隱丹參酮聯合順鉑作用于非小細胞肺癌PC9細胞的體外研究

許冠華雷俊華金麗莎陳 喆

1浙江中醫(yī)藥大學 杭州310006 2海南醫(yī)學院附屬醫(yī)院腫瘤內科3浙江省中醫(yī)院中心實驗室

·論 著·

隱丹參酮聯合順鉑作用于非小細胞肺癌PC9細胞的體外研究

許冠華1雷俊華2金麗莎1陳 喆3

1浙江中醫(yī)藥大學 杭州310006 2海南醫(yī)學院附屬醫(yī)院腫瘤內科3浙江省中醫(yī)院中心實驗室

目的 觀察隱丹參酮（CPT）聯合順鉑（DDP）對非小細胞肺癌PC9細胞的抗腫瘤作用及其分子機制。方法 肺癌PC9細胞分為對照組、隱丹參酮組、順鉑組及聯合用藥組，MTT法檢測細胞增殖凋亡，免疫印跡技術、RT-PCR檢測抗凋亡分子的表達、STAT3及上游調控激酶JAK2/SRC蛋白表達水平及磷酸化水平。結果 隱丹參酮聯合順鉑有明顯抑制肺癌PC9細胞增殖作用（P＜0.05），聯合用藥組作用于肺癌PC9細胞24h后，caspase 3和caspase 9及PARP剪切段蛋白表達明顯增高，高于對照組及單藥組；聯合用藥組Mcl-1、Bcl-2、XIAP、survivin抗凋亡蛋白表達下調（P＜0.05或P＜0.01），STAT3磷酸化Tyr705和ser727水平下降，其上游JAK2磷酸化水平下調，SRC蛋白及磷酸化水平變化不明顯。結論 隱丹參酮聯合順鉑具有協(xié)同抗肺癌PC9細胞作用，其作用機制可能是通過抑制STAT3磷酸化Tyr705和ser727表達水平，進而下調Mcl-1、Bcl-2、XIAP、Survivin蛋白的表達，上調caspase 3和caspase 9及PARP剪切段蛋白表達。

非小細胞肺癌；PC9細胞；隱丹參酮；順鉑

目前，肺癌是全世界發(fā)病率和死亡率最高的腫 瘤，5年生存率僅為10%～15%[1-2]。晚期非小細胞肺癌標準一線治療仍為含鉑兩藥聯合方案化療[3]，化療對改善病情有一定效果，但同時對正常組織也存在毒性。本研究以隱丹參酮、順鉑單藥及兩藥聯合作用于肺癌PC9細胞，探討隱丹參酮聯合順鉑對人肺癌PC9細胞增殖、凋亡的影響及其作用機制，為隱丹參酮治療腫瘤尋求理論依據。

1 實驗材料

1.1 藥材與試劑 隱丹參酮購自成都曼思特生物科技有限公司（批號MUST-11081109）；順鉑購自德州德藥有限公司（批號130303）；多克隆兔一抗Bcl-2、Bcl-xl、Bax、Bak、Mcl-1、survivin、XIAP、P-STAT3-tyr705/ser727、jak2、P-jak2、src、P-src均購自CST公司；多克隆兔一抗STAT3、β-Actin均購自CST公司；多克隆兔/鼠二抗均購自CST公司；逆轉錄試劑盒/iTaq Universal SYBR Green Supermix購自Bio-Rad公司杭州寶成生物科技有限公司銷售商。

1.2 細 胞 PC9細胞購自中國科學院細胞庫。

1.3 儀 器 CO2細胞培養(yǎng)箱，Thermo公司；超凈工作臺，蘇州精華設備公司；多功能全波長酶標儀，Thermo公司；蛋白印記檢測系統(tǒng)，Bio-Rad公司；超低溫冰箱，SANYO；凝膠成像系統(tǒng)，Bio-Rad公司；熒光定量PCR儀，RD公司。

