利用染色體區(qū)段混合BAC探針鑒定食管癌細(xì)胞中的染色體畸變

郝佳潔, 王春麗,2, 顧文躍,3, 程瀟鈺, 張鈺, 徐昕, 蔡巖, 王明榮

1. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所, 分子腫瘤學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100021;

2. 安徽醫(yī)科大學(xué)組織胚胎學(xué)教研室, 合肥 230032;

3. 鹽城市第三人民醫(yī)院病理科, 鹽城 224001

利用染色體區(qū)段混合BAC探針鑒定食管癌細(xì)胞中的染色體畸變

郝佳潔1, 王春麗1,2, 顧文躍1,3, 程瀟鈺1, 張鈺1, 徐昕1, 蔡巖1, 王明榮1

1. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所, 分子腫瘤學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100021;

2. 安徽醫(yī)科大學(xué)組織胚胎學(xué)教研室, 合肥 230032;

3. 鹽城市第三人民醫(yī)院病理科, 鹽城 224001

染色體畸變是惡性腫瘤細(xì)胞的重要遺傳學(xué)特征, 文章旨在應(yīng)用BAC DNA克隆鑒定食管癌細(xì)胞中的染色體臂和染色體區(qū)段的畸變。針對(duì)染色體各區(qū)段選取5～10個(gè)1 Mb BAC DNA, 分別混合制備成特定染色體區(qū)段的BAC DNA混合克隆, 然后將染色體臂上覆蓋所有區(qū)段的上述混合克隆進(jìn)一步混合制備成特定染色體臂BAC DNA混合克隆。利用簡(jiǎn)并寡核苷酸引物聚合酶鏈反應(yīng)(Degenerate oligonucleotide primed PCR, DOP-PCR)標(biāo)記染色體臂探針, 利用切口平移法(Nick translation)標(biāo)記染色體區(qū)段探針, 并對(duì)食管癌細(xì)胞中期染色體進(jìn)行熒光原位雜交(Fluorescence in situ hybridization, FISH)分析。正常人外周血淋巴細(xì)胞中期染色體FISH結(jié)果顯示, 上述方法標(biāo)記的探針具有較高的特異性。進(jìn)一步利用染色體臂混合探針, 確定了多個(gè)食管癌細(xì)胞中的染色體重排所涉及的特定染色體臂; 利用染色體區(qū)段混合探針, 鑒定出KYSE140的t(1q;7q)衍生染色體中1q上的斷點(diǎn)范圍位于1q32-q41。文章成功建立了1 Mb BAC DNA混合克隆探針標(biāo)記技術(shù), 并鑒定出多個(gè)食管癌細(xì)胞中的染色體臂和染色體區(qū)段畸變, 不僅為利用 M-FISH技術(shù)鑒定腫瘤細(xì)胞中的染色體畸變提供了更為準(zhǔn)確的方法, 而且還可能進(jìn)一步將該法推廣應(yīng)用于惡性血液病的核型分析以及產(chǎn)前診斷。

染色體畸變; BAC DNA; 染色體臂和區(qū)段; 熒光原位雜交; 食管癌細(xì)胞

染色體畸變是惡性腫瘤的重要特征, 染色體畸變的鑒定和分析已成為惡性腫瘤研究的重要領(lǐng)域之一。多色熒光原位雜交(Multicolor fluorescence in situ hybridization, M-FISH)/光譜核型分析(Spectral karyotyping, SKY)技術(shù)能夠用于一次性篩查和鑒定惡性血液病和實(shí)體瘤細(xì)胞系的全基因組染色體畸變, 特別是對(duì)于檢測(cè)惡性血液病的染色體重排具有顯著優(yōu)越性[1～5], 但由于 M-FISH/SKY技術(shù)的分辨率有限,所以通常鑒定出的畸變范圍相對(duì)較大。近年來(lái)的研究表明, 惡性實(shí)體腫瘤細(xì)胞系的核型相對(duì)比較復(fù)雜,因此單獨(dú)使用M-FISH/SKY鑒定惡性實(shí)體腫瘤細(xì)胞的染色體畸變具有較大難度。若能輔以其他精確度更高的技術(shù)方法, 才可能相對(duì)準(zhǔn)確、有效地鑒定出惡性實(shí)體瘤細(xì)胞系核型。例如, 基于微陣列的技術(shù)以及新一代測(cè)序技術(shù)等[4,6～10]。

食管癌是發(fā)病率和死亡率較高的常見(jiàn)惡性實(shí)體瘤之一, 我國(guó)食管癌的主要類型為食管鱗癌[11,12]。本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中利用染色體水平的比較基因組雜交(Comparative genomic hybridization, CGH)、微陣列比較基因組雜交(Array-CGH)和M-FISH技術(shù)在多個(gè)食管癌細(xì)胞系中檢測(cè)到染色體畸變, 且這些細(xì)胞系的核型非常復(fù)雜[13～16], 因此開(kāi)發(fā)能夠與 M-FISH和 array-CGH配合用于鑒定染色體畸變的技術(shù), 對(duì)于進(jìn)一步明確細(xì)胞系的核型是十分必要的。

