表沒食子兒茶素沒食子酸酯對雌性生殖系統(tǒng)作用的研究進展

郭燕潔，方蘭蘭，孫瑩璞

(鄭州大學第一附屬醫(yī)院生殖與遺傳?？漆t(yī)院，鄭州 450052)

綠茶是一種未經(jīng)發(fā)酵的茶，其生物活性有效成分主要為多酚類化合物——茶多酚[1]，綠茶中酚類物質中80%為類黃酮化合物，而類黃酮類物主要成分為兒茶素。四種主要的茶多酚被命名為兒茶素，包括表兒茶素沒食子酸酯(epicatechin-3-gallate，ECG)、表沒食子兒茶素(epigallocatechin，EGC)、表兒茶素(epicatechin，EC)和表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate，EGCG)等幾種單體[2]。近年，綠茶有效成分的益處被廣泛地研究。EGCG是生物活性最高的一類兒茶素，在綠茶中含量最高。EGCG具有抗病毒、抗氧化、促凋亡及代謝、調節(jié)內(nèi)分泌和血管生成活性等特性。由于這些功能，EGCG可以減少心血管疾病和炎癥疾病的發(fā)病率、減輕糖尿病、降低血膽固醇水平以及減輕癌癥等疾病的發(fā)生發(fā)展[3-5]。EGCG作為無毒的天然產(chǎn)物，在生殖領域也被廣泛地研究。研究發(fā)現(xiàn)其在提高配子抗氧化能力、改善胚胎質量、調控類固醇激素合成以及在抗生殖系統(tǒng)腫瘤等相關疾病中都有一定作用[6-8]。本文就兒茶素EGCG的生物學特性以及其對雌性生殖健康的研究進展進行了總結，以期加深對于EGCG在生殖系統(tǒng)中的作用的認識與理解。

一、EGCG分子特性及主要功能

(一)EGCG的分子特性

兒茶素EGCG化學分子式為C22H18O11，其分子量為458.4。經(jīng)典的EGCG提取分離及單體制備工藝有膜分離法、樹脂法、金屬離子沉淀法、超聲波輔助萃取法等。制備兒茶素中EGCG單體時，需要進一步經(jīng)過高效液相色譜法或柱色譜法純化[9]。EGCG結構中具有6個鄰酚羥基和一對間羥基基團，眾多的酚羥基使得EGCG具有許多優(yōu)于其他兒茶素的性質[10]。4種包括EGCG在內(nèi)的主要的兒茶素及結構如圖1所示。目前已知的 EGCG 受體為67 KDa的層粘連蛋白受體(67 KDa laminin receptor，67LR)，被發(fā)現(xiàn)只能特異性結合EGCG，而其他的兒茶素如EC、ECG、EGC則不能結合此受體[11]。在生殖系統(tǒng)中，EGCG受體的67LR已經(jīng)在人卵巢癌細胞系OVCAR-3、人乳突狀卵巢腺癌細胞Caov-3、卵巢腺癌細胞系SKOV3等細胞中證實其存在[12]。

A：EGC；B：EC；C：ECG；D：EGCG。抗氧化和去除晚期糖基化終末產(chǎn)物的活性酚羥基苯環(huán)用藍色高亮顯示，4種化合物差異的烴基基團用紅色顯示圖1 綠茶中的4種兒茶素結構式

(二)EGCG的生物活性作用

現(xiàn)有研究表明，茶多酚EGCG具有降血壓、降血糖、降血脂、預防心腦血管疾病、抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展等多種藥理活性[13]，其抗氧化和抗腫瘤作用在人體被廣泛研究。

1.抗氧化功效：綠茶被認為是抗氧化劑的飲食來源，綠茶中EGCG 抗氧化的能力較為突出，使其成為明星生物活性物質。EGCG可以通過減少活性氧(reactive oxygen species，ROS)、清除自由基實現(xiàn)抗氧化的功效[14]。綠茶中也包含很多其他物質，例如維生素C、類胡蘿卜素和維生素E、礦物質以及普遍的植物化學成分，這些成分可能會提高EGCG的抗氧化性[15]。

