玉米鉬輔助因子硫酸化酶基因啟動子的克隆與功能驗(yàn)證

高學(xué)煥, 付鳳玲, 牟巍, 周樹峰, 張素芝, 李晚忱

四川農(nóng)業(yè)大學(xué)玉米研究所, 成都 611130

玉米鉬輔助因子硫酸化酶基因啟動子的克隆與功能驗(yàn)證

高學(xué)煥, 付鳳玲, 牟巍, 周樹峰, 張素芝, 李晚忱

四川農(nóng)業(yè)大學(xué)玉米研究所, 成都 611130

為克服組成型啟動子啟動外源基因過量表達(dá)引起的諸多問題，同源克隆(Mo-molybdopterin cofactor sulfurase)基因（ABA3）的啟動子(ABA3s)序列，并用PlantCARE軟件分析其非生物逆境應(yīng)答元件, 實(shí)時(shí)定量PCR檢測ABA3基因在非生物逆境誘導(dǎo)下的差異表達(dá)后。然后，用該啟動子構(gòu)建啟動GUS（β-glucuronidase）基因的表達(dá)載體, 基因槍法轉(zhuǎn)化玉米愈傷組織。經(jīng)組織化學(xué)染色法檢測其表達(dá)后, 在高滲、高鹽、低溫脅迫處理及ABA誘導(dǎo)下檢測GUS酶熒光值與熒光素酶(內(nèi)參)發(fā)光值的比值(GUS/LUC), 以此評價(jià)ABA3s啟動子在非生物逆境脅迫下的啟動活性。結(jié)果表明, ABA3基因在模擬干旱、低溫、高溫、高鹽脅迫及ABA、乙稀誘導(dǎo)下差異表達(dá), 說明該基因的啟動子(ABA3s)具有非生物逆境誘導(dǎo)活性。序列分析表明, ABA3s啟動子全長777 bp, 含有ARE、HSE、MBS、TGA、Circadian等多種非生物逆境脅迫應(yīng)答元件。用ABA3s啟動GUS基因構(gòu)建的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的玉米愈傷組織, 響應(yīng)干旱、低溫、高溫、高鹽脅迫等多種非生物逆境脅迫, 及ABA和乙稀誘導(dǎo), GUS檢測呈陽性。在8%甘露醇高滲條件下, GUS/LUC比值比空白對照高6倍。上述結(jié)果表明, ABA3s啟動子具有非生物逆境誘導(dǎo)特性, 經(jīng)進(jìn)一步驗(yàn)證其功能后, 可用于玉米抗逆轉(zhuǎn)基因研究。

