我國HIV/TB雙重感染者血清細(xì)胞因子水平的研究

傅雅靜，張子寧，劉飛鷹，成詩明，周林，賴鈺基，唐甜，徐俊杰，韓曉旭，姜擁軍，尚紅

（1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，衛(wèi)生部艾滋病免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽 110001；2.廣西壯族自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心，南寧530000；3.中國疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病預(yù)防控制中心，北京 100000）

結(jié)核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）感染是人類免疫缺陷病毒（human immunodefi?ciency virus，HIV）感染者最為常見的機(jī)會(huì)性感染，兩者共感染可加速各自的疾病進(jìn)程。根據(jù)最新的Me?ta分析結(jié)果顯示，我國HIV感染者的單純結(jié)核（tu?berculosis，TB）感染率為7.2%，而進(jìn)入艾滋病期患者的TB感染率高達(dá)22.8%［1］?？梢姡琀IV/TB雙重感染（簡稱雙感）是艾滋病及結(jié)核防治工作的重大問題之一。

細(xì)胞因子是介導(dǎo)免疫及炎性反應(yīng)的信號蛋白，具有調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、誘導(dǎo)炎性反應(yīng)、影響造血功能、組織細(xì)胞增殖及神經(jīng)—內(nèi)分泌樣效應(yīng)等多種生物學(xué)功能。HIV及TB的感染及發(fā)病均涉及復(fù)雜的細(xì)胞因子變化。研究認(rèn)為，細(xì)胞因子失平衡是TB促進(jìn)HIV病毒復(fù)制和疾病進(jìn)展的機(jī)制之一［2］，但目前對我國HIV/TB雙感人群細(xì)胞因子的表達(dá)情況還未見報(bào)道。本研究以HIV及TB流行較嚴(yán)重的廣西地區(qū)為代表，對單純TB患者、HIV感染者、HIV/TB雙感者及健康對照人群血清細(xì)胞因子水平進(jìn)行研究及比較，探討了我國HIV/TB雙感者細(xì)胞因子變化趨勢及特征，為雙感者的治療從細(xì)胞因子角度提供可靠依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

研究對象：2010年4月至2010年9月間在廣西招募HIV感染者465例，TB患者600例。在HIV感染者中以胸片、痰培養(yǎng)、臨床診斷等方法檢出TB患者。在TB患者中，以第3代ELISA方法篩查并進(jìn)行抗體確認(rèn)實(shí)驗(yàn)檢出HIV感染者。如感染者符合中國疾病預(yù)防與控制中心于2002年頒布的《艾滋病診斷與治療指導(dǎo)方案》開始治療標(biāo)準(zhǔn)，則在征得本人同意后，開展標(biāo)準(zhǔn)化HAART治療。依據(jù)上述程序，納入未接受HAART治療且愿意參加本研究的HIV/TB雙感者15例，接受HAART治療雙感者5例；單純HIV感染者13例，接受治療單純HIV感染者4例；單純TB患者10例及健康對照17例（表1）。截止采樣時(shí)間點(diǎn)，所有接受HAART治療感染者治療持續(xù)時(shí)間均在1年以內(nèi)。收集HIV/TB雙感、單純HIV感染及單純TB患者人口學(xué)信息、HIV及TB感染的流行病學(xué)信息、結(jié)核痰涂片鏡檢結(jié)果等臨床檢測信息。采集EDTA抗凝全血、血清及血漿標(biāo)本。本研究內(nèi)容獲得參加者的書面知情同意。

表1 研究對象的基本信息Tab.1 The characteristics of study subjects

1.2 方法

1.2.1 8種細(xì)胞因子的檢測：取25μL血清標(biāo)本，選用Bio Plex懸浮芯片檢測儀器及試劑（BIO RAD公司，美國）統(tǒng)一測定IL?2、IL?4、IL?6、IL?8、IL?10、IFN?γ、TNF?α、GM?CSF等8種血清細(xì)胞因子水平并設(shè)平行孔。全部操作按照操作說明書進(jìn)行。

