以大孔硅膠為載體的苯丙氨酸解氨酶交聯(lián)酶聚體的制備及性質(zhì)研究

李連連，崔建東

(河北省發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北科技大學(xué)，河北石家莊050018)

苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonia lyase，PAL，EC.4.3.1.5)是一種由四個(gè)亞基組成的寡聚酶，分子量一般在220～330ku［1］。存在于各種植物和少數(shù)微生物中，在植物體內(nèi)是次生代謝的關(guān)鍵酶和限速酶，在微生物中可以催化L－苯丙氨酸非氧化脫氨生成反式肉桂酸和氨根離子。近20年來(lái)，PAL在臨床，工業(yè)以及生物技術(shù)應(yīng)用方面?zhèn)涫荜P(guān)注。純化后，不僅可以用于治療某些腫瘤，還可以診斷和治療苯丙酮尿癥［2］。但目前最主要的用途是催化反式肉桂酸轉(zhuǎn)化，制備L－苯丙氨酸，而后者是合成阿斯巴甜的主要原料。由于游離酶的穩(wěn)定性低，該酶的廣泛應(yīng)用受到限制。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線操作表Table 1 Standed curve operating table

交聯(lián)酶聚體技術(shù)(CLEAs)是一種新型的無(wú)載體固定化酶技術(shù)，制備容易，操作簡(jiǎn)單，可以在一定程度上提高酶的穩(wěn)定性，但是在實(shí)際應(yīng)用中交聯(lián)酶聚體技術(shù)暴露出很多問(wèn)題。一方面，CLEAs的粒度一般都在10μm以下，這樣就很難通過(guò)簡(jiǎn)單地離心或過(guò)濾從反應(yīng)體系中分離和回收CLEAs，尤其是底物和CLEAs的粒度處于相同水平時(shí)。另一方面，CLEAs壓縮阻力很低，離心和過(guò)濾會(huì)使得其結(jié)成實(shí)心塊，很難再重新均勻分散到反應(yīng)體系中，使得催化效率降低。

硅膠是一種用途廣泛的無(wú)機(jī)化學(xué)產(chǎn)品，多孔結(jié)構(gòu)，機(jī)械強(qiáng)度高、熱穩(wěn)定性好、抗有機(jī)溶劑、抗微生物降解，受溫度和壓力的影響較小，安全無(wú)毒，廉價(jià)易得，并且可以在硅膠表面硅醇基的基礎(chǔ)上進(jìn)行化學(xué)鍵合和改性，所以較多的用作催化劑載體。目前，已應(yīng)用于木瓜蛋白酶［3］，脂肪酶［4］，β－甘露糖酶［5］，漆酶［6］等多種酶的固定化研究中。

為了彌補(bǔ)PAL－CLEAs在實(shí)際應(yīng)用中的不足，本研究以大孔硅膠(MSG)為載體，利用CLEAs技術(shù)將PAL吸附后交聯(lián)到MSG的孔道中，制備出新型的MSG－PAL－CLEAs。該 MSG－PAL－CLEAs不但具有較強(qiáng)的抗壓縮能力，解決了回收過(guò)程中的結(jié)塊問(wèn)題;而且，MSG增大了CLEAs的粒度，使得催化劑的回收可以通過(guò)簡(jiǎn)單地靜置完成。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

粘紅酵母(Rhodotorula gluinis)中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC32913);大孔硅膠(孔徑200～600?，粒度0.5～1.0mm)中國(guó)青島美高集團(tuán)有限公司;L－苯丙氨酸、50%戊二醛 北京百靈威科技有限公司;3－氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)曲阜萬(wàn)達(dá)化工有限公司;其他試劑均為市售分析純。

