山楂黃酮超聲波輔助提取工藝參數(shù)優(yōu)化研究

孫協(xié)軍，李秀霞，劉雪飛，勵(lì)建榮，呂艷芳，李 嬌，王 珍，田 鑫

(渤海大學(xué)化學(xué)化工與食品安全學(xué)院，遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧省高校重大科技平臺(tái)“食品貯藏加工及質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心”，遼寧錦州121013)

山楂(Crataegus pinnatifida Bge.)通常是指薔薇科(Rosaceace)山楂屬(Crataegus L.)植物的干燥果實(shí)，分為山里紅(Crataegus pinnatifida Bge var.Major N.E.Br.)和 野 山 楂 (Crataeguscuneata Sieb.＆Zucc.)［1］，其中，山里紅也叫北山楂，在我國(guó)北方地區(qū)廣泛栽培，是重要的藥食同源植物。黃酮類(lèi)化合物、原花青素、三帖酸等是山楂中主要的生物活性成分，目前，從山楂中分離得到60余種黃酮類(lèi)化合物，主要包括以芹菜素和木犀草素為苷元的苷類(lèi)以及以蘆丁、金絲桃苷和槲皮素為主的黃酮醇及氧苷類(lèi)物質(zhì)［2－4］。黃酮類(lèi)化合物具有降血脂［5］、降血糖［6－7］、預(yù)防肝損傷［8－9］、抗氧化［10］及提高機(jī)體免疫力［11］等生理活性，是山楂果實(shí)及葉片中主要的生物活性成分。目前提取黃酮的方法主要有浸提［12－13］、超聲波輔助提取［14］、微波提取法［15］和酶法［16］等，超聲波輔助提取法是一種從植物中提取有效部分的重要方法，超聲空化作用能使細(xì)胞壁破裂從而有助于內(nèi)容物的浸出，增加了溶劑向細(xì)胞內(nèi)的擴(kuò)散和有效成分的溶出，超聲還有助于黃酮類(lèi)物質(zhì)的凝聚［17］，從而大大縮短了提取時(shí)間，提高提取效率，且對(duì)被提取物質(zhì)不產(chǎn)生破壞作用，因而近年來(lái)被廣泛用于植物有效成分的提取研究［18］，據(jù)報(bào)道，超聲波輔助提取可以提高山楂葉及果實(shí)中黃酮的提取效率［14－19］。蘆丁、槲皮素和金絲桃苷為北山楂果實(shí)中主要含有的黃酮類(lèi)化合物［20－21］，本文以北山楂果實(shí)為實(shí)驗(yàn)原料，以3種黃酮總得率為衡量指標(biāo)，對(duì)山楂黃酮超聲波輔助提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，通過(guò)本實(shí)驗(yàn)的研究，為北山楂果實(shí)中黃酮類(lèi)化合物的有效開(kāi)發(fā)和利用提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

山楂 市售，產(chǎn)地遼西地區(qū);蘆丁和槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品(純度＞97%)購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所;金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)品(純度＞98.5%)購(gòu)于寶雞市辰光生物科技有限公司;高效液相色譜檢測(cè)所用試劑均為色譜純，水為超純水，其它試劑為分析純。

P680型高效液相色譜儀 美國(guó)戴安公司;FA2004型電子天平 上海恒平科學(xué)儀器有限公司;RE－2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;SHZ－D(Ⅲ)型循環(huán)水真空泵 上海申光儀器有限公司;SCIENTZ－ⅡD型超聲波細(xì)胞破碎儀 寧波新芝超聲設(shè)備有限公司;PS02－AD－DI超純水機(jī) 上海訊輝環(huán)保科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 山楂樣品預(yù)處理方法 選擇整齊度良好的新鮮山楂自來(lái)水清洗后去除果核，帶皮果肉部分在50℃熱風(fēng)烘干后粉碎成細(xì)果粉，全部過(guò)40目分樣篩后真空封裝，冷藏備用。

1.2.2 超聲波輔助提取方法 準(zhǔn)確稱(chēng)取5g山楂果粉樣品于100mL小燒杯中，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分別加入適量的乙醇溶液，在相應(yīng)的超聲波功率下提取一段時(shí)間后減壓抽濾，收集濾液于60℃減壓濃縮至膏狀后，甲醇溶解并定容至50mL。

1.2.3 液相色譜檢測(cè)條件 Develosil C30(250mm×4.6mm，5μm)色譜柱;流動(dòng)相:A相為乙腈，B相為0.4%磷酸水溶液，梯度洗脫，80% B～60.5%B(0～26min)，80%B平衡4min后進(jìn)下一個(gè)樣品;流速1mL/min;柱溫40℃;進(jìn)樣20μL;檢測(cè)波長(zhǎng):360nm。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 各取蘆丁、金絲桃苷和槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品48、15和4.5mg，甲醇溶解并分別定容至10mL，得到濃度分別為4.8(蘆丁)、1.5(金絲桃苷)和0.45mg/mL(槲皮素)的3種標(biāo)準(zhǔn)品貯備液，分別吸取同體積各標(biāo)準(zhǔn)貯備液，稀釋為6個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)使用溶液，濃度分別為:蘆丁，0.005、0.01、0.02、0.04、0.08 和 0.16mg/mL;金絲桃苷，0.05、0.025、0.0125、0.00625、0.003125、0.001563mg/mL;槲皮素，0.015、0.0075、0.00375、0.001875、0.000938、0.000469mg/mL。