1.2.2 CD4+T細(xì)胞絕對值檢測：CD4+T細(xì)胞絕對值依據(jù)1997年美國CDC關(guān)于HIV感染者CD4+T細(xì)胞檢測指導(dǎo)方法，應(yīng)用TruCOUNT管、FACSCalibur流式細(xì)胞儀及MULTISET軟件（BD公司，美國）檢測。

1.2.3 HIV病毒載量檢測：取1 mLEDTA抗凝血漿，采用COBAS@AmpliPrep@/COBAS@TaqMan@System自動(dòng)載量儀及COBAS@AmpliPrep/COBAS@Taq?Man@HIV?1Test試劑盒（Roche公司，德國）測定病毒載量，全部操作按照操作說明書進(jìn)行。檢測范圍為40 拷貝/mL~1×107拷貝/mL。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSSl7.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。細(xì)胞因子數(shù)據(jù)用x±s表示，采用Mann?Whitney U檢驗(yàn)分析比較各組間的實(shí)驗(yàn)指標(biāo)，采用Spearman秩相關(guān)做相關(guān)性分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 單純HIV感染者與健康對照血清細(xì)胞因子水平的比較

在13例單純HIV感染者及17例健康對照者8種血清細(xì)胞因子的比較中，發(fā)現(xiàn)HIV感染者血清IL?8為（117.36±27.60）pg/mL，健康對照為（892.63±291.93）pg/mL（表2），2組人群比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01）（圖1A）。其他7種血清細(xì)胞因子比較差異未見統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 單純TB患者及HIV/TB雙感者與健康對照血清細(xì)胞因子水平的比較

在10例單純TB患者、15例HIV/TB雙感者與17例健康對照者8種血清細(xì)胞因子的比較中，發(fā)現(xiàn)TB患者血清IL?10及TNF?α水平分別為（0.50±0.29）pg/mL及（117.68±56.47）pg/mL，HIV/TB雙感者分別為（1.85±0.84）pg/mL及（157.23±84.01）pg/mL，健康對照2種細(xì)胞因子分別為0及（35.89±26.94）pg/mL（表2），TB患者及HIV/TB雙感者較健康對照IL?10及TNF?α 2種細(xì)胞因子均顯著升高（TB：P=0.02，P=0.01；HIV/TB：P=0.02，P<0.00；圖1B、1C）。其他6種血清細(xì)胞因子水平未見明顯差異。

2.3 HIV/TB雙感者TB痰涂片鏡檢結(jié)果與血清細(xì)胞因子水平的關(guān)系

經(jīng)TB痰涂片鏡檢，15例HIV/TB雙感者中8例為TB痰涂片鏡檢陽性，7例為陰性，根據(jù)鏡檢結(jié)果將雙感者分為痰涂陽和痰涂陰2組，比較2組間血清細(xì)胞因子水平。結(jié)果顯示，HIV/TB雙感者GM?CSF水平顯著升高（P=0.04），IL?10、TNF?α及其他5種細(xì)胞因子未見明顯組間差異。

表2 單純HIV感染者、TB患者、HIV/TB雙感者及健康對照血清8種細(xì)胞因子水平（pg/mL）Tab.2 The eight serum cytokine levels in HIV，TB and HIV/TB co?infection patients（pg/mL）

圖1 單純HIV感染者、TB患者及HIV/TB雙感者與健康對照細(xì)胞因子水平的比較Fig.1 Comparisons of cytokine levels among HIV，TB，HIV/TB patients and healthy controls

2.4 單純HIV感染者與HIV/TB雙感者HIV病毒載量及血清細(xì)胞因子水平的比較

比較13例單純HIV感染者與15例HIV/TB雙感者HIV病毒載量及血清細(xì)胞因子水平，發(fā)現(xiàn)雙感者HIV病毒載量顯著高于單純HIV感染者（P=0.02）（圖2A），血清IL?6、IL?8、IFN?γ、TNF?α等4種前炎性因子在HIV/TB雙感者組中顯著升高（P=0.02，P=0.01，P=0.02，P<0.00，圖2B~2E）。