NEXUS870傅里葉變換紅外光譜儀 美國(guó)NICOLET公司;S－4800－Ⅰ型場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡 日本HITACHI;752型紫外分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司;DF－Ⅱ集熱式磁力加熱攪拌器 金壇市金南儀器制造有限公司;FD－27冷凍干燥機(jī) 北京德天佑科技發(fā)展有限公司;TGL－16C型離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;HC－3018型高速離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司;VORTEX－5型渦旋振蕩器 海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司;85－1B磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 PAL的提取 將培養(yǎng)后的粘紅酵母利用微珠渦流法進(jìn)行細(xì)胞破碎提取PAL粗酶液［7］。

1.2.2 苯丙氨酸解氨酶交聯(lián)酶聚體(PAL－CLEAs)的制備 提取的粗酶液1mL(約1.2U/mL)，邊攪拌邊加入硫酸銨粉末0.243g，使其終飽和度為40%，靜置沉淀1h，加入10%的戊二醛水溶液，使戊二醛的終濃度為0.1%，攪拌交聯(lián)1h，上述步驟均冰浴進(jìn)行。

1.2.3 無(wú)氨基化硅膠為載體的苯丙氨酸交聯(lián)酶聚體(SG－PAL－CLEAs)的制備 按照0.05g硅膠/mL酶液，室溫，震蕩吸附2.5h后，洗滌一次，加入飽和度為40%的硫酸銨溶液，震蕩沉淀1h，加入戊二醛溶液，使其終濃度達(dá)到1.5%，冰浴震蕩交聯(lián)1h后，洗滌三次，即得 SG－PAL－CLEAs，置于4℃冰箱備用。

1.2.4 氨基鍵合硅膠為載體的苯丙氨酸解氨酶交聯(lián)酶聚體(MSG－PAL－CLEAs)的制備

1.2.4.1 大孔硅膠氨基化 根據(jù)文獻(xiàn)［8］，稱取5g大孔硅膠，浸入50mL 20%的鹽酸中浸泡8h。用蒸餾水洗滌，至中性，真空干燥。準(zhǔn)確稱取活化后的硅膠1g，以1/25/2(w/v/v)加入甲苯和APTES，油浴加熱回流一定時(shí)間。然后依次用適量的甲苯、蒸餾水、無(wú)水乙醇多次洗滌。真空干燥，得到氨基鍵合硅膠。

1.2.4.2 氨基鍵合硅膠為載體的苯丙氨酸解氨酶交聯(lián)酶聚體(MSG－PAL－CLEAs)的制備 根據(jù)文獻(xiàn)［9］按照0.05g硅膠/mL酶液，室溫，震蕩吸附2.5h后，洗滌一次，加入飽和度為80%的硫酸銨溶液，震蕩沉淀1h，加入戊二醛溶液，使其終濃度達(dá)到1%，冰浴震蕩交聯(lián) 1h后，洗滌三次，即得 MSG－PALCLEAs，置于4℃冰箱備用。

1.2.4.3 大孔硅膠鍵合氨基數(shù)目的測(cè)定 根據(jù)文獻(xiàn)［10］，稱取10mg氨基鍵合硅膠置于5mL的離心管中，用耦合溶液(冰醋酸∶無(wú)水甲醇為0.8∶100(v/v))充分洗滌三次，每次2mL。然后加入2mL對(duì)硝基苯甲醛溶液置于搖床上充分反應(yīng)3h，反應(yīng)結(jié)束后，再用耦合溶液洗去未反應(yīng)的對(duì)硝基苯甲醛。和對(duì)硝基苯甲醛反應(yīng)后的硅膠，加入2mL水解溶液(甲醇∶水∶冰醋酸比為 75∶75∶0.2(v/v/v))，置于搖床繼續(xù)反應(yīng)4h，靜置分離。吸取上清液，稀釋20倍，測(cè)定267nm吸光值。配制濃度為0.5μmol/mL的對(duì)硝基苯甲醛溶液(7mg對(duì)硝基苯甲醛溶于10mL耦合溶液)，按表1混合，測(cè)定267nm下的吸光值，做出標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算硅膠表面的氨基數(shù)目。計(jì)算公式見(jiàn)