玉米; 非生物脅迫; 鉬輔助因子硫酸化酶; 啟動子

干旱等非生物逆境是玉米(Zea mays)生產(chǎn)的主要限制因素[1]。增強(qiáng)玉米品種的耐旱性是克服干旱危害最為經(jīng)濟(jì)有效的方法。但是, 玉米是一個(gè)耐旱性較差的物種, 特別是拔節(jié)期遇干旱脅迫, 常引起雌雄花期不遇, 造成嚴(yán)重減產(chǎn)。雖然不同遺傳型間也存在耐旱性的差異, 但不足以滿足生產(chǎn)上對品種耐旱性的要求, 而且遺傳性質(zhì)非常復(fù)雜[2～5]。通過轉(zhuǎn)基因操作轉(zhuǎn)化利用外源耐旱基因, 是克服這一困難最有希望的途徑[6～8]。但是, 在以往的研究中, 大多采用ubiquitin、CaMV35S、actin等組成型啟動子啟動耐旱基因的過量表達(dá)。在提高耐旱性的同時(shí), 轉(zhuǎn)基因株系的生長發(fā)育受到不同程度的抑制, 在非脅迫條件下難以發(fā)揮其豐產(chǎn)性能。如果選擇適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)型啟動子, 只在干旱脅迫條件下啟動外源耐旱基因表達(dá), 就可以降低外源耐旱基因過量表達(dá)給玉米帶來的適應(yīng)性代價(jià), 保證非脅迫條件下豐產(chǎn)性能的發(fā)揮[8,9]。Kasuga等[9]利用組成型啟動子 CaMV35S啟動DREB(Dehydration responsive element binding protein)基因轉(zhuǎn)化擬南芥(Arabidopsis thaliana), 在改良抗逆性的同時(shí), 引起植株矮化、生長畸形、籽粒減少等不良表現(xiàn)。改用誘導(dǎo)型啟動子rd29A以后, 就避免了外源基因過量表達(dá)所帶來的不良后果。再者,外源啟動子在受體植物中對外源基因的啟動效能可能不及內(nèi)源啟動子。例如, Yamaguchi-Shinozaki等[10]和Ono等[11]用水稻(Oryza sativa)非生物逆境誘導(dǎo)啟動子 rab16A啟動 GUS基因轉(zhuǎn)化煙草(Nicotiana tabacum)和水稻, 在水稻中檢測到的 GUS活性明顯高于煙草。Rai等[12]對水稻的研究也證明, 有些可在非生物逆境誘導(dǎo)下啟動內(nèi)源基因表達(dá)的啟動子, 并不能在轉(zhuǎn)基因植物中啟動外源抗逆基因表達(dá)。因此,在利用外源基因轉(zhuǎn)化培育耐旱轉(zhuǎn)基因玉米的研究中,除對耐旱外源基因本身的功能選擇外, 還應(yīng)注重選擇適當(dāng)?shù)膬?nèi)源誘導(dǎo)型啟動子, 既可在干旱脅迫條件下啟動外源耐旱基因的表達(dá), 提高玉米的耐旱性,又可在非脅迫條件下避免外源基因過量表達(dá)而引起的不良表現(xiàn)。然而, 因?yàn)橛衩坠δ芑蚪M研究比擬南芥和水稻等模式植物滯后, 關(guān)于玉米本身的非生物逆境誘導(dǎo)啟動子克隆及功能驗(yàn)證鮮有報(bào)道。Buchanan等[13]克隆玉米 LEA(Late embryogenesis abundant)家族基因rab17(Aesponsive to abscisic acid 17)的啟動子, 證實(shí)其可在外源脫落酸誘導(dǎo)下啟動下游基因的表達(dá)。Cao等[14]從玉米中克隆具有脫落酸應(yīng)答順式作用元件ABRE(ABA response element)的轉(zhuǎn)錄因子基因 Vp1(Viviparous 1)的啟動子, 構(gòu)建瞬時(shí)表達(dá)載體, 基因槍法轉(zhuǎn)化玉米營養(yǎng)組織韌皮部,證明可在干旱脅迫下啟動 GUS和GFP(Green fluorescent protein)基因的表達(dá)。Wu等[15]克隆玉米磷脂酰乙醇胺 N-甲基轉(zhuǎn)移酶基因 ZmPEAMT(Phosphoethanolamine N-methyltransferase gene), 發(fā)現(xiàn)其啟動子區(qū)域包含高鹽和高溫應(yīng)答元件, 可在非生物逆境脅迫啟動下游基因表達(dá)。

本研究以擬南芥鉬輔助因子硫酸化酶蛋白ABA3(Mo-molybdopterin cofactor sulfurase protein)的氨基酸序列為探針, 查找玉米基因組同源序列ABA3, 根據(jù)玉米ABA3基因序列用定量PCR引物設(shè)計(jì)軟件Beacon Designer 7.0設(shè)計(jì)引物, 將玉米自交系“178”二葉期幼苗水培至四葉期, 分別用模擬干旱、高鹽、高溫、低溫脅迫處理以及脫落酸(Abscisicacid, ABA)、乙烯誘導(dǎo), 經(jīng)實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證ABA3基因在非生物逆境脅迫下的差異表達(dá)后, 用PlantCARE軟件分析并同源克隆其上游啟動子序列ABA3s, 構(gòu)建ABA3s啟動GUS基因的表達(dá)載體, 用基因槍法轉(zhuǎn)化玉米胚性愈傷組織, 經(jīng)GUS染色檢測其是否啟動表達(dá)后, 在高滲、高鹽、低溫處理及ABA誘導(dǎo)下, 檢測GUS酶熒光值與熒光素酶發(fā)光值的比值(GUS/LUC), 以此評價(jià) ABA3s啟動子在非生物逆境脅迫下的啟動活性, 以期為玉米抗逆轉(zhuǎn)基因玉米研究提供更多的選擇。

1 材料和方法

1.1 玉米ABA3基因在非生物脅迫條件下的差異表達(dá)