圖2 單純HIV感染者與HIV/TB雙感者HIV病毒載量及血清細(xì)胞因子水平的比較Fig.2 Comparisons of cytokine levels and HIV viral load between HIV and HIV/TB co?infection patients

2.5 HAART治療對單純HIV感染者及HIV/TB雙感者血清細(xì)胞因子水平的改善

在單純HIV感染者及HIV/TB雙感者2組中，將研究對象按照是否接受HAART治療分別分為2組，組間進(jìn)行8種血清細(xì)胞因子檢測結(jié)果的比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相較未治療者，接受治療的HIV/TB雙感者血清TNF?α水平出現(xiàn)下降趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表3）。

表3 HAART治療對單純HIV感染者及HIV/TB雙感者血清細(xì)胞因子水平的改善（pg/mL）Tab.3 The influence of HAART on the cytokine levels in HIV and HIV/TB co?infection patients（pg/mL）

3 討論

MTB與HIV能夠相互促進(jìn)疾病進(jìn)展，造成雙感者高感染率及死亡率［3，4］。細(xì)胞因子在HIV/TB雙感者疾病進(jìn)展過程中發(fā)揮重要作用，但目前對雙感者細(xì)胞因子的分泌表達(dá)模式尚存在爭議。研究顯示，美國HIV/TB雙感者外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）主要以Th1類細(xì)胞因子分泌為主，同時(shí)伴有Th2類細(xì)胞因子的下降。另有對歐美人群的研究發(fā)現(xiàn)HIV/TB雙感者全血及肺泡灌洗液以IL?4等Th2細(xì)胞因子為主［5］。Wallis等［6］對烏干達(dá)HIV/TB雙感者的研究中發(fā)現(xiàn)HIV/TB雙感者較單純HIV感染者TNF?α增高3~10倍。但Sauk?konen等［7］的體外研究卻顯示，HIV感染者的細(xì)胞感染TB后TNF?α分泌量明顯下降。提示研究對象及樣本來源都會(huì)對細(xì)胞因子的研究結(jié)果產(chǎn)生影響。

本研究對我國廣西地區(qū)HIV/TB雙感、單純感染及健康對照者血清細(xì)胞因子進(jìn)行直接檢測及比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)單純HIV感染者前炎性因子IL?8水平低于健康對照，與國外研究結(jié)果類似［10，11］。單純TB及HIV/TB雙感者與健康對照比較，單純TB感染者IL?10及TNF?α水平明顯升高，HIV/TB雙感者上升更加顯著，提示TB使機(jī)體傾向于這2種細(xì)胞因子的分泌及表達(dá)失平衡。TNF?α是加速結(jié)核性肉芽腫形成的主要細(xì)胞因子，而且作為前炎性因子，能導(dǎo)致T細(xì)胞活化水平的升高及組織細(xì)胞損傷、壞死；IL?10作為抑制性細(xì)胞因子，可以抑制Th1類免疫反應(yīng)，促進(jìn)TNF?α作用及纖維化［2，12］。 North等［8］發(fā)現(xiàn)不產(chǎn)生IL?10的小鼠可以抵抗MTB的感染，因此HIV/TB雙感者高水平的IL?10及TNF?α可能加速了HIV及TB疾病進(jìn)展及惡化，是雙感者疾病進(jìn)展快、死亡率高的機(jī)制之一。本研究組進(jìn)一步研究了雙感者體內(nèi)MTB活躍程度對細(xì)胞因子水平的影響。按照TB痰涂片鏡檢結(jié)果，將HIV/TB雙感人群分為痰涂片鏡檢陽性及陰性2組，僅發(fā)現(xiàn)痰涂片鏡檢陽性者炎性因子GM?CSF高于陰性者，其他細(xì)胞因子均未見顯著差異，提示TB的活躍程度與HIV/TB雙感者血清IL?10及TNF?α的升高無明顯的相關(guān)性。Amirayan?Chevillard等［9］亦報(bào)道單純HIV感染即可導(dǎo)致IL?10及TNF?α水平的升高，提示雙感者體內(nèi)IL?10及TNF?α2種細(xì)胞因子的顯著升高不僅是MTB活躍程度的表現(xiàn)，也可能是MTB和HIV之間復(fù)雜的相互的結(jié)果。