式中:C－對(duì)硝基苯甲醛的濃度(μmol/mL);V－水解溶液的體積(mL);G－參加反應(yīng)的硅膠質(zhì)量(g)。

1.2.5 酶活測(cè)定方法 一個(gè)酶活力單位定義為每分鐘催化L－苯丙氨酸生成1μmol反式肉桂酸的酶量。以紫外分光光度法測(cè)定PAL的酶活［11］。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 大孔硅膠的氨基化條件的確定

1.3.1.1 加熱回流時(shí)間的確定 準(zhǔn)確稱取0.5g活化后的硅膠，以1∶25(w/v)的比例，加入12.5mL甲苯，1∶1.5(w/v)的比例，加入 0.75mL APTES，110℃ 油浴加熱回流。在7h后，每隔1h從反應(yīng)體系中取出少量硅膠，依次用適量的甲苯，蒸餾水，無(wú)水乙醇多次洗滌，真空干燥。測(cè)定硅膠鍵合氨基的數(shù)目。

1.3.1.2 硅膠鍵合氨基的反應(yīng)溫度的優(yōu)化 準(zhǔn)確稱取0.5g活化后的硅膠，以1∶25(w/v)的比例，加入12.5mL 甲苯，1∶1.5(w/v)的比例，加入 0.75g APTES，分別于60、90、110、150℃油浴回流相同時(shí)間。制備的硅膠依次用適量的甲苯，蒸餾水，無(wú)水乙醇多次洗滌，真空干燥。測(cè)定硅膠鍵合氨基的數(shù)目。

1.3.1.3 硅膠和APTES的比例的優(yōu)化 準(zhǔn)確稱取0.5g活化的硅膠，加入12.5mL甲苯，分別以1/0.5，1/1，1/1.5，1/2(w/v)的比例加入 APTES，相同溫度下由于回流相同時(shí)間。制備的硅膠依次用適量的甲苯，蒸餾水，無(wú)水乙醇多次洗滌，真空干燥。測(cè)定硅膠鍵合氨基的數(shù)目。

1.3.2 SG－PAL－CLEAs和 MSG－PAL－CLEAs的制備條件確定

1.3.2.1 吸附條件的確定

a.吸附時(shí)間的優(yōu)化 室溫條件下，將1mL粗酶液加入到0.05g大孔硅膠中，攪拌吸附后，洗滌一次，分被測(cè)定吸附 1.5、2.5、3.5、4.5、5.5h 后大孔硅膠的酶活。

b.吸附時(shí)硅膠和酶液比例的確定 室溫條件下，分別將0.05、0.1、0.2、0.3、0.4g 大孔硅膠加入到 1mL粗酶液中，攪拌吸附2.5h后，洗滌一次，分別測(cè)定各份大孔硅膠酶活。

c.吸附pH的確定 將0.05g大孔硅膠分別加入到 pH 為5、6、7、8、8.8、10 的粗酶液中，攪拌吸附 2.5h后，洗滌一次，測(cè)大孔硅膠的酶活。

1.3.2.2 沉淀劑種類(lèi)及濃度的確定 吸附后的大孔硅膠，洗滌一次，分別添加飽和度不同的硫酸銨溶液和濃度不同的PEG400溶液作為沉淀劑，室溫下，震蕩沉淀1h，分離出硅膠，測(cè)定酶活。