本文以食管癌細(xì)胞系為模型, 建立了一種簡(jiǎn)便的染色體臂/區(qū)段 M-FISH檢測(cè)技術(shù), 且費(fèi)用相對(duì)低廉。利用實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的1 Mb BAC DNA克隆, 制備了多種混合克隆模板, 鑒定出多個(gè)食管癌細(xì)胞系中特定的染色體臂或染色體區(qū)段畸變。

1 材料和方法

1.1 食管癌細(xì)胞系

人類食管鱗癌細(xì)胞系 KYSE30、KYSE140、KYSE150、KYSE180、KYSE410、KYSE450和KYSE510由日本東京大學(xué)Shimada教授惠贈(zèng)。細(xì)胞培養(yǎng)使用含 10%胎牛血清的 RPMI 1640培養(yǎng)基(Invitrogen公司), 在37℃含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 中期染色體和間期核細(xì)胞懸液的制備

取正常人外周血0.5 mL接種至含有肝素的培養(yǎng)基, 37℃培養(yǎng)2 d, 制備正常人外周血淋巴細(xì)胞中期染色體。正常人外周血淋巴細(xì)胞和食管癌細(xì)胞系經(jīng)0.04 μg/mL秋水仙胺(Invitrogen公司)處理1～2 h后,收獲細(xì)胞。0.075 mol/L KCl重懸細(xì)胞, 37℃水浴30 min, 加入100 μL固定液(甲醇:冰醋酸=3:1), 吹打混勻, 1000 r/min離心10 min, 棄上清。加入10 mL固定液重懸, 室溫放置20 min, 1000 r/min離心10 min,棄上清, 重復(fù)兩次, 1 mL固定液重懸。取10 μL懸液滴至載玻片上, 室溫晾干, 并在干燥器中放置2～3 d后進(jìn)行雜交前處理。剩余的細(xì)胞懸液置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 BAC DNA質(zhì)粒提取

BAC DNA 質(zhì)粒提取使用 Wizard? Plus SV minipreps DNA Purification System(Promega公司),操作步驟詳見(jiàn)說(shuō)明書(shū)。

1.4 染色體區(qū)段和染色體臂涂染探針模板的制備

根據(jù)染色體區(qū)段的長(zhǎng)度, 在各區(qū)段選取5～10個(gè)1 Mb BAC DNA克隆進(jìn)行混合, 制備成各染色體區(qū)段混合BAC DNA克隆。進(jìn)一步利用上述區(qū)段混合克隆繼續(xù)混合, 制備特定染色體臂的 BAC DNA混合克隆。例如, 總共105個(gè)1 Mb BAC DNA克隆定位于1號(hào)染色體長(zhǎng)臂(1q), 根據(jù)各BAC DNA克隆在1q上的具體位置, 將1q上的BAC DNA分段混合,制備成 18個(gè)區(qū)段, 包括 1q11-q21、1q21-q22、1q22-q23、1q12-q24、1q23-q25、1q24、1q22-q25、1q25-q31、1q25.3-q31.1、1q31-q32、1q25-q31.3、1q31.3-q32.1、1q32、1q32-q41、1q32.3-q41、1q41-q42、1q43和1q43-q44。將上述18個(gè)區(qū)段混合BAC DNA全部混合, 制備成能夠覆蓋 1q的染色體臂 BAC DNA混合克隆。其他染色體區(qū)段和染色體臂探針模板按照相同的方法制備。

1.5 BAC DNA模板片段化和探針標(biāo)記

BAC DNA通過(guò)DOP-PCR的低嚴(yán)謹(jǐn)性擴(kuò)增方法進(jìn)行片段化和擴(kuò)增, 體系如下(50 μL)：5.0 μL 10× buffer (Mg2+), 4.0 μL MgCl2(25 mmol/L), 1.0 μL DOP-PCR 引物 (100 μmol/L), 2.0 μL dNTP (5 mmol/L), 1.0 μL模板(50 ng), 36.5 μL ddH2O, 0.5 μL rTaq (5 U/μL); DOP-PCR引物序列為： 5′-CCGACTCGAGNNNNNNTAGGAG-3′。擴(kuò)增程序：94℃ 3 min; 94℃ 1.5 min, 30℃ 2.5 min, 以0.1℃/s的速度升至 72℃, 72℃ 3 min, 8個(gè)循環(huán); 94℃ 1 min, 62℃ 1.5 min, 72℃ 2 min(各循環(huán)的延伸時(shí)間在前一循環(huán)的基礎(chǔ)上增加1 s), 30個(gè)循環(huán); 72℃ 10 min。

