Pyrin重組蛋白對(duì)博來(lái)霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化的干預(yù)作用

齊 鵬，延光海，祝家彬，劉尚勇，樸紅梅

（1.延邊大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，吉林延吉 133000；2.延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院，吉林 延吉 133002）

肺纖維化是以呼吸功能永久性喪失為結(jié)局的嚴(yán)重危害人類健康的呼吸道疾病，目前，尚無(wú)特效的藥物。Pyrin是具有抑制NF-κB激活的重要蛋白，我們?cè)鴪?bào)道Pyrin重組蛋白能有效地抑制支氣管哮喘氣道周圍組織纖維化等氣道組織重建，而其在肺纖維化中的作用尚未見報(bào)道［1］。在本研究中，我們用博萊霉素建立小鼠肺纖維化模型，氣道內(nèi)給予Pyrin重組蛋白，觀察了肺組織中 NF-κB p65、TGF-β1、CTGF的表達(dá)情況。

1 材料與方法

1.1 材料 健康清潔級(jí)♀ BALB／c小鼠30只，體質(zhì)量（18±5）g，由延邊大學(xué)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK（吉）2011－0007；Pyrin重組蛋白質(zhì)由日本巖手醫(yī)科大學(xué)山內(nèi)廣平教授提供；博萊霉素購(gòu)自哈爾濱博萊制藥有限公司；NF-κB p65、TGF-β1、CTGF抗體以及 PCR試劑盒為美國(guó) Santa Cruz公司產(chǎn)品；RT-PCR儀（MJ Research Co，美國(guó)）；電泳儀及電泳槽（E-C Apparatus Corporation，美國(guó)）；Western blot轉(zhuǎn)膜儀（BioRad公司）。

1.2 方法

Tab 1 Changes of TGF-β1，CTGF，NF-κB p65 mRNA，protein expression in lung tissues（±s，n＝10）

Tab 1 Changes of TGF-β1，CTGF，NF-κB p65 mRNA，protein expression in lung tissues（±s，n＝10）

＃P＜0.05 vs control group；*P＜0.05 vs bleomycin group

Group TGF-β1mRNA CTGF mRNA TGF-β1 protein CTGF protein NF-κB p65 protein Control 0.03±0.2 0.12±0.5 0.11±0.2 0.07±0.20.13±0.3 Bleomycin 0.92±0.5＃ 0.73±0.6＃ 0.84±0.5＃ 0.86±0.7＃ 0.78±0.5＃Bleomycin＋Pyrin 0.25±0.2* 0.36±6.5* 0.51±0.3* 0.35±0.5* 0.53±0.3*

1.2.1 分組 按隨機(jī)數(shù)字表法，分為3個(gè)組，即①組為正常對(duì)照組、②組為肺纖維化模型組、③組為Pyrin重組蛋白治療組，每組10只。

1.2.2 造模 ①組氣管內(nèi)注入0.5 ml生理鹽水；②、③組氣

管內(nèi)注入0.5 ml生理鹽水稀釋的博萊霉素（每千克體重5 mg）1次，建立肺纖維化小鼠模型；③組于博萊霉素灌注前1天，以后每隔1天氣道內(nèi)注入Pyrin重組蛋白50μg·kg－1體重，①和②組氣道內(nèi)注入等量生理鹽水。3個(gè)組動(dòng)物均于d 14全麻下取右肺組織，放入液氮中速凍，－80℃保存。

1.3 組織病理學(xué)檢查 肺組織經(jīng)甲醛固定后，常規(guī)脫水包埋，行4μm厚病理切片。經(jīng)蘇木精－伊紅（HE）染色及Masson三色染色觀察小鼠肺組織病理學(xué)結(jié)構(gòu)改變。