1.3.2.3 交聯(lián)條件的確定

a.戊二醛濃度的確定 在室溫條件下，將大孔硅膠加入到粗酶液中，攪拌吸附2.5h，洗滌后，氨基化硅膠加入飽和度為80%的硫酸銨溶液(無(wú)氨基化硅膠加入飽和度為40%的硫酸銨溶液)，充分沉淀1h后，在此體系中，加入戊二醛作為交聯(lián)劑，使得戊二醛的終濃度分別為0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、2%、2.5%、3%，0℃震蕩交聯(lián)1h，洗滌三次后，測(cè)定各交聯(lián)劑濃度下制備的以大孔硅膠為載體的交聯(lián)酶聚體的酶活。

b.交聯(lián)時(shí)間的確定 在室溫條件下，將大孔硅膠加入到粗酶液中，攪拌吸附2.5h，洗滌后，氨基化硅膠加入飽和度為80%的硫酸銨溶液(無(wú)氨基化硅膠加入飽和度為40%的硫酸銨溶液)，充分沉淀1h后，氨基化硅膠加入終濃度為1%的戊二醛，無(wú)氨基化硅膠加入終濃度為1.5%的戊二醛，0℃，震蕩交聯(lián)后，洗滌三次，測(cè)定交聯(lián)0.5、1、2、3h后的以大孔硅膠為載體制備的交聯(lián)酶聚體的酶活。

1.3.3 SG－PAL－CLEAs和 MSG－PAL－CLEAs的操作穩(wěn)定性研究。

1.3.3.1 SG－PAL－CLEAs和 MSG－PAL－CLEAs的操作穩(wěn)定性研究 將740mg反式肉桂酸溶解于45mL氨水(濃度為0.28mol/L)中，用硫酸調(diào)節(jié)pH為10，去離子水定容到100mL配制轉(zhuǎn)化液。將 PALCLEAs與轉(zhuǎn)化液按照 1∶4(v/v)，MSG(SG)－CLEAs與轉(zhuǎn)化液按照0.01∶1(m/v)的比例，30℃條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，轉(zhuǎn)化1h后分離出固定化酶后，用Tris－HCl(pH 8.8)緩沖液洗滌三次，測(cè)定洗滌后固定化酶的酶活。然后進(jìn)行下一輪轉(zhuǎn)化，直至第8輪。

1.3.3.2 SG－PAL－CLEAs和 MSG－PAL－CLEAs的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性研究 將固定化酶和粗酶液儲(chǔ)存在25℃條件下，分別于第0、5、10、17、24、29d 取出定量的固定化酶測(cè)定酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔硅膠的氨基化

2.1.1 大孔硅膠的氨基化條件的確定 從圖1、圖2可以看出，以110℃加熱回流10h的條件下，氨基化數(shù)目達(dá)到最高。在圖3中，隨著APTES/硅膠的比例的增高，氨基化程度也不斷增高，但是考慮到較大APTES的濃度會(huì)在一定程度上提高固定化酶載體的成本，所以本實(shí)驗(yàn)選擇的硅膠/APTES比為1/2(g/mL)，得到的MSG的鍵接硅膠數(shù)目為478.3μmol/g。

圖1 氨基化時(shí)間對(duì)硅膠鍵合氨基數(shù)目的影響Fig.1 Effect of amination time on the number of amino connected to macroporous silica gel

2.1.2 大孔硅膠氨基化前后的紅外光譜(IR)分析 對(duì)于Si－O－Si的測(cè)定結(jié)果和 Jae－Won Lee［11］等的結(jié)果相同，在 1108cm－1為 Si－O－Si鍵反對(duì)稱伸縮振動(dòng)吸收峰;480cm－1為O－Si－O鍵的彎曲振動(dòng)峰，796cm－1為Si－O－Si鍵反對(duì)稱伸縮振動(dòng)吸收峰。而氨基化后的大孔硅膠在3303cm－1出現(xiàn)了N－H鍵的伸縮振動(dòng)吸收峰;在1604cm－1出現(xiàn)了N－H鍵彎曲振動(dòng)吸收峰;在1195cm－1出現(xiàn)了 C－N的伸縮振動(dòng)吸收峰［12］。大孔硅膠鍵接氨基過(guò)程發(fā)生的反應(yīng)如圖5所示，增加的基團(tuán)和傅里葉紅外光譜分析結(jié)果相對(duì)應(yīng)。這些都說(shuō)明在大孔硅膠表面已經(jīng)成功鍵接上了氨基。