以擬南芥ABA3 (ABA DEFICIENT 3)蛋白質(zhì)的氨基酸序列(NP_564001)為探針[16], 用 NCBI(http: //www.ncbi.nlm.nih.gov)網(wǎng)站的在線軟件tblastn搜索同源蛋白質(zhì)的 mRNA序列, 與玉米“B73”基因組序列比對(BLAST), 查找同源序列。

取玉米自交系“178”種子, 用10% NaClO消毒后, 在蛭石：珍珠巖(3∶1)基質(zhì)中發(fā)芽至二葉期, 轉(zhuǎn)移至改良的Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng)至四葉期[17], 分別用 16%聚乙二醇-6000(Polyethylene glycol-6000, PEG-6000)模擬干旱[18]和高鹽(200 mmol/L NaCl)處理 72 h, 低溫(4℃)和高溫(42℃)處理 24 h, 以及ABA(100 μmol/L)和乙烯(100 μmol/L乙烯利)誘導(dǎo)24 h, 3次重復(fù)。在模擬干旱、高鹽處理的0、12、24、48、72 h和ABA、乙烯、低溫、高溫處理的0、2、6、12、24 h取樣, 用Trizol試劑盒(TaKaRa, 日本)提取總 RNA, 再用 PrimeScriptTM試劑盒(TaKaRa,日本)反轉(zhuǎn)錄成 cDNA, 稀釋 5倍后作為實(shí)時(shí)定量PCR(Real-time quantitative PCR, qRT-PCR)的模板。

用定量 PCR引物設(shè)計(jì)軟件 Beacon Designer 7.0(http: //www.premierbiosoft.com)設(shè)計(jì)引物(5′-TGAAGCGTCTGAATGGTT-3′; 5′-GAAGCAATCGGTGAACAT-3′), 由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。以玉米18S基因作內(nèi)參, 10 μL反應(yīng)體系包括：SsoFast EvaGreen supermix(Bio-Rad, 美國)5.0 μL、上下游引物(10.0 μmol/L)各0.5 μL和稀釋的cDNA 1.0 μL。在CFX96定量PCR儀(Bio-Rad, 美國)上, 溫度循環(huán)為：98℃預(yù)變性2 min; 98℃變性2 s, 50℃～65℃復(fù)性10 s, 循環(huán)44次。然后, 以每步0.01 s、 0.5℃的梯度升高至95℃, 繪制熔解曲線。采用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法對 ABA3基因的表達(dá)水平進(jìn)行相對定量測定, 計(jì)算不同處理時(shí)間ABA3基因表達(dá)量相對于0 h對照的倍數(shù)。

1.2 玉米 ABA3s啟動子序列生物信息學(xué)預(yù)測與同源克隆

用植物啟動子序列分析軟件 PlantCARE(http: //bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare), 查找分析ABA3基因編碼序列上游1.5 kb區(qū)域內(nèi)CAAT框和 TATA框等啟動子序列特征, 確定轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。據(jù)此設(shè)計(jì)特異PCR引物(5′-AAGCTT TGGATGGCTGATGGAGTCTCTTGT-3′); 5′-GGATCC GGGCGGTGGCGGCATTTAGTA-3′), 并在其 5′端引入構(gòu)建載體所需的限制性酶 HindⅢ/BamHⅠ識別位點(diǎn)(下劃線), 以玉米自交系“B73”基因組DNA為模板, 用高保真DNA聚合酶PrimeSTAR HS DNA Polymerase(TaKaRa, 日本)擴(kuò)增 ABA3s啟動子序列, 經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后, 回收純化 777 bp的目的片段,用HindⅢ/BamHⅠ雙酶切后再次分離、回收和純化。

1.3 ABA3s啟動GUS基因表達(dá)載體的構(gòu)建

用 HindⅢ/BamHⅠ雙酶切植物表達(dá)載體pBI221-UbiGUS, 分離、回收和純化后加入上一步驟回收純化的ABA3s啟動子片段, 用T4 DNA 連接酶(TaKaRa, 日本)連接, 構(gòu)建ABA3s啟動GUS基因的表達(dá)載體(圖 1), 用 42℃熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α菌株(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)的感受態(tài)細(xì)胞, 在加有氨芐青霉素(Biobasic Inc., 加拿大)的抗性培養(yǎng)基上篩選陽性重組子, 經(jīng)菌液 PCR和擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒, 并用HindⅢ/BamHⅠ雙酶切進(jìn)行檢測, 由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