EGCG有高于維生素C的清除自由基、抗氧化作用[16]，在體內(nèi)充當自由基的清道夫，可以保護生殖細胞對抗氧化應激(oxidative stress，OS)[17]。其抗氧化功效主要通過以下4個機制發(fā)揮作用：(1)螯合金屬離子：EGCG具有鄰苯二酚結構，因此具有很強的金屬離子螯合能力，能結合Haber-Weiss和Fenton反應中的鐵離子和游離鐵，從而降低其含量[18]；(2)結合自由基：羥自由基和超氧陰離子自由基可引起細胞內(nèi)脂質過氧化反應，進而引起細胞損傷。而EGCG具有這兩種自由基的強結合力，通過掃除自由基而降低細胞的氧化應激[18]；(3)調節(jié)轉錄因子或酶活性：EGCG在體內(nèi)可以通過影響轉錄因子或酶的活性來間接發(fā)揮抗氧化作用，如通過氧化還原調節(jié)的轉錄因子調控以及增強谷胱甘肽-S-轉移酶的活性等[19]；(4)調控酶活性/清除氧化中間產(chǎn)物：EGCG在體內(nèi)還能通過調控酶的活性來發(fā)揮抗氧化作用，如基于絲裂原激活的蛋白激酶的細胞周期的調節(jié)[20]。在細胞內(nèi)，EGCG 具有清除氧化中間產(chǎn)物的能力，參與到包括AKT/mTOR通路、MRLC 通路、RANK通路、TLR2/3通路、ERK1/2通路等眾多分子通路中[21-22]。

2.抗腫瘤作用：EGCG 還具有廣泛的抗腫瘤作用，被證實在卵巢癌、宮頸癌、膀胱癌、胃癌等腫瘤中，可以抑制細胞的生長、增殖，并減少遷移和侵襲，提高體內(nèi)抗腫瘤的免疫力，從而抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展[23]。而在眾多腫瘤模型研究中，應用5 μmol/L至200 μmol/L的EGCG處理腫瘤細胞或組織，發(fā)現(xiàn)往往是較低濃度的EGCG處理可以起到抗腫瘤效果[23]。乳腺癌是女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，體外實驗證明EGCG可以阻礙細胞周期、抑制細胞增殖和分化；能夠通過調控VEGF的表達抑制血管生成，誘導細胞凋亡；還可以抑制有害物的致癌發(fā)生率，降低已形成腫瘤的大小、數(shù)目及腫瘤細胞的侵襲和轉移[24]。

(三)EGCG的代謝

關于綠茶保健功能的研究主要是在體外實驗，對其代謝特性的研究主要集中在體外的生物活性測定。目前對于EGCG體內(nèi)生物轉化的研究尚淺，深入探討EGCG的生物利用度有助于明確其作用效果和機制。目前的研究結果顯示，EGCG在pH 7.4的條件下進行體外轉化時半衰期為0.56 h。加入金屬螯合劑和二乙基三胺五乙酸能夠延長其半衰期，三價鐵離子能加速其降解，這是因為 EGCG在溶液中可以結合金屬離子[25]。EGCG具有生物穩(wěn)定性低、生物轉化率高、代謝率不穩(wěn)定的特性?，F(xiàn)有研究表明胃部和腸道的極端條件以及相關消化酶會導致EGCG發(fā)生降解或者聚合反應。兒茶素主要通過被動擴散(包括細胞旁擴散和跨細胞擴散)通過腸上皮轉運，而目前小腸上皮細胞表面沒有發(fā)現(xiàn)可以轉運進入細胞的特異性受體[26]，這是EGCG吸收率低的主要原因；部分吸收的兒茶素的主動外排也降低了血漿兒茶素濃度。