圖2 氨基化溫度對(duì)硅膠鍵合氨基數(shù)目的影響Fig.2 Effect of amination temperture on the number of amino connected to macroporous silica gel

圖3 硅膠/APTES對(duì)硅膠鍵合氨基數(shù)目的影響Fig.3 Effect of macroporous silica gel/APTES on the number of amino connected to macroporous silica gel

圖4 MSG和SG的IR圖Fig.4 IR images of MSG and SG

圖5 氨基化過(guò)程的方程式Fig.5 Reaction equation of amination process

2.2 SG－PAL－CLEAs和 MSG－PAL－CLEAs的制備條件確定

大孔硅膠為載體的PAL－CLEAs的制備過(guò)程包括三個(gè)步驟:PAL和硅膠的共吸附;PAL在沉淀劑的作用下在硅膠的孔道內(nèi)形成超分子結(jié)構(gòu);在戊二醛的作用下，PAL超分子結(jié)構(gòu)與氨基化硅膠表面鍵接的氨基，以及PAL超分子結(jié)構(gòu)之間進(jìn)行交聯(lián)。

2.2.1 吸附過(guò)程的條件確定 吸附是通過(guò)酶分子與載體表面的相互作用對(duì)酶進(jìn)行的一種非共價(jià)固定，這種方法成本低，過(guò)程溫和。而酶與載體之間的相互作用會(huì)受到吸附時(shí)間，硅膠與酶的比例和環(huán)境pH等條件的影響。首先，吸附時(shí)間對(duì)酶活力的影響如圖6，在2.5h前隨著吸附時(shí)間的增加，越來(lái)越多的苯丙氨酸解氨酶分子擴(kuò)散到大孔硅膠的孔內(nèi)，在2.5h前后大孔硅膠的表面已經(jīng)被吸附的酶分子飽和，隨著時(shí)間的不斷延長(zhǎng)，吸附不夠牢固的酶分子可能泄露到酶溶液中使得吸附酶活下降。其次，酶活力的高低還受硅膠和酶溶液比例的影響，圖7中，隨著酶液中硅膠量的增加，單位重量硅膠固定化酶的酶活降低了，這表明，硅膠/酶(g/mL)的提高并沒(méi)有使得單位重量硅膠上負(fù)載的酶量，這可能是由于單位體積的酶液中添加的硅膠量越多，導(dǎo)致的硅膠之間的相互碰撞就越劇烈，增加了硅膠和酶分子之間相互吸附的難度。同時(shí)由于氨基化導(dǎo)致大孔硅膠孔道縮小［13］，活化硅膠吸附的酶量明顯高于氨基化硅膠。除此之外，pH對(duì)吸附能力的影響如圖8所示，pH小于8.8時(shí)，隨著酶液pH的升高，硅膠固定化酶的酶活均有所升高，在pH為8.8時(shí)，吸附后活化硅膠和氨基化硅膠的酶活均為最高，隨著pH得繼續(xù)升高，酶活開(kāi)始下降，這可能是由于pH8.8恰好為活化硅膠和氨基化硅膠的吸附能力和苯丙氨酸解氨酶的活性的平衡點(diǎn)。

