大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎模型的快速建立*

蔡煒，張齊梅，賀曉萍，王忠朝，蔣俊強(qiáng)(瀘州醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院:口腔內(nèi)科；修復(fù)科，四川瀘州646000)

大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎模型的快速建立*

蔡煒，張齊梅1，賀曉萍，王忠朝1，蔣俊強(qiáng)1
(瀘州醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院:口腔內(nèi)科；1修復(fù)科，四川瀘州646000)

目的:探討如何快速建立大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎模型，為開展牙周病的病因及防治的研究提供簡便可靠的造模方法。方法: 20只5周齡SD大鼠，采取“牙齦劃割+鋼絲結(jié)扎+牙周炎患者細(xì)菌培養(yǎng)物沖洗+高糖飲食”的辦法進(jìn)行造模，在第2周末和第4周末觀察牙齦炎癥、牙周袋深度及牙松動度、牙槽骨吸收情況等指標(biāo)，確認(rèn)是否成功建模。結(jié)果:在第4周末實(shí)驗(yàn)牙牙槽骨吸收已深達(dá)根尖，其余指標(biāo)也均顯示成功建立了大鼠重度牙周炎模型。結(jié)論:使用該方法能夠比較快速簡便的構(gòu)建大鼠重度牙周炎模型，從而有效模擬臨床牙周炎發(fā)展進(jìn)程，為牙周病的病因研究及臨床防治提供依據(jù)。

大鼠；牙周炎；動物模型

牙周病是一種很常見、多發(fā)的導(dǎo)致牙周支持組織破壞的炎癥性疾病，是導(dǎo)致成年人失牙的最主要原因[1]。據(jù)統(tǒng)計，牙周炎約占拔牙原因的30%～44%。對牙周炎的病因以及防治的研究一直是口腔臨床科學(xué)研究的重點(diǎn)之一。牙周疾病的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，對于了解牙周病在人體的起源和演變的病理至關(guān)重要，也是新的生物材料和治療手段進(jìn)入臨床試驗(yàn)前的必要步驟。猴子、狗、兔子、大鼠、雪貂等動物是目前最主要的造模動物。但是由于大型動物造模受實(shí)驗(yàn)條件、社會倫理問題的限制，在大多數(shù)情況下，使用大鼠模型成為牙周病研究的一個熱點(diǎn)[2]。建立快速簡便、穩(wěn)定可靠的牙周炎動物模型可以為牙周病病因研究提供科學(xué)可信的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，對牙周炎的病因及防治的研究具有積極的意義。本文參照并綜合了謝國秀、吳亞菲、程玨等學(xué)者[3-5]的牙周炎動物模型構(gòu)造方法并加以改進(jìn)，以望得到一種快速構(gòu)建大鼠牙周炎動物模型的有效方法。

1 材料與方法

選取5周齡SD大鼠20只，體重220±20 g（瀘州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供）。30 g/L戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉、固定后，采用眼科彎剪對右側(cè)上頜第二磨牙周圍牙齦劃割剝離。兩天后再次麻醉大鼠后于該部位重復(fù)劃割1次，采用正畸鋼絲結(jié)扎右上第二磨牙牙頸部，鋼絲盡量深入齦溝，并將結(jié)扎絲頭部埋入牙齦。對臨床重度牙周炎患者深牙周袋內(nèi)細(xì)菌使用滅菌紙尖取樣，將紙尖放入兼性厭氧轉(zhuǎn)送管管底后接種于布氏血瓊脂培養(yǎng)基（BRB）厭氧培養(yǎng)48 h。將細(xì)菌培養(yǎng)產(chǎn)物的稀釋液0.5ml對實(shí)驗(yàn)大鼠口腔進(jìn)行沖洗，隔日1次，連續(xù)3次。大鼠左側(cè)磨牙不做特殊處理，作為自身對照。予以10%的白砂糖水和白砂糖水浸泡的軟飼料對所有大鼠進(jìn)行喂養(yǎng)。