二、EGCG在生殖系統(tǒng)的作用和功能

1.EGCG與卵母細胞成熟：導致不孕的因素眾多，其中營養(yǎng)缺乏、農(nóng)藥和工業(yè)化學品主動和被動攝取、吸煙、過度飲酒等，可以通過增加氧化應激的方式破壞卵子的質量[27]。放射線或尿路感染等因素也會影響女性生育能力，當ROS的產(chǎn)生超過人體的抗氧化能力時，就會發(fā)生氧化應激。此時氧化應激會引發(fā)脂質氧化，從而破壞膜的完整性并增加其滲透性，造成細胞中酶的失活，導致DNA結構損傷和細胞凋亡，從而抑制卵母細胞的發(fā)生與成熟[28]。卵母細胞成功受精的關鍵在于卵母細胞的成熟，卵母細胞不成熟最終會導致生育力下降。探究EGCG分子在女性生殖系統(tǒng)的抗氧化作用調控機制，有助于改善卵子抗氧化能力，提高卵母細胞成熟率，為提高女性生育相關疾病提供新的診療策略。

谷胱甘肽(glutathione，GSH)是哺乳動物中含巰基的多肽成分，有保護細胞抵抗氧化性損傷的功能，也是卵母細胞活性和發(fā)育潛能的潛在標記物。有研究發(fā)現(xiàn)加入更多ROS后，卵母細胞中谷胱甘肽含量減少，同時卵母細胞成熟受到抑制[29]。Wang等[30]在牛卵母細胞從GV期至MⅡ期體外培養(yǎng)過程中加入不同濃度EGCG進行處理，發(fā)現(xiàn)加入15～20 μmol/L EGCG能夠明顯提高卵母細胞中GSH含量，從而降低細胞內(nèi)ROS的積累，進而提高受精后胚胎的囊胚形成率。然而過低(<10 μmol/L)或過高濃度(>25 μmol/L)EGCG處理體外成熟培養(yǎng)(IVM)的卵母細胞時，卵母細胞GSH含量雖高于對照組，但無顯著差異，對卵母細胞成熟無顯著改善作用。這說明只有適當濃度EGCG可以促進牛卵母細胞體外成熟與卵泡發(fā)育。

外源應激會通過增加氧化應激從而影響卵母細胞的功能，如高熱會破壞卵母細胞的完整性，而一定濃度的EGCG可以抵抗熱應激，從而促進卵母細胞的成熟。在雌性小鼠體內(nèi)注射EGCG(100 mg/kg)后，分別暴露在22℃和40℃的環(huán)境中，可以有效改善體外成熟卵母細胞的發(fā)育，由優(yōu)質卵母細胞發(fā)育而來的胚胎質量也有所提高[31]。

此外，農(nóng)藥成分甲基對硫磷(methyl parathion，MP)的殘留會破壞卵子質量，其方式是通過增加氧化應激降低核成熟率，造成內(nèi)質網(wǎng)、線粒體組分改變和紡錘體分布異常，進而引起細胞質成分紊亂。研究表明，Swiss albino鼠卵母細胞體外成熟培養(yǎng)過程中加入0.25 μmol/L EGCG，可以通過緩解卵母細胞氧化應激和內(nèi)質網(wǎng)應激水平，提高核成熟率、減輕胞質成分紊亂，從而減輕MP(100 μg/ml)對卵母細胞的毒性作用，改善MP所致的卵子成熟障礙[32]。

以上研究表明，EGCG可提高卵子生理和病理狀態(tài)下對抗氧化應激的能力，有效降低外界氧化應激與內(nèi)質網(wǎng)應激損傷的程度。

綜上所述，兒茶素EGCG對卵母細胞的發(fā)育和成熟調控有物種差異性和濃度差異性，EGCG在哺乳動物間具有提高卵母細胞抗氧化應激能力與促進成熟的潛力，可以更進一步提高受精率與胚胎發(fā)育能力。

2.EGCG與胚胎發(fā)育：胚胎在體外培養(yǎng)時，不受母源抗氧化活性物質的保護，其抗氧化活性相較于在體內(nèi)更低，在此環(huán)境中產(chǎn)生的氧自由基可能抑制胚胎的成熟，需要增加抗氧化劑以提高體外培養(yǎng)的胚胎質量[33]。綠茶中的兒茶素EGCG有提高哺乳動物的配子質量和體外受精成功率的潛力[34]。Ahmed等[35]的研究表明EGCG可作為胚胎凍存液中提高抗氧化應激能力的抗氧化劑。