2 實驗方法

2.1 細胞培養(yǎng) PC9細胞復蘇后以2×106/mL密度接種于25cm2的細胞培養(yǎng)瓶中，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，置37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，待細胞生長至80%～90%時用0.1%胰酶消化并傳代，選取對數生長期的PC9細胞用于實驗。

2.2 MTT法檢測細胞增殖活性 取對數生長期的PC9細胞，消化計數后，按（6～9）×103個細胞/200μL/孔接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24h待細胞貼壁后，用不同濃度的隱丹參酮、順鉑及隱丹參酮與順鉑聯合應用處理，每孔設3個復孔。用MTT法分別檢測藥物與腫瘤細胞作用24、48、72h后的吸光度值（OD），各平行孔的OD值取平均數，將各測試孔的OD值減去本底OD值。計算腫瘤細胞的抑制率：抑制率=（1-給藥孔平均光密度值/對照組平均光密度值）×100%。

2.3 免疫印跡技術檢測藥物作用PC9細胞凋亡標記蛋白表達 取對數生長的PC9細胞，隱丹參酮、順鉑及聯合應用處理24h后收集，加入細胞裂解液，冰上放置30min，每10min振蕩1次，離心13 300r/min 15min，取上清，以BSA法作蛋白定量后置-30℃貯存?zhèn)溆?。灌?0%SDS-聚丙烯酰胺凝膠，常規(guī)電泳，轉膜，封閉，一抗（1:1000），4℃孵育過夜，二抗（1: 1000），室溫孵育2h，ECL顯色。檢測Cleaved-PARP/ caspase3/caspase9等凋亡標記蛋白酶原和剪切活化片段的表達水平，β-Actin檢測作為對照，進行細胞間蛋白表達的比較。

2.4 免疫印跡技術、RT-PCR檢測PC9細胞抗凋亡分子蛋白表達水平和凋亡抑制因子基因轉錄水平取對數生長的PC9細胞，隱丹參酮、順鉑及聯合應用處理24h后收集，加入細胞裂解液，冰上放置30min，每10min振蕩1次，13 300r/min離心15min，取上清，以BSA法作蛋白定量后置-30℃貯存?zhèn)溆?。灌?0% SDS-聚丙烯酰胺凝膠，常規(guī)電泳，轉膜，封閉，一抗（1:1000），4℃孵育過夜，二抗（1:1000），室溫孵育2h，ECL顯色。檢測抗凋亡蛋白Mcl-1、Bcl-2、Bcl-xl、survivin、XIAP和促凋亡蛋白Bak、Bax的表達，β-Actin檢測作為內對照，進行細胞間蛋白表達的比較。

人非小細胞肺癌細胞系PC9接種于6孔板，2× 105個細胞/孔，培養(yǎng)過夜至對數生長期。隱丹參酮組、順鉑組、隱丹參酮/順鉑聯合組分別作用12h，空白設為對照組，TRIZON提取RNA，逆轉錄完成后熒光定量PCR技術檢測Bcl-2、Survivin凋亡抑制因子基因轉錄水平。

2.5 免疫印跡技術檢測隱丹參酮聯合順鉑對PC9細胞STAT3及上游調控激酶Jak2/Src蛋白表達水平及磷酸化水平 隱丹參酮單藥組、順鉑單藥組、隱丹參酮/順鉑聯合組處理4h后，空白組設置為對照組。RIPA裂解液提取總蛋白，免疫印跡檢測STAT3及其上游調控激酶Jak2/Src表達水平和磷酸化水平。

2.6 統(tǒng)計學方法 應用SPSS17.0軟件實驗數據用均數±標準差（±s）表示，采用多因素方差分析。P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

3 實驗結果

3.1 對PC9細胞增殖作用的影響 隱丹參酮、順鉑及聯合用藥作用于PC9細胞后，MTT結果發(fā)現隱丹參酮10μM、順鉑5μg/mL具有明顯的協(xié)同抗非小細胞肺癌PC9細胞效應，且隨著作用時間的延長，其抑制作用增強。見圖1（封二）。統(tǒng)計各藥物作用于PC9細胞存活率，與空白組比較，各用藥組24、48、72h PC9細胞存活率均明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）；隱丹參酮+順鉑組細胞存活率明顯降低（P＜0.05）。見表1。