隨后對(duì)片段化的模板進(jìn)行 DOP-PCR高嚴(yán)謹(jǐn)性擴(kuò)增, 體系同上, 反應(yīng)程序如下：94℃ 3 min; 94℃1 min, 62℃ 1 min, 72℃ 1.5 min, 重復(fù)30個(gè)循環(huán); 72℃ 8 min。

探針標(biāo)記所需底物包括Cy3-dUTP(GE Healthcare公司)、SpG-dUTP(Abbott Molecular公司)、Alexa 594-dUTP(Invitrogen公司)、Biotin-dCTP(Invitrogen公司)。染色體臂混合BAC DNA利用DOP-PCR高嚴(yán)謹(jǐn)性擴(kuò)增標(biāo)記。標(biāo)記體系如下(25 μL)：2.5 μL 10× buffer (Mg2+-free), 2.0 μL MgCl2(25 mmol/L), 0.5 μL DOP-PCR引物 (100 μmol/L), 2.0 μL dNTP (2.5/1.25 mmol/L), 0.5 μL模板, 8.0 μL dUTP/dCTP (125 μmol/L), 9.25 μL ddH2O, 0.25 μL rTaq (5 U/μL); 反應(yīng)程序如下：94℃ 3 min; 94℃ 1 min, 62℃ 1 min, 72℃ 1.5 min, 重復(fù)30個(gè)循環(huán); 72℃ 8 min。染色體區(qū)段混合BAC DNA按照Nick translation kit(Abbott Molecular公司)中提供的程序進(jìn)行。

1.5 熒光原位雜交

標(biāo)記后的探針各取3 μL, 加入6 μL Cot-I DNA和6 μL鮭魚(yú)精DNA, 1/10體積3 mol/L醋酸鈉, 2.5倍體積預(yù)冷的無(wú)水乙醇, -20℃放置30 min, 12 000 r/min離心15 min, 棄上清。加入500 μL 75%乙醇清洗一次, 12 000 r/min離心10 min, 棄上清, 室溫晾干, 10 μL雜交液(50%甲酰胺、10%硫酸葡聚糖、1% Tween-20、2×saline sodium citrate [SSC])溶解, 待用。

樣品片前處理：在1× PBS中清洗5 min, 梯度乙醇脫水(75%、85%、100%, 各 3 min), 晾干。用RNase A(100 mg/mL溶解于2× SSC)濕盒中37℃處理40 min, 2× SSC中3 min, 重復(fù)一次, 梯度乙醇脫水, 晾干。玻片繼續(xù)經(jīng)pepsin(50 mg/mL溶解于0.01 mol/L HCl)37℃處理10 min, 1× PBS中清洗5 min, 1%多聚甲醛10 min, 1× PBS清洗5 min, 梯度乙醇脫水, 晾干。

探針 75℃變性 8 min, 立即置于冰上 2 min, 37℃預(yù)復(fù)性30 min。前處理后的玻片置于70%甲酰胺/2× SSC中, 73℃～75℃變性3 min, 預(yù)冷的2×SSC中2次, 每次3 min, 梯度乙醇脫水, 晾干。將含有探針的10 μL雜交液滴加于玻片, 覆以18 × 18 mm蓋玻片, 橡皮膠封片, 置于濕盒中, 37℃保溫24～48 h。雜交后玻片置于 50%甲酰胺/2× SSC, 43℃洗片 15 min, 2× SSC中3 min, 重復(fù)一次, 梯度乙醇脫水, 晾干, 1 mg/mL 40,6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)封片。對(duì)于標(biāo)記了Biotin-dCTP的探針, 在探針洗滌后增加以下步驟：4× SSCT清洗5 min, 3% BSA(于4× SSCT中溶解)濕盒中37℃處理30 min, 4× SSCT清洗5 min, Cy5-Streptavidin(Jackson ImmunoResearch,4× SSCT稀釋至 1:200)濕盒中 37℃處理 1 h, 4× SSCT清洗5 min, 重復(fù)2次, 梯度乙醇脫水, 晾干, DAPI封片。

1.6 顯微鏡檢和圖像分析

FISH圖像利用蔡司 Axio熒光顯微鏡觀察, 并通過(guò)數(shù)碼冷CCD(Princeton Instruments公司)進(jìn)行采集。所有熒光信號(hào)均使用單通道濾光片采集, 然后利用 MetaMorph(Universal Imaging公司)進(jìn)行圖像處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 利用1 Mb BAC DNA克隆自制染色體區(qū)段和染色體臂涂染探針模板

選取染色體臂上的 1 Mb BAC進(jìn)行分段混合,總共制備了537個(gè)區(qū)段BAC DNA混合克隆。由于相鄰混合克隆之間存在重疊, 因此這些混合克隆能夠覆蓋整個(gè)染色體組中的各個(gè)區(qū)段, 從而保證后續(xù)圖像采集時(shí)呈現(xiàn)均勻的雜交信號(hào)。進(jìn)一步利用染色體臂上的區(qū)段混合克隆繼續(xù)混合, 制備了總共42個(gè)染色體臂的BAC DNA混合克隆涂染探針模板。由于13、14、15、21、22和Y染色體為近端著絲粒染色體, 因此僅制備了其長(zhǎng)臂探針模板; 而對(duì)于其余染色體, 均分別制備了長(zhǎng)臂和短臂探針模板。