1.4 玉米愈傷組織的基因槍法轉(zhuǎn)化

參照Fu等[19]報(bào)道的方法, 在授粉后12 d左右,取玉米自交系齊“319”長1.5～2.0 mm的幼胚, 接種于改良的 N6誘導(dǎo)培養(yǎng)基[N6鹽+蔗糖 3%+瓊脂0.7%+2,4-D 2 mg/L+L-脯氨酸1.38 g/L+水解酪蛋白500 mg/L+烯效唑(S3307)0.25 mg/L, pH 5.8～6.0], 27℃黑暗培養(yǎng), 誘導(dǎo)愈傷組織的發(fā)生。按照 Armstrong和 Green[20]提出的標(biāo)準(zhǔn), 挑選胚性愈傷組織,轉(zhuǎn)接于改良的N6繼代培養(yǎng)基(N6鹽+蔗糖3%+瓊脂0.7+2,4-D 1 mg/L+L-脯氨酸 0.69 g/L+水解酪蛋白100 mg/L+甘露醇20 g/L, pH5.8～6.0), 27℃暗培養(yǎng)增殖。

圖1 玉米ABA3s啟動子啟動GUS基因的表達(dá)載體pBI221-ABA3sGUS

取濃度為 1 μg/μL的 ABA3s誘導(dǎo)表達(dá)載體pBI221-ABA3sGUS和組成型啟動子ubiquitin啟動熒光素酶基因LUC(Luciferase)的表達(dá)載體pUbiLUS(內(nèi)參對照)質(zhì)粒DNA各2.25 μL和0.75 μL, 加20 μL亞精胺(0.5 mol/L)和50 μL CaCl2(2.5 mol/L)沉淀到3 mg用乙醇和無菌蒸餾水反復(fù)洗滌的金粉(60 mg/mL,金粉·甘油)上, 渦旋震蕩并用70%乙醇(HPLC級)洗滌后, 加入60 μL無水乙醇, 渦旋震蕩并超聲波處理使金粉分散懸浮。在DuPont PDS1000/He型基因槍(Bio-Rad, 美國)上, 以1100 psi系統(tǒng)壓力和28英寸汞柱真空度, 每槍1.0 μg/mg(質(zhì)粒/金粉), 轉(zhuǎn)化在N6高滲培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng) 4 h的玉米胚性愈傷各 10皿,每皿100塊愈傷。

1.5 ABA3s啟動GUS基因瞬時(shí)表達(dá)的定量檢測

將轉(zhuǎn)化后的愈傷組織轉(zhuǎn)移到繼代 N6培養(yǎng)基上, 27℃黑暗培養(yǎng) 2 d后, 選大小、形狀基本一致的ABA3s誘導(dǎo)表達(dá)載體pBI221-ABA3sGUS和內(nèi)參對照質(zhì)粒pUbiLUC轉(zhuǎn)化的愈傷各分為15皿, 每皿50塊愈傷, 分別實(shí)施 8%甘露醇模擬高滲處理、200 mmol/L NaCl高鹽處理、100 μmol/L ABA誘導(dǎo)和4℃低溫處理24 h, 以及空白對照各3皿(生物學(xué)重復(fù))。每皿取5塊愈傷, 用Jefferson等[21]介紹的方法染色,在解剖顯微鏡下觀察照像。其余愈傷轉(zhuǎn)?70℃預(yù)冷研缽, 加熒光素酶檢測系統(tǒng)稀釋成1×細(xì)胞裂解液1700 μL研磨成勻漿, 轉(zhuǎn)入2 mL離心管中, 12 000 r/min離心10 min。各取100 μL上清液, 轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管, 加100 μL預(yù)熱至37℃的GUS反應(yīng)緩沖液, 混勻后立即吸取100 μL加到1900 μL反應(yīng)終止液中, 在Fluoroskan Ascent FL型熒光/化學(xué)發(fā)光微孔讀數(shù)儀(Thermo Scientific, UK)上用 355 nm激發(fā)光和 460 nm發(fā)射光條件下檢測0 h(對照)的本底熒光值。然后將剩余反應(yīng)液體在37℃反應(yīng)2 h后, 立即加入1900 μL反應(yīng)終止液, 再用同樣方法檢測總熒光值。GUS酶熒光值=總熒光值-本底熒光值。

