰酶消化, 以2.5×105/mL的密度接種于96孔板, 培養(yǎng)24 h后, 棄原培養(yǎng)液, 加入終濃度分別為 50、100、150、200 μg/mL的200 μL藍莓花青素混勻, 每個濃度設(shè)6個復孔, 正常組不加藍莓花青素。24 h后每孔加 5 mg/mL MTT溶液20 μL, 4 h后棄去培養(yǎng)液, 每孔加DMSO 150 μL, 置于脫色搖床上振蕩10 min, 利用酶標儀在吸光度570 nm檢測, 實驗重復3次。根據(jù)下面公式計算細胞抑制率：

1.2.3 細胞周期分析

用濃度分別為0、50、100、150、200 μg/mL的藍莓花青素處理KB細胞24 h后, 用胰酶消化細胞, 70%乙醇進行固定。然后加入含有 5 μg/mL碘化丙啶(PI)和1 mg/mL RNase的PBS重懸細胞。利用流式細胞儀(Becton)進行細胞周期分析。

1.2.4 細胞凋亡分析

(1)流式細胞術(shù)PI染色法檢測細胞凋亡：操作同1.2.3。

(2)Annexin V/PI熒光染色法檢測細胞凋亡：調(diào)整KB細胞密度為1×105/mL接種于6孔板, 24 h后分別加入50、100、150、200 μg/mL含花青素的培養(yǎng)基, 設(shè)正常對照組。24 h后去除培養(yǎng)液, PBS洗滌2次, 各組加入195 μL結(jié)合液(binding buffer), 然后加入5 μL Annexin V染液, 吸去液體后加入190 μL結(jié)合液, 然后加入5 μL PI染液, 在倒置熒光顯徽鏡下觀察細胞凋亡情況, Annexin V 對磷脂酰絲氨酸高度的親和性可以檢測細胞的早期凋亡, PI僅能透過胞膜受損的細胞, 嵌入核DNA, 發(fā)橘紅色熒光。

1.2.5 免疫細胞化學法檢 測 Caspase-9 和Cytochrome-C的表達

用滅菌的蓋玻片吸附于6孔板中, 調(diào)整KB細胞密度為1×105/mL, 接種于6孔板, 24 h后分別加入50、100、150、200 μg/mL含花青素的培養(yǎng)基, 設(shè)正常和陰性對照組。24 h后吸去培養(yǎng)液, 取出蓋玻片, PBS清洗3次, 每次1 min。丙酮固定 20 min, 干燥5 min。過氧化酶阻斷劑37℃ 30 min, PBS清洗后37℃與一抗(1∶500)和二抗(1∶500)各孵育 60 min和30 min。DAB避光顯色5 min, 蘇木精復染1 min,鹽酸分化液分化 2 s, 經(jīng)梯度脫水, 樹膠封片, 風干后用圖像采集系統(tǒng)觀察 Caspase-9和 Cytochrome-C的表達情況。

1.2.6 Western blot檢測p53蛋白的表達

從KB細胞中提取總蛋白, Bradford法對蛋白進行定量, 調(diào)節(jié)上樣量均為20 μg。用10% 的SDS-聚丙烯酰胺凝膠120 V恒壓電泳2 h后, 將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。麗春紅染色后, 5%脫脂奶粉封閉2 h。一抗孵育 p53以 1∶500稀釋, β-actin以 1∶2000稀釋。

1.2.7 甲基化特異性PCR

(1)引物設(shè)計合成

根據(jù) p53基因序列信息, 利用 Methyl Primer Express Software v1.0.設(shè)計兩對引物, 一對為甲基化引物(M), 另一對為非甲基化引物(U), 引物信息見表1。

(2) DNA亞硫酸氫鹽修飾

利用DNA提取試劑盒(Qiagen公司)從藍莓花青素處理的KB細胞中提取DNA。配置3 mol/L NaOH、飽和亞硫酸氫鈉(40.5%)和10 mmol/L 氫醌。取適量待測樣品DNA(100 ng～1 μg), 用3 mol/L NaOH和ddH2O調(diào)整至終體積20 μL, NaOH終濃度0.3 mol/L。42℃孵育20 min, 95℃ 5 min, 置于冰上; 加入208 μL 飽和 NaHSO3和 12 μL 10 mmol/L 氫醌, 用NaOH調(diào)節(jié)pH至5.0; 55℃孵育12～16 h; 通過脫鹽柱進行脫鹽純化, 最終洗脫體積50 μL; 加入5.5 μL 3 mol/L NaOH, 37℃孵育15 min; 乙醇沉淀修飾后DNA; 4000 r/min離心15 min, 用70%乙醇洗滌一次;加入30 μL水重懸DNA, 得到修飾后DNA。