實(shí)驗(yàn)2周后隨機(jī)斷頸處死5只大鼠進(jìn)行牙齦指數(shù)、牙周袋深度、牙松動度、牙槽骨吸收量等指標(biāo)的實(shí)驗(yàn)觀察。在實(shí)驗(yàn)4周末隨機(jī)采取5只大鼠右上頜第二磨牙齦下菌斑進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)和鑒定。并將全部大鼠全部處死后進(jìn)行牙齦指數(shù)、牙周袋深度、牙松動度、牙槽骨吸收量等的實(shí)驗(yàn)觀察以及組織病理學(xué)檢查。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 一般情況

實(shí)驗(yàn)開始后1周內(nèi)有3只大鼠死亡。其余大鼠開始出現(xiàn)躁動不安，食欲下降、毛色不順等癥狀，隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)展，逐漸變?yōu)槲也徽瘢氲∩賱?，食欲低下，皮毛糾結(jié)等癥狀。

實(shí)驗(yàn)開始3 d后出現(xiàn)大鼠右上第二磨牙牙齦紅腫，探診出血，逐漸發(fā)展為牙齦明顯腫脹暗紅，大量食物殘渣存留，到實(shí)驗(yàn)結(jié)束前甚至出現(xiàn)大鼠實(shí)驗(yàn)牙牙齦自發(fā)性出血。

2.2 牙周袋深度變化

牙周袋深度：在實(shí)驗(yàn)第2周末進(jìn)行檢查，實(shí)驗(yàn)牙平均牙周袋深度為1.4mm，第4周末，實(shí)驗(yàn)牙平均牙周袋深度3.9mm。

2.3 磨牙松動情況

在實(shí)驗(yàn)開始的第2周末實(shí)驗(yàn)大鼠右上第二磨牙未出現(xiàn)明顯松動，但到第4周實(shí)驗(yàn)結(jié)束，所有實(shí)驗(yàn)牙都已經(jīng)發(fā)展到Ⅲ°松動。

2.4 牙槽骨吸收情況

牙槽骨吸收情況：將大鼠右側(cè)上頜骨的牙齦及骨膜剔除干凈，用0.2mol/LNaOH處理5min去除殘留的軟組織后自然風(fēng)干，測量牙釉牙骨質(zhì)界（CEJ）到牙槽嵴的距離。大鼠正常牙槽嵴頂位于釉牙骨質(zhì)界下約0.3mm，作為正常自身對照的左側(cè)牙槽骨在實(shí)驗(yàn)期間無明顯改變。第2周末時，實(shí)驗(yàn)牙牙槽骨出現(xiàn)凹坑狀吸收，平均嵴頂在釉牙骨質(zhì)界下約1.2mm，而到第4周末，實(shí)驗(yàn)牙牙槽骨吸收均已深達(dá)根尖（見圖1）。2.5病理學(xué)改變

組織病理學(xué)改變情況：分離實(shí)驗(yàn)區(qū)上頜骨，截取磨牙段，4%中性甲醛固定，EDTA脫鈣，梯度酒精脫水，石蠟包埋。取第二磨牙切片（5μm），常規(guī)HE染色，光鏡觀察。見根尖牙槽骨破壞明顯，牙周韌帶不連續(xù)，呈現(xiàn)斷裂、溶解破壞，周圍有大量密集炎性細(xì)胞浸潤(見圖2)。

圖1 左側(cè)為對照牙牙槽骨情況，未見吸收；右側(cè)顯示第4周末實(shí)驗(yàn)牙牙槽骨吸收已深達(dá)根尖

圖2 病理組織切片，見根尖骨質(zhì)破壞，牙周韌帶斷裂，大量炎性細(xì)胞（HE×100）

2.6 細(xì)菌培養(yǎng)情況

細(xì)菌培養(yǎng)情況：在實(shí)驗(yàn)第四周末隨機(jī)抽取5只大鼠進(jìn)行牙周袋袋內(nèi)細(xì)菌取樣，并將對側(cè)對照磨牙齦溝液取樣，稀釋后劃種于非選擇性的厭氧菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基（CDC）和伴放線桿菌（Aa）選擇性培養(yǎng)基（TSBV）上，37℃厭氧培養(yǎng)72 h以上，挑取不同形態(tài)菌落，根據(jù)菌落、菌體特征、耐氧試驗(yàn)，部分加做生化反應(yīng)作出鑒定。結(jié)果見表1。說明沖洗可以將重度牙周炎患者的牙周可疑致病菌順利接種到大鼠口腔，并在造模形成的深牙周袋內(nèi)檢出。