Alberti等［10］的研究證實(shí)CD4+T細(xì)胞數(shù)量本身即可造成細(xì)胞因子分泌及表達(dá)水平的差異。以往針對HIV/TB雙感者細(xì)胞因子的研究僅注重細(xì)胞因子本身的變化，忽略了CD4+T細(xì)胞數(shù)量對機(jī)體細(xì)胞因子平衡的影響。因此，本研究在研究對象的選擇上，將HIV/TB雙感與單純HIV感染者CD4+T細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行匹配，以消除細(xì)胞數(shù)量本身對于研究結(jié)果的影響。與Bal等［11］的研究結(jié)果相似，在單純HIV感染及HIV/TB雙感2組的比較中，發(fā)現(xiàn)IL?6、IL?8、IFN?γ、TNF?α等前炎性因子在雙感者體內(nèi)顯著升高。在2組間CD4+T細(xì)胞數(shù)量沒有明顯差異的情況下，HIV/TB雙感者HIV病毒載量顯著高于單純HIV感染者組，提示MTB與HIV共同作用產(chǎn)生了大量前炎性因子，這些異常增高的前炎性因子在促進(jìn)細(xì)胞活化及炎癥等免疫反應(yīng)的同時(shí)，加速了HIV病毒復(fù)制，導(dǎo)致疾病進(jìn)展。

有效的HAART治療可以將HIV病毒控制在檢測限以下，降低HIV相關(guān)機(jī)會(huì)性感染的發(fā)病率和死亡率，患者CD4+T細(xì)胞數(shù)量上升，但在一定程度上無法恢復(fù)病毒造成的T細(xì)胞功能損傷。細(xì)胞因子失平衡造成免疫反應(yīng)異常，是T細(xì)胞功能損傷的機(jī)制之一［12］。Aiuti等［13］亦認(rèn)為HAART治療后細(xì)胞因子平衡的恢復(fù)是免疫重建的標(biāo)志。目前就HAART治療對細(xì)胞因子表達(dá)譜的恢復(fù)情況尚存在爭議，Amirayan?Chevillard等［9］報(bào)道HAART治療能夠恢復(fù)HIV感染者TNF、IL?1、IL?6及IL?10等細(xì)胞因子水平，有研究則顯示HAART治療并沒有使感染者TNF?α水平得到恢復(fù)。HAART治療是否可以改善HIV/TB雙感者體內(nèi)細(xì)胞因子的失平衡狀態(tài)尚未見報(bào)道。本研究在HIV及HIV/TB兩人群中按照是否接受HAART治療分別分為2組，發(fā)現(xiàn)接受治療的HIV/TB雙感者與未治療者相比，血清TNF?α水平出現(xiàn)下降趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與本研究中感染者治療時(shí)間短有關(guān)。提示對于HIV/TB雙感者施以有效的HAART治療可能有助于感染者體內(nèi)部分細(xì)胞因子水平的恢復(fù)，但需要長期有效治療。

綜上所述，本研究對我國廣西地區(qū)細(xì)胞因子在單純TB、HIV及HIV/TB雙感者血清細(xì)胞因子水平進(jìn)行了比較系統(tǒng)的研究及分析，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子的失衡在HIV及HIV/TB雙重感染疾病進(jìn)展中均發(fā)揮了重要作用，為探討HIV感染中機(jī)會(huì)性感染的發(fā)生機(jī)制等提供了有效信息。

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