圖6 吸附時(shí)間對(duì)吸附的影響Fig.6 Effect of adsorption time on the adsorption process

2.2.2 沉淀過(guò)程的條件確定 吸附后，苯丙氨酸解氨酶的游離酶已經(jīng)吸附到大孔硅膠孔道表面。加入沉淀劑后，通過(guò)改變吸附在硅膠表面的酶分子的微環(huán)境，使其聚合形成酶超分子結(jié)構(gòu)。通常會(huì)選擇蛋白鹽析試劑，如鹽，有機(jī)溶劑，非離子聚合物或酸等作為沉淀劑，前期實(shí)驗(yàn)表明有機(jī)溶劑做沉淀劑制備交聯(lián)酶聚體時(shí)，酶活損失嚴(yán)重。加入酸會(huì)改變?nèi)芤簆H，也會(huì)大大降低酶活。本實(shí)驗(yàn)選擇不同飽和度的硫酸銨和不同濃度的PEG400作為沉淀劑，如圖9?？梢杂^察到:對(duì)于活化的大孔硅膠，40%的硫酸銨做為沉淀劑時(shí)，酶活損失最少，酶活回收率幾乎100%;對(duì)于氨基化的大孔硅膠，80%的硫酸銨作為沉淀劑時(shí)，酶活損失最少。

圖7 硅膠添加量對(duì)吸附的影響Fig.7 Effect of silica gel(g)/mL enzyme solution on the adsorption process

圖8 pH對(duì)吸附的影響Fig.8 Effect of enzyme solution pH on the adsorption process

圖9 沉淀劑對(duì)酶活回收率的影響Fig.9 The effect of precipitants on activity recovery of PAL

2.2.3 交聯(lián)過(guò)程的條件確定

2.2.3.1 交聯(lián)劑濃度的確定 交聯(lián)是酶分子的自由氨基與雙功能試劑進(jìn)行的反應(yīng)，常用的交聯(lián)劑為戊二醛。通過(guò)交聯(lián)劑戊二醛的交聯(lián)，使得沉淀得到的超分子結(jié)構(gòu)的苯丙氨酸解氨酶聚集體，在無(wú)氨基化的硅膠和氨基化大孔硅膠的孔道內(nèi)生成CLEAs。由圖10可以看出，當(dāng)戊二醛終濃度為1%時(shí)，氨基化大孔硅膠負(fù)載的交聯(lián)酶聚體的酶活回收率最高。戊二醛濃度為1.5%時(shí)，活化大孔硅膠負(fù)載的交聯(lián)酶聚體的酶活回收率最高。戊二醛不僅是交聯(lián)劑，而且是酶的變性劑。如果交聯(lián)反應(yīng)涉及酶活中心就有可能破壞酶的活性構(gòu)象。高的戊二醛濃度還會(huì)引起酶分子的過(guò)度交聯(lián)，使得酶分子變性失活。

圖10 戊二醛濃度對(duì)酶活回收率的影響Fig.10 The effect of glutaraldehyde concentration on activity recovery of PAL

2.2.3.2 交聯(lián)時(shí)間的確定 從圖11可知，交聯(lián)時(shí)間為1h時(shí)，氨基化硅膠為載體的苯丙氨酸解氨酶交聯(lián)酶聚體和無(wú)氨基化硅膠為載體的苯丙氨酸解氨酶交聯(lián)酶聚體的酶活回收率均為最高。時(shí)間太短，交聯(lián)不夠充分，交聯(lián)效率下降;反之，如果延長(zhǎng)交聯(lián)時(shí)間，則會(huì)使酶暴露在戊二醛中的時(shí)間太長(zhǎng)，易使酶失活。

圖11 交聯(lián)時(shí)間對(duì)酶活回收率的影響Fig.11 Effect of cross－linking time on activity recovery of PAL

2.3 掃描電鏡(SEM)分析

修飾前后的硅膠分別如圖12A、圖12B所示，可以看出氨基化前后對(duì)硅膠的表面并沒(méi)有太大的損傷，只是有文獻(xiàn)報(bào)道氨基化后硅膠的孔徑會(huì)減小。氨基化前后硅膠固載上酶后的電鏡圖如圖C、D所示，活化硅膠固載的酶分布在硅膠孔道表面而氨基化硅膠固載的交聯(lián)酶聚體則以顆粒狀鑲嵌在孔道中。此外，固體的多孔結(jié)構(gòu)為CLEAs的附著提供框架。因此，MSG－PAL－CLEAs的粒度足夠大使得生物催化劑適于工業(yè)應(yīng)用。甚至，MSG－CLEAs可以在離心和過(guò)濾后由于MSG的支撐，避免在重復(fù)使用過(guò)程中形成CLEAs塊。