2.2 自制染色體臂涂染探針的特異性分析

利用DOP-PCR低嚴(yán)謹(jǐn)性擴(kuò)增方法對(duì)混合BAC DNA進(jìn)行片段化和富集, 進(jìn)一步通過(guò)DOP-PCR高嚴(yán)謹(jǐn)性擴(kuò)增法對(duì)片段化產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記。電泳結(jié)果顯示, 使用 SpG-dUTP、Alexa 594-dUTP、Cy3-dUTP和 Biotin-dUTP標(biāo)記的 2、3、4、5、6、8、9、12和16號(hào)染色體臂混合BAC DNA探針大小范圍為200～2000 bp(圖1)。正常人外周血淋巴細(xì)胞中期染色體FISH結(jié)果顯示, 上述染色體臂涂染探針具有較高的特異性(圖2)。

2.3 利用自制染色體臂涂染探針鑒定食管癌細(xì)胞中的染色體畸變

利用自制染色體臂涂染探針對(duì)多個(gè)食管癌細(xì)胞系進(jìn)行了 FISH檢測(cè), 結(jié)果顯示 KYSE450中存在t(2q;16p)和t(2q;16q)、KYSE410中存在t(4q;8q)、以及KYSE180中存在t(2p;?;3p)(圖3：A～C)。

在本實(shí)驗(yàn)室前期研究中, 食管癌KYSE450細(xì)胞array-CGH結(jié)果顯示, 該細(xì)胞存在2p24.2-q13和16號(hào)染色體增益, 且2號(hào)染色體上2p24.2和2q13區(qū)段具有明顯斷點(diǎn), 而16號(hào)染色體未檢測(cè)到明顯斷點(diǎn)[16]。結(jié)合上述結(jié)果, 本研究推測(cè)圖3A中所示的與16q發(fā)生重排的片段是2p24.2-q13, 且連接點(diǎn)位于2q13。

KYSE180中3p涂染探針FISH結(jié)果顯示, 3p存在4個(gè)信號(hào), 其中2個(gè)小信號(hào)位于t(2p;?;3p)衍生染色體上。

同時(shí), 本文還檢測(cè)了食管癌細(xì)胞 KYSE30、KYSE140、KYSE150、KYSE180、KYSE450和KYSE510,將大量染色體重排定位至特定的染色體臂(圖3D)。

2.4 聯(lián)合染色體臂涂染探針和區(qū)段探針鑒定食管癌中的染色體重排

已證實(shí)KYSE140中存在t(1q;7q)衍生染色體(圖3), 為了進(jìn)一步確定1q的斷點(diǎn)范圍, 本研究利用1q上的染色體區(qū)段探針和 7q染色體臂涂染探針進(jìn)行FISH檢測(cè), 結(jié)果顯示1q25-q31與7q不在一條染色體上, 而1q32-q41、1q41-q42和1q43-q44與7q在同一條染色體上, 且1q32-q41與7q距離最近, 因此推測(cè)1q上的斷點(diǎn)位于1q32-q41(圖4)。

圖2 自制染色體臂涂染探針的特異性驗(yàn)證代表圖正常人外周血淋巴細(xì)胞中期染色體FISH結(jié)果表明, 2p、2q、3p、3q、4p、4q(A)以及6p、6q、8p、8q、16p、16q(B)均顯示兩個(gè)信號(hào)。上述探針標(biāo)記使用的熒光素和偽彩分別為2p(SpG, 綠色)、2q(Cy3, 紅色)、3p(Alexa 594, 紫色)、3q(Biotin/Cy5, 藍(lán)色)、4p(SpG和Cy3,黃色)、4q(SpG和Alexa 594, 粉綠色)、6p(SpG, 綠色)、6q(Cy3, 紅色)、8p(Cy3和Biotin/Cy5, 粉色)、8q(Alexa 594和Biotin/Cy5, 粉藍(lán)色)、16p(Alexa 594, 紫色)和16q(Biotin/Cy5, 藍(lán)色)。

圖3 利用染色體臂涂染探針檢測(cè)食管癌細(xì)胞中的染色體畸變A：KYSE450中存在t(2q;16p)(上方白色箭頭所示)和t(2q;16q)(下方白色箭頭所示); 探針標(biāo)記使用的熒光素和偽彩分別為2p(SpG, 綠色)、2q(Cy3, 紅色)、16p(SpG和Cy3, 黃色)和16q(Biotin/Cy5, 藍(lán)色); B：KYSE410中存在t(4q;8q)(白色箭頭所示); 探針標(biāo)記使用的熒光素和偽彩分別為4p(SpG和Cy3, 黃色)、4q(SpG, 綠色)、8p(Cy3和Biotin/Cy5, 粉色)和8q(Biotin/Cy5, 紫色); C：KYSE180中存在 t(2p;?;3p)(兩個(gè)白色箭頭所示); 探針標(biāo)記使用的熒光素和偽彩分別為 2p(SpG, 綠色)和 3p(Cy3, 紅色); D：各細(xì)胞系中鑒定出的染色體臂重排。