1.4 RT-PCR檢測(cè) 根據(jù)參考文獻(xiàn)［1］，檢測(cè)肺組織中 TGF-β1、CTGF的 mRNA表達(dá)。

1.5 Western blot檢測(cè) 根據(jù)參考文獻(xiàn)［1］，檢測(cè)肺組織 NF-κB p65、TGF-β1、CTGF蛋白表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，各組數(shù)據(jù)均采用±s表示，方差齊采用單因素方差分析，方差不齊用非參數(shù)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 肺組織病理學(xué)改變 光鏡下觀察HE染色結(jié)果顯示：對(duì)照組肺組織無(wú)明顯改變；模型組可見肺泡腔內(nèi)有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡壁增厚，肺間質(zhì)內(nèi)成纖維細(xì)胞、膠原纖維明顯增多，肺泡間隔增寬，肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺泡腔明顯縮小，肺泡萎陷或消失，肺間質(zhì)出現(xiàn)大量膠原纖維和成纖維細(xì)胞；Pyrin重組蛋白干預(yù)組與模型組比較，上述變化明顯減輕。

2.2 Pyrin重組蛋白對(duì)肺組織膠原沉積的影響 Masson三色染色提示，對(duì)照組肺組織含有少量的膠原纖維，而模型組有大量的膠原纖維沉積。Pyrin重組蛋白干預(yù)組與模型組相比較明顯減輕。

2.3 Pyrin重組蛋白對(duì)肺組織 TGF-β1、CTGF mRNA表達(dá)的影響 模型組TGF-β1、CTGF mRNA含量明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；模型組 TGF-β1、CTGF mRNA含量明顯高于治療組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見Tab 1。

2.4 Pyrin重組蛋白對(duì)肺組織 TGF-β1、CTGF蛋白表達(dá)的影響 模型組TGF-β1、CTGF蛋白含量明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；模型組TGF-β1、CTGF蛋白含量明顯高于治療組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見Tab 1。

2.5 Pyrin重組蛋白對(duì)肺組織NF-κB p65表達(dá)的影響 模型組小鼠肺組織NF-κB p65的蛋白表達(dá)較對(duì)照組明顯增加（P＜0.05）。治療組肺組織中NF-κB p65蛋白表達(dá)較模型組明顯下降（P＜0.05）。見Tab 1。

3 討論

大量基礎(chǔ)與臨床研究提示，肺泡炎是肺纖維化發(fā)病的中心環(huán)節(jié)，它的持續(xù)存在與肺組織結(jié)構(gòu)和功能不可逆損傷密切相關(guān)，而這種炎癥與多種炎性細(xì)胞因子、致纖維化因子的過(guò)度表達(dá)密切相關(guān)。NF-κB是調(diào)控這些眾多炎癥因子基因表達(dá)的重要調(diào)節(jié)因子之一［2］，它的激活與肺纖維化的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)。眾所周知，TGF-β1是一種促纖維化細(xì)胞因子，是肺纖維化發(fā)展中的關(guān)鍵性分子。CTGF是TGF-β1的下游因子，可誘導(dǎo)肌成纖維細(xì)胞增殖和分泌細(xì)胞外基質(zhì)，與肺纖維化發(fā)生密切相關(guān)［3］。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)肺纖維化模型組TGF-β1、CTGF的含量明顯高于生理鹽水對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Pyrin重組蛋白組 TGF-β1、CTGF的含量與肺纖維化模型組相比較明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

目前認(rèn)為，在NF-κB激活環(huán)節(jié)中，具有抑制其激活的信息蛋白有Pyrin［4］。我們課題組曾制備出Pyrin重組蛋白，并且發(fā)現(xiàn)Pyrin重組蛋白能夠通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路來(lái)阻斷TGF-β1和CTGF的過(guò)度表達(dá)，而抑制哮喘小鼠氣道纖維化，進(jìn)而抑制氣道重構(gòu)的發(fā)生［1］。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)博來(lái)霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化模型組肺組織中NF-κB p65的蛋白表達(dá)較對(duì)照組明顯增加（P＜0.05），而Pyrin重組蛋白治療組肺組織中NF-κB p65蛋白表達(dá)較模型組明顯下降（P＜0.05）。

綜上所述，我們認(rèn)為Pyrin重組蛋白可能部分是通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)途徑，來(lái)阻斷TGF-β1和CTGF的過(guò)度表達(dá)而實(shí)現(xiàn)抑制肺泡炎癥，進(jìn)而抑制肺纖維化的形成。

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