2.4 MSG－PAL－CLEAs和 SG－PAL－CLEAs的穩(wěn)定性研究

圖12 電鏡圖Fig.12 SEM images

2.4.1 操作穩(wěn)定性研究 MSG－PAL－CLEAs和SGPAL－CLEAs每反應(yīng)一個(gè)批次后用緩沖液洗滌三次后，分離出硅膠，取一小份測(cè)定酶活性。MSG－PALCLEAs轉(zhuǎn)化四個(gè)批次后酶活保留率79%，在反應(yīng)四個(gè)批次后可能由于部分鍵接到硅膠上的氨基鍵能較弱造成部分鏈接上CLEAs的氨基從硅膠上脫落，從而使得少量酶泄露，但是 SG－PAL－CLEAs在反應(yīng)一個(gè)批次后酶活保留率只剩下60%，硅膠氨基化以后再固載交聯(lián)酶聚體可以在一定程度上防止酶泄露。而CLEAs在相同條件下由于回收過(guò)程，交聯(lián)酶聚體顆粒較小，需由離心收集，離心過(guò)程使得交聯(lián)酶聚體互相擠壓結(jié)塊，重新應(yīng)用時(shí)導(dǎo)致分散不均勻，影響酶催化反應(yīng)的傳質(zhì)過(guò)程，在轉(zhuǎn)化兩次后酶活殘留率僅49%。這充分證明將CLEAs通過(guò)戊二醛交聯(lián)固載到硅膠上不僅可以有效地防止酶泄露，而且可以有效地解決交聯(lián)酶聚體的結(jié)塊問(wèn)題，使得交聯(lián)酶聚體在重新應(yīng)用過(guò)程中均勻分散。

圖13 PAL固定化酶的操作穩(wěn)定性Fig.13 Operational stability of immobilized enzyme

2.4.2 儲(chǔ)藏穩(wěn)定性 將游離酶、CLEAs、MSG－PALCLEAs和SG－PAL－CLEAs均放置在25℃下貯存，檢測(cè) MSG－PAL－CLEAs和 SG－PAL－CLEAs的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性結(jié)果如圖14，MSG－PAL－CLEAs的酶活殘留率在17d內(nèi)均保持較高水平，之后有所下降，但29d后酶活殘留仍高達(dá)50%;SG－PAL－CLEAs的酶活殘留率在5d后急劇下降;這可能是由于在大孔硅膠形成的交聯(lián)酶聚體顆粒在貯存過(guò)程中會(huì)發(fā)生泄露。游離酶和CLEAs在貯存10d后酶活殘留率開(kāi)始急劇下降，貯藏29d后酶活殘留率分別下降到15%和26%。這可以充分的說(shuō)明MSG－PAL－CLEAs在25℃下在溶液中貯存，半衰期在29d左右。交聯(lián)可以有效地防止SG－PAL－CLEAs孔道中的CLEAs顆粒泄露，固載到硅膠上可以有效地延長(zhǎng)苯丙氨酸解氨酶的貯藏時(shí)間。

圖14 PAL游離酶和固定化酶的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性Fig.14 Storage stability of free enzyme and immobilized enzyme

3 結(jié)論

本研究以大孔硅膠為載體制備的交聯(lián)酶聚體，酶活回收率在45%左右;并且其操作穩(wěn)定性和儲(chǔ)藏穩(wěn)定性相對(duì)于CLEAs都有一定程度的改善。酶的這種固定化方法成功的解決了交聯(lián)酶聚體在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中抗壓阻力小，易結(jié)塊等問(wèn)題。

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