圖4 聯(lián)合染色體臂和區(qū)段探針鑒定KYSE140細(xì)胞中t(1q;7q)衍生染色體上1q的斷點(diǎn)范圍A：1q41-q42(紅色)和1q43-q44(綠色)均與7q(藍(lán)色)位于同一條衍生染色體上; B：1q32-q41(綠色)和7q(藍(lán)色)位于同一條衍生染色體上,而1q25-q31(紅色)則不在該染色體上。這些結(jié)果提示, 1q上的斷點(diǎn)范圍位于1q32-q41。

3 討 論

本文利用實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的BAC DNA克隆庫(kù), 自行制備出針對(duì)各染色體臂的涂染探針模板, 熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 探針具有較高的特異性, 且有效地檢測(cè)出了食管癌細(xì)胞中的染色體臂畸變。

M-FISH/SKY是鑒定惡性血液病和惡性實(shí)體瘤細(xì)胞全基因組染色體畸變的方法之一, 而考慮到惡性實(shí)體瘤細(xì)胞核型的復(fù)雜性, 單獨(dú)使用 M-FISH/ SKY可能使鑒定結(jié)果產(chǎn)生一定誤差。近年來(lái), M-FISH/ SKY聯(lián)合染色體臂區(qū)段mBAND FISH、array-CGH等技術(shù), 使染色體畸變鑒定的精確度大大提高。mBAND是一種多色顯帶技術(shù), 運(yùn)用顯微切割技術(shù)分離染色體片段, 通過(guò)多色標(biāo)記, 從而使區(qū)段按不同顏色得以區(qū)分, 已有研究表明, 該法能夠鑒定出重排、缺失等染色體畸變[17～22]。由于顯微切割法對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的技術(shù)操作要求較高, 從而增加了自行制備mBAND模板的難度。本文建立的混合BAC DNA探針同樣能夠?qū)⑷旧w畸變定位于特定的染色體臂和染色體區(qū)段, 無(wú)需對(duì)染色體區(qū)段進(jìn)行顯微切割,操作相對(duì)簡(jiǎn)便, 費(fèi)用相對(duì)低廉, 同時(shí)可以根據(jù)實(shí)際需要將不同區(qū)段的克隆混合作為模板。Array-CGH是鑒定基因組拷貝數(shù)畸變和非平衡斷點(diǎn)的常用方法[5,6,23,24]。對(duì)于利用 array-CGH鑒定出的非平衡斷點(diǎn), 通常需要經(jīng)過(guò)原位驗(yàn)證, 利用 BAC DNA探針FISH能夠?qū)崿F(xiàn)這一點(diǎn); 對(duì)于利用array-CGH檢測(cè)不出的平衡斷點(diǎn), 本文建立的方法還能夠幫助確定是否具有重排以及涉及的斷點(diǎn)范圍, 從而增加了染色體畸變鑒定的準(zhǔn)確性。

1 Mb BAC DNA相鄰BAC DNA之間的平均間隔為1 Mb。由于熒光素被激發(fā)產(chǎn)生熒光后具有散射效應(yīng), 因此我們推測(cè), 雖然BAC DNA之間有間隔,但當(dāng) BAC DNA混合在一起后, 發(fā)射出的熒光仍能覆蓋該區(qū)域。本文的FISH結(jié)果表明, 標(biāo)記的1 Mb BAC DNA混合染色體臂涂染探針的FISH信號(hào)是比較均勻的。

目前標(biāo)記單個(gè)BAC DNA探針常用的方法主要包括隨機(jī)引物法和切口平移法[25]。本研究首先嘗試?yán)蒙鲜鰞煞N方法對(duì)混合 BAC DNA進(jìn)行了標(biāo)記,而FISH結(jié)果顯示, 當(dāng)數(shù)個(gè)BAC DNA混合后, 標(biāo)記和雜交的效率則顯著下降, 雜交后的信號(hào)會(huì)受到明顯影響, 尤其對(duì)于混合了幾十個(gè) BAC DNA的染色體區(qū)段和整條染色體臂, 上述兩種方法標(biāo)記的探針均無(wú)明顯雜交信號(hào)。因此本文改用DOP-PCR方法對(duì)混合BAC DNA進(jìn)行片段化和擴(kuò)增。DOP-PCR最初用于擴(kuò)增和標(biāo)記染色體涂染探針, 其所用模板是通過(guò)流式分選或顯微切割獲得的染色體和染色體片段[26,27]。近年來(lái), DOP-PCR也被擴(kuò)展用于BAC DNA的標(biāo)記以及微陣列探針的制備[25,28～31]。本文制備的染色體臂混合模板中包含數(shù)個(gè)至數(shù)百個(gè)BAC DNA,利用隨機(jī)引物法和切口平移法制備的探針量較少,而DOP-PCR則使模板的擴(kuò)增效率大大提高, 從而能夠滿足雜交的要求。在對(duì)混合BAC DNA模板進(jìn)行DOP-PCR低嚴(yán)謹(jǐn)性擴(kuò)增時(shí), 本文首先對(duì)多個(gè)起始模板量(15 ng、50 ng、100 ng和200 ng)進(jìn)行了優(yōu)化, 結(jié)果表明, 當(dāng)片段化之前的起始 DNA量大于等于 50 ng時(shí), 各通道DNA探針的FISH信號(hào)強(qiáng)度并沒(méi)有明顯差別, 因此本文選取50 ng混合BAC DNA作為擴(kuò)增模板的起始量。