另取50 μL上述每種處理及空白對照的上清液,轉(zhuǎn)至 96孔板, 加熒光素酶檢測系統(tǒng)(Promega, 北京)LUC反應(yīng)液 100 μL混勻, 立即在 Fluoroskan Ascent FL型熒光/化學(xué)發(fā)光微孔讀數(shù)儀(Thermo Scientific, 美國)上, 檢測延遲12 s的熒光素酶發(fā)光值。參照Koo等[22]介紹的方法, 用GUS酶熒光值與熒光素酶發(fā)光值的比值作為表達(dá)量, 以此評價(jià)啟動子在非生物逆境脅迫條件下的啟動活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米ABA3基因在非生物脅迫條件下差異表達(dá)

qRT-PCR分析表明, ABA3基因的表達(dá)對PEG模擬干旱、低溫、高溫、高鹽脅迫, 以及ABA和乙稀誘導(dǎo)均有響應(yīng)(圖2), 方差分析表明不同脅迫時(shí)間段的表達(dá)量與對照(0 h)之間的差異達(dá)極顯著水平(F模擬干旱= 88.317, P＜0.01; F低溫=66.429, P＜0.01; F高溫=17.048, P＜0.01; F高鹽=143.325, P＜0.01; FABA=84.950, P＜0.01; F乙稀=52.834, P＜0.01)。其中, 在PEG模擬干旱和低溫脅迫下呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá), 在高溫、高鹽脅迫和ABA、乙稀誘導(dǎo)下呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)。由此推測, 玉米ABA3基因的啟動子ABA3s很可能具有非生物逆境啟動活性。

2.2 玉米ABA3s啟動子序列

圖2 玉米ABA3基因在非生物逆境脅迫下的相對表達(dá)量A：16%聚乙二醇-6000模擬干旱處理; B：低溫(4℃)處理; C：高溫(42℃)處理; D：高鹽(200 mmol/L NaCl)處理; E：ABA(100 μmol/L)誘導(dǎo); F：乙烯(100 μmol/L乙烯利)誘導(dǎo)。

以擬南芥 ABA3蛋白質(zhì)氨基酸序列(NP_564001)為探針, 在 NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索到的玉米同源蛋白為鉬輔助因子硫酸化酶(Mo-molybdopterin cofactor sulfurase, NP_001148545), 其mRNA序列的GenBank登錄號為NM_001155073。通過BLAST比對發(fā)現(xiàn)該序列與玉米“B73”基因組AGPv1版本的第二染色體Chr2: 195668928-195674932堿基序列的同源性為98%, 所以在玉米基因組 AGPv1版本上定位為：Chr2: 195668928: 195674932。在其編碼序列上游1.5 kb以內(nèi), 除-75 bp的CAAT框和-30 bp的TATA框以外, PlantCARE分析還發(fā)現(xiàn)對厭氧、熱激、干旱等非生物脅迫條件的應(yīng)答元件, 以及生長素、生理節(jié)律調(diào)控應(yīng)答元件和抗逆相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子 MYB的結(jié)合位點(diǎn)(表 1)。根據(jù)生物信息學(xué)分析結(jié)果設(shè)計(jì)的特異PCR引物, 以玉米自交系“B73”基因組DNA為模板,擴(kuò)增到的片段約長 780 bp, 測序結(jié)果為 777 bp(圖3)。與玉米基因組序列比對發(fā)現(xiàn), ABA3基因的上游800 bp即是另一個(gè)基因(EU947057.1)的3′端。由此可知, 擴(kuò)增所得777 bp即是ABA3s啟動子的全長序列。

2.3 ABA3s啟動GUS基因在脅迫條件下瞬時(shí)表達(dá)

將上述擴(kuò)增所得777 bp DNA連接pBI221載體片段, 構(gòu)建成 ABA3s啟動 GUS基因的表達(dá)載體pBI221-ABA3sGUS, 經(jīng)酶切鑒定和序列測定正確后,用以轉(zhuǎn)化玉米愈傷組織。在100 μmol/L ABA誘導(dǎo)、8%甘露醇模擬高滲處理、4℃低溫處理和 200 mmol/L NaCl高鹽脅迫條件下, GUS染色均可顯現(xiàn)靛藍(lán)色斑點(diǎn), 而空白對照沒有顯現(xiàn), 說明 ABA3s啟動子確有非生物逆境誘導(dǎo)啟動功能(圖4)。