(3) PCR擴增

以修飾后的DNA為模板, 用表1中所示的甲基化引物和非甲基化引物分別對甲基化和非甲基化的p53基因進行擴增。PCR擴增體系：修飾后DNA模板 1 μL, MSP引物(5 mmol/L)各 0.6 μL, 2.5×PCR Buffer 4 μL, Taq酶0.1 μL, ddH2O補至10 μL。擴增條件：95℃ 5min; 95℃ 30s, 63℃ 30s, 72℃ 20s,共35個循環(huán); 最后再72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠進行電泳, 按每個樣本甲基化引物和非甲基化引物的順序檢測。

表1 p53基因的甲基化特異性PCR引物

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC-MS鑒定藍莓花青素

利用HPLC-MS 對提取的藍莓花青素進行鑒定,結(jié)果表明, 內(nèi)蒙古自治區(qū)野生藍莓中至少含有14種花青素, 包括矢車菊素-單糖、矢車菊素、錦葵色素-單糖、飛燕草素、矮牽牛素、芍藥色素、錦葵色素、芍藥色素-單糖、飛燕草素-單糖、矮牽牛素-單糖、天竺葵素-3-槐糖 (推測)、天竺葵素-3-葡萄糖 (推測)、天竺葵素-3-葡萄糖 (推測)、天竺葵素-鼠李糖(推測)。

2.2 藍莓花青素對KB細胞增殖的作用

MTT結(jié)果表明, 50 μg/mL、100 μg/mL、150 μg/mL和200 μg/mL的藍莓花青素對KB細胞的增殖均有抑制作用, 且基本呈劑量依賴性(圖1)。

圖1 不同濃度藍莓花青素對KB細胞增殖率的影響

2.3 藍莓花青素對KB細胞周期的作用

通過流式細胞儀檢測細胞周期中G1、G2/M和S期的分布。結(jié)果表明藍莓花青素處理KB細胞后, G1期細胞明顯減少, G2/M期細胞增多, S期細胞相對穩(wěn)定。說明藍莓花青素可以使 KB細胞周期阻滯在G2/M期(圖2)。

圖2 不同濃度藍莓花青素對KB細胞周期的影響

2.4 細胞凋亡結(jié)果

2.4.1 流式PI法檢測結(jié)果

圖3 流式PI法檢測藍莓花青素誘導KB細胞的凋亡M1下的亞二倍體峰即為凋亡峰。

用流式細胞儀PI法檢測不同濃度的藍莓花青素處理KB細胞24 h的凋亡百分率。由圖3可以看出,隨著藍莓花青素濃度增大, 凋亡峰增高。凋亡百分率分別為9.73%、25.59%、25.98%、32.56%。

2.4.2 Annexin V/PI熒光染色檢測結(jié)果

從圖4可以看出, PI染色正?；罴毎陌顺始t色, 彌散狀; 早期凋亡細胞的胞核濃縮, 染色加深; 晚期凋亡細胞的胞核碎裂成大小不等的原形小體, 即凋亡小體。在正常細胞中, 磷脂酰絲氨酸只分布在細胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè), 細胞發(fā)生凋亡早期,膜磷脂酰絲氨酸(PS)由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。Annexin V作為一種磷脂結(jié)合蛋白, 與磷脂酰絲氨酸有高度親和力, 它通過細胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結(jié)合凋亡。細胞若發(fā)生早期凋亡,經(jīng) Annexin V染色后呈現(xiàn)綠色熒光, 正常的細胞基本沒有熒光信號, 藍莓花青素的處理濃度增加, 早期凋亡細胞有所減少, 但熒光強度無明顯變化。因此, 藍莓花青素誘導細胞發(fā)生晚期凋亡的比例上升。