3.2 PC9細胞凋亡標記性蛋白表達 隱丹參酮10μM、順鉑5μg/mL及聯合用藥分別作用于PC9細胞24h，觀察caspase 3、caspase 9及PARP剪切段蛋白的表達，β-actin作為內參。結果顯示，隱丹參酮及順鉑單藥組作用于 PC9細胞后 caspase 3、caspase 9及PARP剪切段蛋白表達不明顯，而兩藥聯合組caspase 3和caspase 9及PARP剪切段蛋白表達明顯增高，見圖2（封二）。

表1 各組PC9細胞24、48及72h存活率比較（±s） %

表1 各組PC9細胞24、48及72h存活率比較（±s） %

注：與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與隱丹參酮組和順鉑組比較，△P＜0.05

組別空白對照組隱丹參酮組順鉑組隱丹參酮+順鉑組n/孔3333 24h 100 92.22±2.75* 85.19±2.4** 47.47±1.62*△48h 100 86.54±1.60* 73.99±0.98** 38.53±2.46**△72h 100 73.89±1.46** 59.14±0.89* 30.49±2.51*△

3.3 PC9細胞凋亡相關蛋白表達 隱丹參酮10μM聯合順鉑5μg/mL作用于PC9細胞24h下調Mcl-1、Bcl-2、survivin、XIAP蛋白的表達，bax、bak、bcl-xl蛋白水平變化不明顯。見圖3（封二）。

3.4 PC9細胞抗凋亡因子mRNA表達水平 隱丹參酮組、隱丹參酮+順鉑組作用于PC9細胞12h，抗凋亡因子Bcl-2、survivinm mRNA表達水平均下調（P＜0.05或P＜0.01）。隱丹參酮+順鉑組Bcl-2、survivin下調更顯著（P＜0.05）。見表2。

表2 各組PC9細胞Bcl-2、survivin比較（±s）

表2 各組PC9細胞Bcl-2、survivin比較（±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與隱丹參酮組和順鉑組比較，△P＜0.05

組別空白對照組隱丹參酮組順鉑組隱丹參酮+順鉑組n/孔3333 Bcl-2 1 0.89±0.04* 1.22±0.03* 0.48±0.28**△survivin 1 0.82±0.01* 1.33±0.09** 0.32±0.02*△

3.5 藥物作用4h PC9細胞STAT3及上游調控激酶JAK2/SRC蛋白表達水平及磷酸化水平 隱丹參酮10μM聯合順鉑5μg/mL作用于PC9細胞4h，STAT3磷酸化Tyr705和ser727表達水平下降，其上游調控激酶JAK2磷酸化表達下降，SRC磷酸化表達水平變化不明顯，見圖4～5（封二）。

4 討論

隱丹參酮是丹參的脂溶性成分之一，具有菲醌結構，菲醌結構中包含的菲環(huán)結構可與DNA結合，且呋喃環(huán)和醌類結構可產生自由基，引起DNA損傷，從而抑制腫瘤細胞DNA的合成[5]。

caspase家族蛋白酶在細胞凋亡信號傳導中起著關鍵性作用。陳春雷等[6]研究提示隱丹參酮能明顯抑制人膽管癌HCCC-9810細胞的增殖，其作用機制是通過下調survivin基因表達及上調caspase-3蛋白表達來誘導HCCC-9810細胞凋亡。本研究發(fā)現，順鉑和隱丹參酮均能抑制肺癌PC9細胞增殖并誘導其凋亡，但兩藥聯合后增殖抑制作用和凋亡誘導作用顯著高于單用順鉑或隱丹參酮，兩藥聯合進一步增加了PC9細胞caspase 3和caspase 9的活化和PARP剪切段蛋白的表達，提示隱丹參酮能夠通過調控caspases家族增強順鉑對肺癌PC9細胞的凋亡誘導作用。