為了確定上述方法制備探針的有效性, 還對(duì)食管癌細(xì)胞中的染色體畸變進(jìn)行了檢測(cè)和驗(yàn)證。利用本文制備的 2號(hào)和 16號(hào)染色體臂涂染探針, 在KYSE450中鑒定出了t(2q;16q), 與本實(shí)驗(yàn)室前期的M-FISH和array-CGH結(jié)果相吻合[13,16]。本研究發(fā)現(xiàn), KYSE180中3p存在4個(gè)信號(hào), 其中2個(gè)小信號(hào)位于t(2p;?;3p)衍生染色體上(圖 3C), 而前期的 array-CGH結(jié)果表明, KYSE180中3p無(wú)拷貝數(shù)改變[16], 推測(cè)本文 FISH圖中的小信號(hào)和大信號(hào)所示的區(qū)段之間可能存在一個(gè)斷點(diǎn), 不涉及拷貝數(shù)的增加或減少,表明來(lái)自于3p上的斷點(diǎn)可能為平衡斷點(diǎn)。

綜上所述, 本研究建立的混合BAC DNA探針及其標(biāo)記方法, 不僅可以廣泛用于準(zhǔn)確地鑒定實(shí)體腫瘤細(xì)胞中的染色體畸變, 為利用 M-FISH鑒定腫瘤細(xì)胞中的染色體畸變提供了相對(duì)準(zhǔn)確的方法, 而且還可能進(jìn)一步推廣應(yīng)用于惡性血液病的核型分析以及產(chǎn)前診斷。

[1] Speicher MR, Ballard SG, Ward DC. Karyotyping human chromosomes by combinatorial multi-fluor FISH. Nat Genet, 1996, 12(4): 368–375.

[2] Schrock E, du Manoir S, Veldman T, Schoell B, Wienberg J, Ferguson-Smith MA, Ning Y, Ledbetter DH, Bar-Am I, Soenksen D, Garini Y, Ried T. Multicolor spectral karyotyping of human chromosomes. Science, 1996, 273(5274): 494–497.

[3] Tchinda J, Volpert S, McNeil N, Neumann T, Kennerknecht I, Ried T, Buchner T, Serve H, Berdel WE, Horst J, Hilgenfeld E. Multicolor karyotyping in acute myeloid leukemia. Leuk Lymphoma, 2003, 44(11): 1843–1853.

[4] Kearney L. Multiplex-FISH (M-FISH): technique, developments and applications. Cytogenet Genome Res, 2006, 114(3–4): 189–198.

[5] Min BJ, Ko JM, Seo ME, Choi JS, Oh SK, Jeon J, Kim E, Moon JE, Choi IH, Lee C, Kim OH, Cho TJ, Park WY. An interstitial, apparently-balanced chromosomal insertion in the etiology of Langer-Giedion syndrome in an Asian family. Eur J Med Genet, 2013, 56(10): 561–565.

[6] Mao XY, James SY, Yanez-Munoz RJ, Chaplin T, Molloy G, Oliver RT, Young BD, Lu YJ. Rapid high-resolution karyotyping with precise identification of chromosome breakpoints. Genes Chromosomes Cancer, 2007, 46(7): 675–683.

[7] Vergult S, Van Binsbergen E, Sante T, Nowak S, Vanakker O, Claes K, Poppe B, Van der Aa N, van Roosmalen MJ, Duran K, Tavakoli-Yaraki M, Swinkels M, van den Boogaard MJ, van Haelst M, Roelens F, Speleman F, Cuppen E, Mortier G, Kloosterman WP, Menten B. Mate pair sequencing for the detection of chromosomal aberrations in patients with intellectual disability and congenital malformations. Eur J Hum Genet, 2014, 22(5): 652–659.

[8] Gruver AM, Rogers HJ, Cook JR, Ballif BC, Schultz RA, Batanian JR, Fesler MJ, Tubbs RR. Modified array-based comparative genomic hybridization detects cryptic and variant PML-RARA rearrangements in acute promyelocytic leukemia lacking classic translocations. Diagn Mol Pathol, 2013, 22(1): 10–21.