為克服基因槍散彈轉(zhuǎn)化的隨機(jī)性, 參照Koo等[22]介紹的方法, 將pBI221-ABA3sGUS和pUbiLUS質(zhì)?；旌限D(zhuǎn)化的愈傷組織經(jīng)脅迫處理及GUS反應(yīng)后, 檢測 GUS酶熒光值(GUS), 再除以熒光素酶發(fā)光值(LUC), 消除轉(zhuǎn)化率差異的影響, 用 GUS/LUC比值評價(jià)ABA3s啟動子受非生物逆境誘導(dǎo)啟動基因表達(dá)的相對活性。結(jié)果表明, 在8%甘露醇模擬高滲條件下 ABA3s的啟動活性最高, GUS/LUC比值達(dá) 6.04,比空白對照高 6倍。方差分析的 F＝209.429, P＜0.015, 但多重比較表明, 在200 mmol/L NaCl、100 μmol/L ABA誘導(dǎo)和4℃低溫處理下, ABA3s的啟動活性與空白對照無顯著差異(圖5)。

表1 玉米ABA3s啟動子的非生物逆境脅迫應(yīng)答元件

圖3 玉米ABA3s啟動子序列及非生物逆境脅迫應(yīng)答元件用陰影顯示的堿基與模式植物的同源序列相比有突變, 但通過PlantCARE軟件分析并不影響元件。

圖4 pBI221-ABA3sGUS轉(zhuǎn)化玉米愈傷組織GUS的染色a：100 μmol/L ABA; b：8%甘露醇; c：4℃; d：200 mmol/L NaCl; e：空白對照。

圖5 ABA3s啟動下GUS基因在非生物脅迫條件下瞬時(shí)表達(dá)

3 討 論

用 PlantCRAE分析啟動子序列, 顯示玉米ABA3s啟動子中含有 ARE、HSE、MBS、TGA和Circadian非生物逆境脅迫應(yīng)答元件(表 1)。其中, ARE是ABA應(yīng)答的核心元件。ABA3s啟動的內(nèi)源ABA3基因, 在高溫、高鹽脅迫和ABA、乙稀誘導(dǎo)下呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)(圖2)。先前的研究也表明, ABA可誘導(dǎo)多種抗逆相關(guān)基因的表達(dá), 在植物非生物脅迫應(yīng)答中起重要作用[23～26]。HSE和 MBS元件與植物對高溫、高鹽等多種非生物脅迫的應(yīng)答有關(guān)[27,28], 可能是高溫、高鹽脅迫下ABA3s啟動內(nèi)源ABA3基因上調(diào)表達(dá)的原因之一(圖2)。

本研究對玉米 ABA3s啟動子序列分析(表 1),ABA3基因在PEG模擬干旱、低溫、高溫、高鹽脅迫和 ABA、乙稀誘導(dǎo)下的差異表達(dá)(圖 2), 以及ABA3s啟動GUS基因轉(zhuǎn)化玉米愈傷組織在脅迫條件下的瞬時(shí)表達(dá)(圖 4, 圖 5)這幾個(gè)方面, 均證明ABA3s啟動子響應(yīng)多種非生物逆境脅迫和誘導(dǎo), 啟動下游基因的表達(dá), 可運(yùn)用于玉米抗逆轉(zhuǎn)基因研究。值得注意的是, ABA3s啟動GUS基因轉(zhuǎn)化玉米愈傷組織在 8%甘露醇模擬干旱脅迫下的表達(dá)活性,比空白對照高6倍, 在高鹽、ABA誘導(dǎo)和低溫處理下, ABA3s的啟動活性與空白對照無顯著差異(圖5)。然而, qRT-PCR分析表明, ABA3s啟動的內(nèi)源ABA3基因, 在高溫、高鹽脅迫和ABA、乙稀誘導(dǎo)下呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)(圖2), 而在PEG模擬干旱和低溫脅迫下卻呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)(圖2)。但是, Lu等[29]用擬南芥鉬輔助因子硫酸化酶基因(LOS5)轉(zhuǎn)化玉米, 通過對內(nèi)源醛氧化酶基因表達(dá)的上調(diào)促進(jìn)ABA的積累, 降低氣孔導(dǎo)度和水份散失, 顯著提高轉(zhuǎn)基因株系的耐旱性。醛氧化酶催化 ABA生物合成的最后一步——脫落酸醛的氧化[30]。關(guān)于ABA3s啟動子及其啟動的ABA3基因, 在不同的脅迫條件下啟動活性及表達(dá)模式與其他模式植物的同源基因不完全一致的情況, 可能是因?yàn)椴煌锓N對各種非生物逆境的響應(yīng)機(jī)制不完全相同所致, 而玉米ABA3s啟動子在非生物逆境脅迫下的啟動活性確在本研究的幾個(gè)不同的方面得以驗(yàn)證, 并與前人的報(bào)道基本一致。

