高表達HER2的自發(fā)轉移性乳腺癌小鼠模型的建立與應用

劉卉卉，胡思怡，沈國棟，張志輝，費保珍，劉 兢3，，胡世蓮

（1.安徽醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院老年病科，老年醫(yī)學研究所，2.腫瘤免疫與營養(yǎng)治療安徽省重點實驗室，安徽合肥 230001；3.中國科學技術大學生命科學學院，安徽 合肥 230027；4.合肥瀚科邁博生物技術有限公司，安徽合肥 230088）

乳腺癌已成為全球女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，而乳腺癌轉移是患者死亡的主要原因，有25%～40%的乳腺癌病人因為發(fā)生轉移而最終無法治愈［1－3］。因此，建立合適的腫瘤轉移動物模型對乳腺癌的治療研究具有重要意義。據(jù)報道，高達40%乳腺癌患者存在表皮生長因子受體2（HER2／ErbB2／P185）過表達［4－5］。HER2蛋白是由 c-erbB2（her2／neu）基因編碼的具有受體酪氨酸激酶（RTK）活性的跨膜糖蛋白，其過表達往往預示腫瘤易發(fā)生轉移及預后不良［6］。由于HER2表達于腫瘤細胞的表面，而在成人正常組織中不表達或者僅有極低表達，使得它成為一個良好的藥物靶點。第一個抗HER2人源化單克隆抗體藥物曲妥珠單抗（Trastuzumab，商品名Herceptin）在10余年的臨床治療中展示了獨特的功效，然而，還存在曲妥珠單藥有效率低及大部分初始治療有效的患者常在1年內產(chǎn)生耐藥的現(xiàn)象［7－8］。因此，研究者們正在不斷研究與開發(fā)新的針對HER2受體的腫瘤靶向治療藥物。

本實驗室在國內較早開展了這方面工作，相繼研發(fā)了鼠源單克隆抗體A21及基因工程人源化抗體chA21等［9－10］。為了評價抗體免疫治療對乳腺癌細胞生長及轉移的影響，我們將重組人源HER2全長基因轉染小鼠乳腺癌細胞4T1-Luc，成功構建了高表達HER2及熒光素酶標記蛋白的4T1-Luc／HER2穩(wěn)定轉染細胞株。我們在裸鼠和BALB／c小鼠中初步研究了chA21和Trastuzumab抗體單用或聯(lián)用對高表達HER2小鼠乳腺癌移植瘤生長和腫瘤轉移的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、細胞和質粒 裸鼠及BALB／c小鼠購于北京華阜康實驗動物有限公司，SPF級，♀，4～5周齡，飼養(yǎng)于中國科技大學實驗動物中心，按中國科技大學實驗動物倫理委員會批準的方案進行實驗。4T1-Luc小鼠乳腺癌細胞株由中國科學技術大學生命科學學院朱濤老師實驗室惠贈。人乳腺癌細胞株BT-474（HER2過表達）購自美國ATCC。帶有人源HER2全長基因的pMH3-HER2重組質粒為本室前期構建［11］。

1.2 試劑與藥物 RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清購于Gibco公司；G418抗生素購于Amresco公司；熒光素酶底物（Sciencelight）和HER2兔多抗（Ab-1）為 Neomarkers公司產(chǎn)品；蛋白酶抑制劑Cocktail購自美國Roche公司；HRP標記羊抗兔抗體、FITC標記羊抗人抗體以及化學發(fā)光檢測試劑購自美國Pierce公司；抗HER2抗體藥物chA21為本課題組研制（批號111130）；注射用曲妥珠單抗為購自美國Roche公司。

1.3 細胞轉染及篩選 4T1-Luc細胞采用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，37℃，5%CO2，飽和濕度培養(yǎng)。利用pMH3-HER2質粒，參照本實驗室沈國棟等［11］方法轉染4T1-Luc細胞，傳代至96孔細胞培養(yǎng)板，加入1 g·L－1的G418持續(xù)加壓篩選約10～15 d，挑取單克隆細胞株擴大培養(yǎng)并保種。

1.4 免疫印跡檢測 胰酶消化收集細胞，加入RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑），冰上裂解30 min，離心15 000 r·min－110 min收集上清；取40μg總蛋白進行SDS-PAGE電泳，按常規(guī)免疫印跡方法檢測，其中，抗HER2一抗稀釋比例為1∶1 000，HRP標記羊抗兔的二抗稀釋比例為1∶2 000。