2.5 免疫細胞化學結(jié)果

KB細胞用不同濃度的花青素處理后呈現(xiàn)不同的生長狀態(tài)和細胞表達形態(tài), 免疫細胞化學結(jié)果用圖像采集系統(tǒng)觀察, 如圖 5所示。藍莓花青素處理細胞24 h后, 正常組KB細胞中Caspase-9和Cytochrome-C無表達; 隨著藍莓花青素濃度增加, KB細胞形態(tài)有明顯改變, 細胞出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落, 核固縮的情況, Caspase-9和Cytochrome-C在凋亡的細胞中表達逐漸增強。

圖4 Annexin V/PI法檢測藍莓花青素誘導KB細胞的凋亡A：PI染色; B：Annexin V染色。1：未加藍莓花青素的對照組; 2～5：分別為藍莓花青素濃度50、100、150、200 μg/mL實驗組。KB細胞經(jīng)花青素處理后晚期凋亡比例上升, 早期凋亡不明顯。

圖5 藍莓花青素處理對KB細胞Caspase-9和Cytochrome-C免疫細胞組織化學結(jié)果A：Caspase-9; B：Cytochrome-C。1：未加藍莓花青素的對照組; 2～5：分別為藍莓花青素濃度50、100、150、200 μg/mL實驗組。

2.6 Western blot結(jié)果

利用Western blot對正常對照組和50、100、150、200 μg/mL藍莓花青素處理組的KB細胞中的p53蛋白表達進行檢測。結(jié)果表明(圖 6), 正常對照組 p53蛋白沒有表達, 經(jīng)過藍莓花青素處理后, p53蛋白開始表達, 并且藍莓花青素濃度在150、200 μg/mL時, p53表達水平比藍莓花青素濃度50和100 μg/mL時增強。

圖6 不同濃度藍莓花青素處理KB細胞p53蛋白的表達情況1：未加藍莓花青素的對照組; 2～5：分別為藍莓花青素濃度50、100、150、200 μg/mL實驗組。

2.7 甲基化特異性PCR結(jié)果

正常對照組和 50、100、150、200 μg/mL藍莓花青素處理組的KB細胞p53基因啟動子區(qū)的MSP結(jié)果表明, 正常組甲基化和非甲基化的 p53基因都表達, 實驗組隨著藍莓花青素濃度的增加, 非甲基化的 p53表達增加, 當藍莓花青素的濃度達到 200 μg/mL 時, 只有非甲基化的p53表達(圖7)。

3 討 論

近年來, 從飲食中尋找天然營養(yǎng)素作為癌癥的化學預防劑引起了廣泛的關(guān)注。本研究利用HPLC-MS分析表明, 內(nèi)蒙古自治區(qū)野生藍莓至少含有14種花青素成分。然而, 花青素結(jié)構(gòu)和功能之間的關(guān)系還不是很清楚, 有待于進一步的研究闡明花青素結(jié)構(gòu)與抗癌作用之間的關(guān)系。

目前藍莓花青素誘導口腔癌 KB細胞凋亡的機制尚不明確。p53依賴性細胞凋亡通路主要包括內(nèi)凋亡通路及外凋亡通路兩條主要的信號轉(zhuǎn)導通路,內(nèi)凋亡通路為p53蛋白調(diào)節(jié)Bcl-2家族成員, 引起線粒體釋放Cyt c, 其與Apaf-1及Pro-Caspase 9可形成凋亡小體, 使 Pro-Caspase 9活化為具有活性的Caspase 9, 并通過一系列級聯(lián)反應引起效應器Caspase 3的活化; 而外凋亡通路是指活化的p53蛋白通過招募細胞膜表面的死亡受體, 形成死亡誘導信號復合體, 活化 Pro-Caspase 8形成具有活性的Caspase 8, 再活化Caspase 3, 最終導致細胞凋亡的發(fā)生[15,16]。目前研究顯示, 許多外源性化合物可通過p53依賴性凋亡通路誘導細胞的凋亡[17]。本研究利用免疫細胞化學法探討藍莓花青素誘導 KB細胞凋亡的機制, Caspase-9與Cytochrome-C表達明顯增多, 呈現(xiàn)一定的劑量依賴性, 說明藍莓花青素誘導KB凋亡的途徑可能通過內(nèi)凋亡通路誘導口腔癌細胞凋亡。