表1 造模牙周袋和正常齦溝細(xì)菌培養(yǎng)情況

3 討論

3.1 本造模方法的主要優(yōu)點(diǎn)

目前報道的構(gòu)建大鼠重度牙周炎模型的方法需要4周到8周不等[4-7]。本實(shí)驗(yàn)對已有造模方法進(jìn)行綜合和改進(jìn)，期望能夠更快構(gòu)建該模型，但從最終效果來看，仍然需要4周的時間才能夠造模成功，并不比已有方法更快捷。但本方法相對簡單，同時建模效果相當(dāng)穩(wěn)定，應(yīng)該是構(gòu)建大鼠重度牙周炎模型的一種可供選擇的方法。

現(xiàn)有方法包括單純“局部因素”造?；颉熬植恳蛩?全身因素”造模[8]，結(jié)合全身因素（如應(yīng)用激素或免疫抑制劑等）造模的最大缺點(diǎn)在于周期較長、死亡率高、操作不方便、模型不穩(wěn)定、個體差異大等，導(dǎo)致造模效果不是很確定。本實(shí)驗(yàn)采取了“劃割+鋼絲結(jié)扎+牙周炎患者細(xì)菌培養(yǎng)物沖洗+高糖飲食”的辦法，綜合應(yīng)用了最主要的局部刺激因素造模，效果比較穩(wěn)定。試驗(yàn)中采用鋼絲結(jié)扎并將鋼絲結(jié)頭盡量深埋入齦溝，在整個實(shí)驗(yàn)進(jìn)行中，沒有出現(xiàn)結(jié)扎鋼絲脫落的問題，這和絲線結(jié)扎容易脫落相比較是較好的辦法[5]?？傮w上說，該造模方法還是比較方便有效的。3.2使用重度牙周炎患者菌斑樣本的問題

單種或各種牙周致病菌的預(yù)防接種或注射可誘發(fā)牙周的病變[9]。但單一的細(xì)菌接種造模的效果比使用聯(lián)合細(xì)菌要差[4]。本實(shí)驗(yàn)選用重度牙周炎患者的細(xì)菌樣本培養(yǎng)物進(jìn)行沖洗，是為了避免采用單一菌種沖洗的不足。最終在大鼠牙周炎齦溝細(xì)菌培養(yǎng)物檢出多種牙周致病菌證實(shí)該辦法能夠比較方便有效的接種牙周致病菌。但其缺點(diǎn)在于無法精確控制接種的細(xì)菌種類。對于需要精確控制細(xì)菌的種類的實(shí)驗(yàn)來說，造模方法需要修改，對于不需要研究特定細(xì)菌對牙周炎構(gòu)造的影響的實(shí)驗(yàn)，這種辦法還是切實(shí)可行的。

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（2013-11-03收稿）

Rapid establishmentofperiodontitismodelin rats

CaiWei，ZhangQimei1，HeXiaoping，Wang Zhongchao1，Jiang Junqiang1
Department of Oral Internal Medicine；1Department of Prosthodontics，the Affiliated Stomatology Hospital of LuzhouMedicalCollege

Ob jective：Toestablish an experimental rodentmodelofperiodontitis for theunderstandingof the progression，prevention，and treatmentof the disease.Methods：20 five-week old rats received a gingival incision followed by steelwire suture，then inoculated with periodontitisbacterialsuspension and fed with a high-glucose diet. Several indexeswere recorded on the second and fourth week.Resuits:Thealveolarbone loss reached theapex of the rootby theend ofthe fourthweek.Other indexesalso indicated thatasevereperiodontitiswasestablished.Conclusion: Wehavesuccessfullyestablished asimplebutreliablemethod to imitatesevereperiodontitis in rats.Thismethod can be used to betterunderstand the progression ofperiodontitisand providea basis for further study on etiology，prevention and treatmentofperiodontitis.

Rats;Periodontitis;Animalmodel

R781.4

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2014.02.022

*四川省教育廳課題（09ZB129）

蔡煒（1980-），男，主治醫(yī)師，碩士，E-mail:340-77696@qq.com

蔣俊強(qiáng)（1976-），男，副教授，碩士，E-mail:3961-88456@qq.com