近期有研究報道了EGCG對小鼠受精情況和胚胎發(fā)育的影響。在體外培養(yǎng)卵丘-卵母細胞復合體(cumulus oocyte complex，COCs)的模型中，添加20 μmol/L的EGCG時發(fā)現(xiàn)小鼠成熟卵母細胞COCs內(nèi)GSH濃度顯著提高，并提高了卵母細胞受精率和胚胎發(fā)育率[36]。另有研究在小鼠裸卵細胞培養(yǎng)基中加入不同濃度的EGCG，測量GSH濃度和卵母細胞成熟率、受精率和二細胞發(fā)育率。結果顯示，隨著兒茶素EGCG濃度的增加，卵母細胞成熟率沒有明顯變化，但可以提高胚胎受精率和二細胞的發(fā)育率[37]。這是因為在裸卵培養(yǎng)過程中，由于缺乏顆粒細胞，EGCG不能通過顆粒細胞增加細胞內(nèi)GSH濃度，故經(jīng)過EGCG處理后對胚胎的發(fā)育影響不大。

此外，Spinaci等[38]研究表明，EGCG對胚胎質量的影響具有濃度差異性。在IVM和IVF過程中，加入 0、5、15、20 μg/ml的EGCG對豬胚胎的發(fā)育能力沒有明顯影響，但25 μg/ml劑量的EGCG對豬孤雌生殖胚胎的體外發(fā)育有抑制作用，其發(fā)育到囊胚的數(shù)量有所下降。Li等[39]在IVM培養(yǎng)基中加入不同濃度 EGCG，在加入10 μg/ml EGCG 后，體外激活的豬胚胎中ROS水平較其他組顯著降低，而使用50 μg/ml EGCG處理后培養(yǎng)出的囊胚，每個克隆囊胚的細胞總數(shù)低于其他各對照組(P<0.05)，表明體外培養(yǎng)中過量EGCG可能對胚胎發(fā)育造成損傷，同時體細胞核移植胚胎的質量下降，這顯示了EGCG對豬克隆胚胎的體外發(fā)育可能有負效應。

因此，兒茶素EGCG可以保護哺乳動物胚胎發(fā)育過程中免于氧化作用的影響，提高胚胎受精率和胚胎發(fā)育率。但是過量的EGCG可能會對胚胎的發(fā)育有促進細胞凋亡的作用，引起負性毒性作用，從而影響胚胎發(fā)育。

3.EGCG參與類固醇激素合成及卵泡發(fā)育：類固醇激素在卵泡生長發(fā)育的過程中起著不可或缺的作用，在女性不孕癥的眾多發(fā)病原因中，類固醇甾體激素生成障礙及其引起的卵泡發(fā)育障礙是女性不孕的主要原因[40-41]。卵泡發(fā)育是在顆粒細胞與卵母細胞的相互作用下進行的，卵泡的正常發(fā)育離不開顆粒細胞的分泌作用，而激素分泌異常會造成卵泡發(fā)育停滯或卵泡過度消耗，同時也會進一步加劇機體內(nèi)分泌紊亂。性激素中雌二醇、孕酮和睪酮均屬于類固醇甾體激素。研究發(fā)現(xiàn)兒茶素EGCG可以調控類固醇激素生成和卵泡的發(fā)育，研究EGCG對類固醇激素的調控對女性生殖健康具有重要意義。

有研究討論了兒茶素EGCG處理豬原代顆粒細胞對類固醇激素生成的影響。使用不同濃度EGCG處理豬原代顆粒細胞48 h后，檢測培養(yǎng)基中孕酮和睪酮的濃度，發(fā)現(xiàn)10 μg/ml EGCG處理顆粒細胞后，產(chǎn)生的孕酮較對照組升高2倍左右，而在較低或更高濃度EGCG處理后則沒有顯著差異；同時，在1 μg/ml EGCG處理顆粒細胞后，其睪酮輸出總量升高[42]。另有研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過EGCG處理48 h的豬卵母細胞，檢測到卵丘細胞中胰島素樣生長因子和孕酮水平降低[37]。