[9] Schluth-Bolard C, Labalme A, Cordier MP, Till M, Nadeau G, Tevissen H, Lesca G, Boutry-Kryza N, Rossignol S, Rocas D, Dubruc E, Edery P, Sanlaville D. Breakpoint mapping by next generation sequencing reveals causative gene disruption in patients carrying apparently balanced chromosome rearrangements with intellectual deficiency and/or congenital malformations. J Med Genet, 2013, 50(3): 144–150.

[10] Howarth KD, Pole JC, Beavis JC, Batty EM, Newman S, Bignell GR, Edwards PA. Large duplications at reciprocal translocation breakpoints that might be the counterpart of large deletions and could arise from stalled replication bubbles. Genome Res, 2011, 21(4): 525–534.

[11] Parkin DM, Bray FI, Devesa SS. Cancer burden in the year 2000. The global picture. Eur J Cancer, 2001, 37(Suppl. 8): S4–S66.

[12] Jemal A, Bray F, Center MM, Ferlay J, Ward E, Forman D. Global cancer statistics. CA Cancer J Clin, 2011, 61(2): 69–90.

[13] Wu YP, Yang YL, Han YL, Xu X, Cai Y, Yang GZ, Wang XY, Zhan QM, Wu M, Wang MR. Identification of complex chromosome abnormalities in esophageal carcinoma cells KYSE450 by multicolor fluorescence in situ hybridization. World Chinese J Digestology, 2006, 14(8): 747–751.

[14] Wu YP, Yang YL, Yang GZ, Wang XY, Luo ML, Zhang Y, Feng YB, Xu X, Han YL, Cai Y, Zhan QM, Wu M, Dong JT, Wang MR. Identification of chromosome aberrations inesophageal cancer cell line KYSE180 by multicolor fluorescence in situ hybridization. Cancer Genet Cytogenet, 2006, 170(2): 102–107.

[15] Yang Y, Chu J, Wu Y, Luo M, Xu X, Han Y, Cai Y, Zhan Q, Wang M. Chromosome analysis of esophageal squamous cell carcinoma cell line KYSE 410–4 by repetitive multicolor fluorescence in situ hybridization. J Genet Genomics, 2008, 35(1): 11–16.

[16] Hao JJ, Shi ZZ, Zhao ZX, Zhang Y, Gong T, Li CX, Zhan T, Cai Y, Dong JT, Fu SB, Zhan QM, Wang MR. Characterization of genetic rearrangements in esophageal squamous carcinoma cell lines by a combination of M-FISH and array-CGH: further confirmation of some split genomic regions in primary tumors. BMC Cancer, 2012, 12: 367.

[17] Chudoba I, Hickmann G, Friedrich T, Jauch A, Kozlowski P, Senger G. mBAND: a high resolution multicolor banding technique for the detection of complex intrachromosomal aberrations. Cytogenet Genome Res, 2004, 104(1–4): 390–393.

[18] Gazzo S, Chudoba I, Traverse-Glehen A, Baseggio L, Felman P, Berger F, Salles G, Hayette S, Magaud JP, Callet-Bauchu E. Detailed characterization of 7q deletions by multicolor banding (mBAND) in marginal zone cell lymphoma. Cancer Genet Cytogenet, 2007, 175(2): 159–165.

[19] Paderova J, Orlic-Milacic M, Yoshimoto M, da Cunha Santos G, Gallie B, Squire JA. Novel 6p rearrangements and recurrent translocation breakpoints in retinoblastoma cell lines identified by spectral karyotyping and mBAND analyses. Cancer Genet Cytogenet, 2007, 179(2): 102–111.

[20] Sarova I, Brezinova J, Zemanova Z, Bystricka D, Krejcik Z, Soukup P, Vydra J, Cermak J, Jonasova A, Michalova K. Characterization of chromosome 11 breakpoints and the areas of deletion and amplification in patients with newly diagnosed acute myeloid leukemia. Genes Chromosomes Cancer, 2013, 52(7): 619–635.

[21] Schmitz S, Pinkawa M, Eble MJ, Kriehuber R. Persisting ring chromosomes detected by mFISH in lymphocytes of a cancer patient-a case report. Mutat Res, 2013, 756(1–2): 158–164.

[22] Vlckova M, Trkova M, Zemanova Z, Hancarova M, Novotna D, Raskova D, Puchmajerova A, Drabova J, Zmitkova Z, Tan Y, Sedlacek Z. Mechanism and genotype-phenotype correlation of two proximal 6q deletions characterized using mBAND, FISH, array CGH, and DNA sequencing. Cytogenet Genome Res, 2012, 136(1): 15–20.

[23] Lindstrand A, Schoumans J, Gustavsson P, Hanemaaijer N, Malmgren H, Blennow E. Improved structural characterization of chromosomal breakpoints using high resolution custom array-CGH. Clin Genet, 2010, 77(6): 552–562.