1.2.5 山楂黃酮得率的計(jì)算方法 山楂黃酮得率(%)=(提取液中3種黃酮濃度總和×定容體積)/(稱(chēng)樣質(zhì)量×100)

1.2.6 提取單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.6.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮得率的影響 在超聲波功率為600W條件下，選取液固比為20mL/g和體積分?jǐn)?shù)分別為50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液作為提取劑超聲波輔助提取10min，比較山楂黃酮得率。

1.2.6.2 液固比的影響 在超聲波功率為600W條件下，選取體積分?jǐn)?shù)為80%和液固比分別為10、15、20、25、30mL/g的乙醇溶液超聲波輔助提取10min，比較山楂黃酮得率。

1.2.6.3 超聲波功率的影響 在超聲波功率分別為450、550、650、750、850W 條件下，選取體積分?jǐn)?shù)為80%和液固比為20mL/g的乙醇溶液為提取劑超聲波輔助提取10min，比較山楂黃酮得率。

1.2.6.4 提取時(shí)間的影響 在超聲波功率為600W條件下，選取體積分?jǐn)?shù)為80%和液固比為20mL/g的乙醇溶液為提取劑分別超聲波輔助提取10、20、30、40、50min，比較山楂黃酮得率。

1.2.7 提取響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 為進(jìn)一步確定最佳超聲波輔助提取條件和各因素的影響順序，依據(jù)design－expert 7.0進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以3種黃酮總得率為考察指標(biāo)，以乙醇體積分?jǐn)?shù)(X1)、液固比(X2)、超聲波功率(X3)和提取時(shí)間(X4)為自變量，共設(shè)立30個(gè)處理組，具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 山楂黃酮超聲波輔助提取響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Response surface experiment design of ultrasound assisted extraction of hawthorn flavonoid

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC分離結(jié)果和標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

所配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)0.45μm膜過(guò)濾后分別進(jìn)樣，每個(gè)濃度進(jìn)樣3次，黃酮混合標(biāo)準(zhǔn)溶液及山楂提取液的液相色譜圖見(jiàn)圖1－A和圖1－B所示，圖2提取液中3種黃酮分別采用保留時(shí)間和DAD光譜掃描圖(圖形略)結(jié)合定性。從圖1－B可以看出，山楂提取液中的槲皮素色譜峰與其它色譜峰效果較好，而蘆丁和金絲桃苷沒(méi)有達(dá)到基線分離，但分離度也達(dá)到了1.0以上，可用于這2種黃酮定量分析使用。以峰面積為橫坐標(biāo)，3種黃酮濃度平均值(mg/mL)為縱坐標(biāo)，得到3條標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為:蘆丁，Y=538.31X－0.3226(R2=0.9999;線性范圍為0.0005－0.16 mg/mL)，金絲桃苷，Y=828.86X(R2=0.9996;線性范圍為0.0016～0.05 mg/mL)，槲皮素，Y=550.85X+0.044(R2=0.9997;線性范圍為0.0005～0.015 mg/mL)。

2.2 山楂黃酮超聲波輔助提取的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1 黃酮混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(A)和山楂黃酮提取液(B)色譜圖Fig.1 Chromatogram of flavonoid mixture standard(A)and hawthorn flavonoid extract(B)

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)山楂黃酮超聲波提取得率的影響 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)山楂黃酮得率的影響如圖2所示，乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)山楂黃酮提取效率的影響較大，體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇黃酮得率最高，這與李寧豫等實(shí)驗(yàn)結(jié)果［14］一致，此時(shí)，山楂黃酮類(lèi)化合物的溶解性最好，其次是90%乙醇，無(wú)水乙醇和體積分?jǐn)?shù)較低的乙醇提取效果較差，分析其原因，可能是因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)中山楂黃酮提取物主要以蘆丁和金絲桃苷兩種黃酮苷為主，提取液中槲皮素含量相對(duì)較低，在80%～90%乙醇溶液中溶解性高于無(wú)水乙醇和體積分?jǐn)?shù)較低的乙醇，提取效果較好，因此選擇體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮得率的影響Fig.2 Effect of ethanol volume fraction on flavonoid yield

2.2.2 液固比對(duì)山楂黃酮超聲波提取得率的影響液固比對(duì)山楂黃酮得率的影響見(jiàn)圖3所示，隨著液固比的增大，黃酮得率也隨之增大。這主要是因?yàn)殡S著液固比的增大，山楂粉末與提取液黃酮的濃度差增大，黃酮類(lèi)化合物就越容易滲透出來(lái);當(dāng)液固比增大到一定值后，由于山楂中黃酮類(lèi)化合物的含量有限，黃酮得率的增加趨于平緩。而且，液固比越大，溶劑的用量增加，后繼處理步驟耗能增加，導(dǎo)致提取成本增高，因此，確定液固比25mL/g為最佳。