信號傳導與轉錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）與腫瘤發(fā)生、轉移侵襲、腫瘤新生血管生成、化療抗性密切相關[7]。STAT3蛋白通過SH2結構域相互結合形成二聚體，迅速移位至核內，與特異的DNA啟動子序列結合，啟動相應的基因如抗凋亡基因Bcl-2、Bcl-Xl、Mcl-1、Xiap和survivin、細胞周期調控基因cyclin D1和c-myc、血管生成因子VEGF、基質金屬酶mmp2/9表達，促進腫瘤細胞增殖、存活、凋亡抗性、腫瘤新生血管形成及轉移侵襲[8]。應用免疫印跡技術檢測Bcl-2家族成員表達，提示隱丹參酮聯合順鉑下調Mcl-1、Bcl-2、survivin、XIAP蛋白表達。

最新研究發(fā)現[9]，抑制STAT3酪氨酸Tyr705水平可阻斷腫瘤細胞異?；罨腟TAT3信號通路，進而促腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤新生血管形成和轉移侵襲，與化療藥物聯合應用可發(fā)揮增效減毒的功效。

本研究結果顯示，隱丹參酮聯合順鉑作用于PC9細胞通過抑制STAT3磷酸化Tyr705和ser727表達水平進而下調Mcl-1、Bcl-2、XIAP、Survivin蛋白的表達及Bcl-2、Survivin的基因轉錄水平；提示隱丹參酮聯合順鉑協(xié)同抗腫瘤機制與其通過抑制STAT3磷酸化途徑有關。今后將在此基礎上進一步研究其抗腫瘤的深層次機制，為隱丹參酮聯合順鉑開發(fā)為臨床用藥提供重要的實驗依據。

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Effect of Cryptotanshinone Combined with Cisplatin on Non-small-cell Lung Cancer Cell PC9

XU Guan-hua1，LEI Junhua2，JIN Lisha1，CHEN Zhe3. 1.Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou（310006），China；2.Department of Oncology,Hospital affiliated to Hainan Medical College；3.Central Laboratory，Zhejiang Provincial Hospital of TCM.

Objective To study the effect of cryptotanshinone in combination of cisplatin on non-small-cell lung cancer（NSCLS）cell PC9 and its underlying molecular mechanism.Methods PC9 cells were divided into four groups:control,cryptotanshinone,cisplatin,and the combination of cryptotanshinone and cisplatin,the cells in each group were treated with the corresponding drugs.Apoptosis was assayed by MTT;protein markers of apoptosis and the protein expression and phosphorylation of STAT3 and JAK2/SRC were detected by immunoblotting and RTPCR.Results Cryptotanshinone combined with cisplatin significantly inhibited the proliferation of lung cancer PC9 cells（P＜0.05）.After treated with the combination of cryptotanshinone and cisplatin for 24h,the expression of cleaved caspase 3,cleaved caspase 9 and cleaved PARP in PC9 cells were significantly higher than that of control group and single drug groups;compared to other groups,the expression of protein markers of apoptostic Bcl-2,Mcl-1 and XIAP were reduced,STAT3 phosphorylation on Tyr705 and ser727 was decreased,and the upstream JAK2 phosphorylation level was lowered in the combination group（P＜0.05 or P＜0.01）,but the protein expression and phosphorylation of SRC did not differ.Conclusion Cryptotanshinone combined with cisplatin has synergistic effect on PC9 cells,which may be done by inhibiting the expression of STAT3 phosphorylation on Tyr705 and ser727, then downregulating the expression of Mcl-1,Bcl-2,XIAP and Survivin proteins and increasing the expression of cleaved caspase3,cleaved caspase 9,and cleaved PRAP.

non-small-cell lung cancer；PC9 cells；cryptotanshinone；cisplatin

2014-06-07

修回日期：2014-08-01

浙江省自然科學基金（No.LY13H290014）