[24] Speicher MR, Carter NP. The new cytogenetics: blurring the boundaries with molecular biology. Nat Rev Genet, 2005, 6(10): 782–792.

[25] Backx L, Thoelen R, Van Esch H, Vermeesch JR. Direct fluorescent labelling of clones by DOP PCR. Mol Cytogenet, 2008, 1: 3.

[26] Telenius HK, Pelmear AH, Tunnacliffe A, Carter NP, Behmel A, Ferguson-Smith MA, Nordenskjold M, Pfragner R, Ponder BAJ. Cytogenetic analysis by chromosome painting using DOP-PCR amplified flow-sorted chromosomes. Genes Chromosomes Cancer, 1992, 4(3): 257–263.

[27] Viersbach R, Schwanitz G, Nothen MM. Delineation of marker chromosomes by reverse chromosome painting using only a small number of DOP-PCR amplified microdissected chromosomes. Hum Genet, 1994, 93(6): 663–667.

[28] Arneson N, Hughes S, Houlston R, Done S. Whole-genome amplification by degenerate oligonucleotide primed PCR (DOP-PCR). CSH Protoc, 2008, 2008: pdb prot4919.

[29] Chung YJ, Jonkers J, Kitson H, Fiegler H, Humphray S, Scott C, Hunt S, Yu Y, Nishijima I, Velds A, Holstege H, Carter N, Bradley A. A whole-genome mouse BAC microarray with 1-Mb resolution for analysis of DNA copy number changes by array comparative genomic hybridization. Genome Res, 2004, 14(1): 188–196.

[30] Darouich S, Popovici C, Missirian C, Moncla A. Use of DOP-PCR for amplification and labeling of BAC DNA for FISH. Biotech Histochem, 2012, 87(2): 117–121.

[31] Fiegler H, Carr P, Douglas EJ, Burford DC, Hunt S, Scott CE, Smith J, Vetrie D, Gorman P, Tomlinson IP, Carter NP. DNA microarrays for comparative genomic hybridization based on DOP-PCR amplification of BAC and PAC clones. Genes Chromosomes Cancer, 2003, 36(4): 361–374.

(責(zé)任編委: 史慶華)

Identification of chromosomal aberration in esophageal cancer cells by mixed BAC DNA probes of chromosome arms and regions

Jiajie Hao1, Chunli Wang1,2, Wenyue Gu1,3, Xiaoyu Cheng1, Yu Zhang1, Xin Xu1, Yan Cai1, Mingrong Wang1

1. State Key Laboratory of Molecular Oncology, Cancer Institute (Hospital), Peking Union Medical College and Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100021, China;
2. Department of Histology and Embryology, Anhui Medical University, Hefei 230032, China;
3. Department of Pathology, Yancheng Third People’s Hospital, Yancheng 224001, China

Abstract:Chromosomal aberration is an important genetic feature of malignant tumor cells. This study aimed to clarify whether BAC DNA could be used to identify chromosome region and arm alterations. For each chromosome region, five to ten 1 Mb BAC DNA clones were selected to construct mixed BAC DNA clones for the particular region. All of the mixed clones from regions which could cover the whole chromosome arm were then mixed to construct mixed BAC DNA clones for the arms. Mixed BAC DNA probes of arms and regions were labeled by degenerate oligonucleotide primed PCR (DOP-PCR) and Nick translation techniques, respectively. The specificities of these probes were validated by fluorescence in situ hybridization (FISH) on the metaphase chromosomes of normal human peripheral blood lymphocytes. FISH with arm-specific mixed BAC DNA probes showed that chromosomal rearrangements and involved chromosome arms were confirmed in several esophageal cancer cells. By using region-specific mixed probes, the breakpoint on 1q from the derivative chromosome t(1q;7q) was identified in 1q32-q41 in esophageal KYSE140 cells. In conclusion, we established an effective labeling method for 1 Mb BAC DNA mixed clone probes, and chromosome arm and region rearrangements could be identified in several esophageal cancer cells by using these probes. Our study provides a more precise method for identification of chromosomal aberration by M-FISH, and the established method may also be applied to the karyotype analysis of hematological malignancies and prenatal diagnosis.

chromosomal aberration; BAC DNA; chromosome arms and regions; fluorescence in situ hybridization; esophageal cancer cells

2014-01-27;

2014-03-14

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：81201593, 81330052)和863計(jì)劃重大專項(xiàng)(編號(hào)：2012AA02A503, 2012AA02A209)資助

郝佳潔, 博士, 助理研究員, 研究方向：腫瘤遺傳學(xué)。E-mail: hjj8173@126.com

王明榮, 博士, 研究員, 研究方向：腫瘤遺傳學(xué)。E-mail: wangmr2015@126.com

10.3724/SP.J.1005.2014.0558

時(shí)間: 2014-5-5 8:54:33

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20140505.0854.008.html