圖3 液固比對(duì)黃酮得率的影響Fig.3 Effect of liquid to solid ratio on flavonoid yield

2.2.3 超聲波功率對(duì)山楂黃酮超聲波提取得率的影響 超聲波功率對(duì)山楂黃酮得率的影響如圖4所示，功率增大到550W時(shí)，黃酮得率已經(jīng)達(dá)到頂峰，以后隨超聲波功率的增加黃酮得率逐漸降低，這主要是由于高功率的超聲波產(chǎn)生的熱效應(yīng)較強(qiáng)，而高溫對(duì)黃酮類(lèi)化合物有一定的破壞作用，又考慮到功率越高，生產(chǎn)成本越高，選擇超聲波功率550W為最佳。

圖4 超聲波功率對(duì)黃酮得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on flavonoid yield

2.2.4 提取時(shí)間對(duì)山楂黃酮超聲波提取得率的影響 提取時(shí)間對(duì)山楂黃酮提取得率的影響如圖5所示，從圖5看出，超聲波在較短的時(shí)間內(nèi)就可以達(dá)到較高的提取效率，在20min時(shí)，黃酮得率最高，之后隨著時(shí)間繼續(xù)增加，得率有下降的趨勢(shì)，這可能是由于提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，導(dǎo)致的熱效應(yīng)使得一些黃酮類(lèi)化合物損失，選擇20min進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。

圖5 提取時(shí)間對(duì)黃酮得率的影響Fig.5 Effect of extracting time on flavonoid yield

2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)，選取乙醇濃度(X1)、料液比(X2)、提取功率(X3)和提取時(shí)間(X4)進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素、水平和實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。用Design－expert 7.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到山楂中黃酮類(lèi)化合物得率的回歸方程如下:

表3 方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance results

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析Table 2 Experimental results and analysis of the response surface

續(xù)表

方差分析結(jié)果見(jiàn)表3，由表3可以看出，模型的F值極顯著(p＜0.01)，而失擬的F值不顯著(p＞0.05)，模型的相關(guān)系數(shù)R2為82%，說(shuō)明模型擬合程度較好，實(shí)驗(yàn)誤差較小，該模型是合適的，因此可以用該模型方程來(lái)分析和預(yù)測(cè)不同超聲波輔助提取條件下山楂中黃酮類(lèi)化合物的得率變化。在所選的各因素水平范圍內(nèi)，四個(gè)考查因素對(duì)山楂中黃酮類(lèi)化合物得率影響的順序?yàn)?液固比＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞提取時(shí)間＞超聲波功率，在所選擇的超聲波功率范圍內(nèi)，超聲功率對(duì)山楂黃酮得率沒(méi)有顯著影響(p＞0.05)。

從表3可以看出，液固比和提取時(shí)間、超聲波功率和提取時(shí)間之間存在交互作用，其響應(yīng)面圖和等高線圖分別見(jiàn)圖6和圖7所示。從圖6的響應(yīng)面圖可以看出，液固比和提取時(shí)間對(duì)山楂中黃酮類(lèi)化合物得率均有較大影響，且隨著液固比和提取時(shí)間的增加，黃酮得率均呈先增加后變緩的趨勢(shì)，其中液固比的影響稍大于提取時(shí)間，而超聲波功率對(duì)山楂中黃酮類(lèi)化合物提取得率影響較小(見(jiàn)圖7)。

圖6 液固比和提取時(shí)間的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface graph of L/S ratio and extracting time

圖7 超聲波功率和提取時(shí)間的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.7 Response surface graph of ultrasonic power and extracting time

通過(guò)design expert7.0軟件擬合，得出最佳超聲波輔助提取山楂黃酮的工藝參數(shù)為:乙醇體積分?jǐn)?shù)90%，液固比25.5mL/g，超聲波功率600W，提取時(shí)間為24.9min，在此優(yōu)化條件下山楂黃酮得率預(yù)測(cè)值為0.0352%，實(shí)測(cè)值為0.0363%，與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為3.125%，與預(yù)測(cè)結(jié)果相符。

3 結(jié)論

建立了以乙腈和0.4%磷酸水溶液為流動(dòng)相的山楂蘆丁、金絲桃苷和槲皮素的分離和定量方法，以3種黃酮得率為響應(yīng)值，建立了超聲波輔助提取山楂黃酮的數(shù)學(xué)模型，各因素影響的主次順序?yàn)?液固比＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞提取時(shí)間＞超聲波功率。通過(guò)對(duì)提取過(guò)程工藝的研究，確定了超聲波提取山楂黃酮的最佳工藝參數(shù)為:乙醇體積分?jǐn)?shù)90%，液固比25.5mL/g，超聲波功率600W，提取時(shí)間為24.9min，該工藝條件下的山楂黃酮得率為0.0363%，與預(yù)測(cè)結(jié)果相符。

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