此外，EGCG具有促進雌性家兔卵巢細胞凋亡和調控類固醇激素生成的作用。在雌性家兔模型的體外實驗中，分別使用不同濃度EGCG處理家兔的卵巢組織，發(fā)現(xiàn)在低濃度EGCG(1 μg/ml)處理時，孕酮和睪酮的濃度均升高，而較高濃度EGCG(10 μg/ml、100 μg/ml)處理家兔卵巢組織時，孕酮和睪酮的濃度則會降低，而細胞的凋亡均增多；體內(nèi)實驗證實，用常規(guī)和添加兩種含量綠茶的飼料喂養(yǎng)家兔到成年后，較高濃度綠茶飼養(yǎng)的家兔受孕率降低，且成熟卵泡排卵受到抑制，證實EGCG可以降低家兔的卵巢功能和繁殖力[43]。

類固醇激素雄烯二酮是雌酮和睪酮的前體物質，在絕經(jīng)后中國女性的一項研究中，每周各天均飲用綠茶的女性，其血漿中雌酮、雌二醇和雄烯二酮激素均高于對照組女性(每周飲用綠茶小于1次)[44]。

以上研究結果表明，EGCG對類固醇激素的生成有調控作用，但其作用有濃度依賴性，不同濃度的作用效果不相一致。

三、臨床轉化與挑戰(zhàn)

為了提高兒茶素尤其是EGCG的生物活性，一些技術被開發(fā)出來，如基于納米結構的藥物傳遞系統(tǒng)、分子修飾和兒茶素的聯(lián)合給藥等[45]。將EGCG包裹在蛋白質、碳水化合物和脂質基納米顆粒上可以提高EGCG的穩(wěn)定性和胞膜滲透性，并使其得到持續(xù)釋放，從而提高兒茶素的生物利用度。應用分子修飾的方法，如合成過氧乙?；杀Ｗo羥基免受氧化降解，直至其被細胞內(nèi)的酯酶脫乙酰化[46]，減少EGCG的生物轉化和流失。此外，將EGCG適當與其他藥物或生物活性物質共同施用，通過EGCG與所選藥物的相互作用產(chǎn)生協(xié)同效應，可以提高吸收率和抑制細胞轉運體的外排作用[47]。

研究兒茶素EGCG的生物利用度還有很大的發(fā)展空間。目前研究顯示，EGCG作用的疾病靶向性和多分子靶向性有望得到改善，從而找到更有效、更穩(wěn)定和特異性的EGCG活性制劑[47-48]。在改善卵子和胚胎質量、降低氧化應激方面，或可應用持續(xù)低劑量EGCG方案進行治療；在生殖系統(tǒng)腫瘤的治療中，有希望采用EGCG的靶向給藥和快速釋放高劑量方法治療疾病。目前文獻中的證據(jù)尚不支持EGCG作為臨床試驗藥物在女性不孕癥中的應用，這些改進技術的有效性需要進一步的臨床驗證。

四、結語

多個研究結顯果示，EGCG在雌性生殖力的保護和提高生殖力方面具有良好的應用前景。兒茶素EGCG是天然的無毒性氧化應激清除劑，可以調控卵母細胞發(fā)育的各個階段，并參與胚胎發(fā)育、激素生成的調控。不同劑量的EGCG有不同的作用效果，在針對不同生殖系統(tǒng)功能的治療時需要選用最佳劑量。有研究證實，一杯200 ml的普通綠茶中大約含有140 mg的EGCG，每日適當飲茶即可以補充一定量的EGCG[49]。在日常飲食中適當?shù)財z入EGCG，有可能提高女性卵母細胞成熟率，對生育力保護具有一定的積極意義。

綜上所述，EGCG為體外生殖細胞和胚胎培養(yǎng)等臨床應用提供了新方向，對女性生殖系統(tǒng)功能的改善具有良好的應用價值。