圖7 藍莓花青素處理KB細胞的p53的MSP結(jié)果M和U分別代表甲基化和非甲基化引物擴增的PCR產(chǎn)物。MC和UC分別代表甲基化和非甲基化對照。

表觀遺傳學是指沒有DNA序列改變的、可遺傳的遺傳修飾。遺傳變異是不可逆的, 而表觀遺傳的改變是可逆的[18]。DNA甲基化是研究的最為透徹的一種表觀遺傳學修飾, 可引起多種細胞凋亡通路失活, 并與癌癥的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。在誘導凋亡的各種通路中, p53介導的凋亡通路在維持細胞穩(wěn)定中起重要作用, 而該通路中DNA甲基化可導致該通路失活[19]。通過逆轉(zhuǎn) DNA甲基化激活腫瘤細胞中被抑制的 p53活性被認為是癌癥治療的可行方法之一[20,21]。有研究表明, 黑莓中的花青素對結(jié)腸癌細胞具有去甲基化作用[22]; BrMchR具有誘導A549細胞凋亡的作用, 其作用機制可能與其逆轉(zhuǎn) P53基因超甲基化作用有關(guān)[17]。本研究發(fā)現(xiàn), 用藍莓花青素處理KB細胞后, p53蛋白表達, 而且隨著藍莓花青素濃度增加 p53表達有所增加, 但是其中的機制并不明確, 有研究表明p53的DNA甲基化可以導致誘導凋亡的細胞通路失活[23,19], 因此本文從表觀遺傳學角度探討藍莓花青素誘導 KB細胞凋亡的機制是否與激活 KB細胞中被抑制的 p53活性有關(guān), 利用MSP分析藍莓花青素處理KB細胞后p53基因的甲基化情況的變化, 結(jié)果顯示 p53基因的甲基化情況隨著藍莓花青素濃度的增加而降低, 說明藍莓花青素能夠逆轉(zhuǎn) p53基因高甲基化狀態(tài), 使其發(fā)生去甲基化, 從而恢復p53基因的表達。因此, 藍莓花青素可能會成為一種很有潛力的去甲基化生物制劑, 但是還需要進行深入的研究來闡明其詳細機制。

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(責任編委: 朱衛(wèi)國)

Blueberry anthocyanins induce G2/M cell cycle arrest and apoptosis of oral cancer KB cells through down-regulation methylation of p53

Qi Chen , Shaowei Li, Yuchen Jia, Li Wang

Research Center of Molecular Biology, Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010059, China

Blueberries are an excellent source of dietary polyphenols such as anthocyanins and phenolic acids. In this study, we investigated the ability of anthocyanins from the wild blueberries of Inner Mongolia to suppress the growth of the oral cancer cell line KB. The blueberry anthocyanins were extracted with methanol-containing 0.1% (v/v) hydrochloric acid. Fourteen unique anthocyanins were identified using high-performance liquid chromatography-mass spectrometry (HPLC-MS). The anticancer bioactivity of the extracts on KB cells was analyzed using methylthiazolyl-tetrazolium (MTT), flow cytometry (FCM) and immunocytochemistry. It was shown that the blueberry anthocyanins suppressed the proliferation of KB cells in a dose-dependent manner, as well as induced G2/M cell cycle arrest and apoptosis of oral cancer KB cells.Immunocytochemistry analysis showed that the expression of caspase-9 and cytochrome c were obviously increased after the anthocyanins treatment. Western blot analysis also indicated that the expression of p53 was increased. Methylation-specific PCR (MSP) showed that the amount of unmethylated p53 increased, indicating that the anthocyanins can down-regulate the methylation of p53.

anthocyanins; anticancer; blueberry; oral cancer; DNA methylation

2013-09-26;

2014-03-20

國家自然科學基金項目(編號：81341139)和內(nèi)蒙古自然科學基金項目(編號：2013MS11100)資助

陳琦, 博士, 副研究員, 研究方向：天然產(chǎn)物抗腫瘤研究及表觀遺傳學。E-mail: yongqi-1@163.com

王利, 碩士, 講師, 研究方向：分子生物學。E-mail: wangliwork@163.com

10.3724/SP.J.1005.2014.0566

時間: 2014-4-24 8:59:46

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20140424.0900.002.html