在上述各種實(shí)驗(yàn)處理的不同時(shí)間段, 基因表達(dá)量的不規(guī)律性波動, 也說明玉米抗逆相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)對非生物逆境的應(yīng)答是多方面而且復(fù)雜的。本研究所用的啟動子分析軟件 PlantCARE, 在ABA3s啟動子序列中未發(fā)現(xiàn)低溫應(yīng)答元件, 但qRT-PCR分析和 GUS基因瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)均證明ABA3s啟動子具有低溫啟動活性, 說明其序列中可能還存在未被認(rèn)識的低溫應(yīng)答元件。

玉米鉬輔助因子硫酸化酶基因 ABA3的啟動子ABA3s長777 bp, 含有ARE、HSE、MBS、TGA和Circadian非生物逆境脅迫應(yīng)答元件, 響應(yīng)干旱、低溫、高溫、高鹽脅迫等多種非生物逆境脅迫, 及ABA和乙稀誘導(dǎo), 啟動下游基因的表達(dá), 經(jīng)進(jìn)一步驗(yàn)證后可運(yùn)用于玉米抗逆轉(zhuǎn)基因研究。

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(責(zé)任編委: 王國英)

Cloning and functional validation of promoter of mo-molybdopterin cofactor sulfurase gene in maize

Xuehuan Gao, Fengling Fu, Wei Mu, Shufeng Zhou, Suzhi Zhang, Wanchen Li

Maize Research Institute, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China

To overcome the problems caused by the over-expression of exogenous genes under the control of constitutive promoters, the promoter (ABA3s) sequence of maize (Zea mays) mo-molybdopterin cofactor sulfurase gene (ABA3) was cloned homologously, analyzed for its abiotic stress-responsive elements by the PlantCARE software, and detected for differential expression of the ABA3 gene under the abiotic stresses by real-time quantitative PCR. Then, this promoter was used to construct expression vector to start GUS (β-glucuronidase) gene, and transform maize calli by biolistics. After identification by histochemcal staining, the ratio of the GUS activity relative to the luciferase activity (internal control)(GUS/LUC) was measured under the stresses of hypertonic, high salt, low temperature, and the induction of ABA, and used to evaluate the activity of the ABA3s promoter in response to abiotic stresses. The results showed that the ABA3 gene was differentially expressed under the stress of simulative drought, low temperature, high temperature, high salt, and the induction of ABA and ethylene, indicating that the promoter (ABA3s) of this gene is induced by abtiotic stress. The sequence analysis showed that the ABA3s promoter is 777 bp long, and contains abiotic stress-responsive elements ARE, HSE, MBS, TGA and circadian. The transformed calli by the expression vector of the GUS gene under the control of the ABA3s promoter showed positive in GUS detection in response to the abiotic stresses of drought, low temperature, high temperature, high salt, and the induction of ABA and ethylene. The GUS/LUC ratio was six folds higher than the blank control under the hypertonic stress of 8% mannitol. It is concluded that the promoter ABA3s is inducible in response to abiotic stresses, and might be applied to transgenic research of maize for abiotic tolerance after further functional evaluation.

maize; abiotic stress; mo-molybdopterin cofactor sulfurase; promoter

2013-09-30;

2014-01-02

國家轉(zhuǎn)基因重大科技專項(xiàng)(編號：2013ZX08003-005)資助

高學(xué)煥, 碩士研究生, 專業(yè)方向：植物分子生物學(xué)。E-mail: gaoxh2011@qq.com

李晚忱, 教授, 博士生導(dǎo)師, 研究方向：玉米遺傳育種與生物技術(shù)。E-mail: aumdyms@sicau.edu.cn

10.3724/SP.J.1005.2014.0584

時(shí)間: 2014-3-7 11:37:59

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20140307.1137.002.html