1.5 流式細胞儀檢測 胰酶消化收集細胞，加入冰冷的FACS緩沖液（PBS加入1%BSA）洗滌2次后，調整細胞濃度為1×109·L－1；取200μl細胞懸液加入2μg曲妥珠抗體，冰浴靜置30 min；洗滌2次后，每管加入2μg FITC標記羊抗人二抗，冰浴晃動30 min；洗滌2次后，用200μl PBS重懸，用流式細胞儀上機檢測（BD公司）；結果用FlowJo7.6軟件分析。

1.6 腫瘤模型建立與給藥實驗 將處于對數(shù)生長期的腫瘤細胞經(jīng)胰酶消化后，PBS洗滌1次，調整活細胞濃度為5×108·L－1，取0.1 ml細胞懸液接種于裸鼠和BALB／c小鼠左側乳房墊內。每周2次用游標卡尺測量腫瘤長徑（L）和短徑（W），腫瘤體積（tumor volume）計算公式為：TV＝0.5×L×W2。待腫瘤體積生長至約100 mm3，將荷瘤小鼠隨機分成4組，分別給予PBS對照、chA21（30 mg·kg－1）、Trastuzumab（30 mg·kg－1）、chA21＋Trastuzumab（各 15 mg·kg－1），每周2次靜脈給藥，連續(xù)給藥21 d。抑瘤率計算公式為：（對照組瘤體積－治療組瘤體積）／對照組瘤體積×100%。

1.7 活體動物成像儀檢測 小鼠腹腔注射200μl體積的熒光素酶底物，劑量為150 mg·kg－1小鼠體重。15 min后，用麻醉機進行小鼠異氟烷麻醉，置于小動物活體成像儀（Xenogen公司）觀察并拍照，曝光時間為5～10 s。必要時CO2處死小鼠并分離各個器官檢測。

1.8 統(tǒng)計學處理 實驗數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 13.0統(tǒng)計軟件處理，以xˉ±s表示，使用方差分析方法分析兩組之間差異是否有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 小鼠乳腺癌細胞系4T1-Luc熒光素酶表達測定 將野生型小鼠乳腺癌細胞系4T1和帶有螢火蟲熒光素酶基因的衍生細胞系4T1-Luc分別接種于3 cm培養(yǎng)皿中，待細胞貼壁后，加入適量熒光素酶底物，放入活體成像儀檢測。結果顯示，4T1陰性對照細胞沒有發(fā)現(xiàn)任何熒光信號，4T1-Luc細胞則有比較均一和高強度的熒光信號（Fig 1），符合進行動物模型活體成像實驗的要求。

Fig 1 Luciferase gene expression in 4T1-Luc cells by bioluminescence imaging technology

2.2 高表達HER2的小鼠乳腺癌穩(wěn)轉細胞株構建 用實驗室前期構建的pMH3-HER2重組質粒轉染4T1-Luc細胞，經(jīng)G418加壓篩選和單克隆化，獲得20多個穩(wěn)轉細胞株克隆。以4T1-Luc細胞作為陰性對照，BT-474細胞作為陽性對照，采用Western blot方法鑒定穩(wěn)轉細胞株HER2總蛋白表達水平。結果如Fig 2所示，約16個細胞克隆表達不同程度的HER2蛋白，即HER2陽性細胞株。其中，8C10、4B10、2C6等克隆為HER2高度表達，表達水平與BT-474細胞相當；8B7、7B4等克隆為HER2中度表達。

Fig 2 HER2 expression level in 4T1-Luc stably transfected cells by Western blot

隨后，以4T1-Luc細胞作為陰性對照，BT-474細胞作為陽性對照，采用FACS方法檢測HER2陽性細胞株中細胞膜表面的HER2表達水平。FACS結果顯示這些細胞株表面均有不同程度的HER2表達，其中8C10、4B10、2C6克隆HER2表達水平達到或接近于BT-474細胞，細胞未見分群，且HER2水平陽性的細胞比例達到99%以上（Fig 3）。在后續(xù)的體內實驗結束時，我們將高表達HER2細胞株的小鼠移植瘤取出進行Western blot檢測，結果證實腫瘤細胞HER2受體穩(wěn)定高表達（數(shù)據(jù)未顯示）。為方便研究，我們將HER2高表達的4T1-Luc穩(wěn)轉細胞株命名為4T1-Luc／HER2。

Fig 3 HER2 expression level on surface of 4T1-Luc stably transfected cells by FACS

2.3 小鼠乳腺癌穩(wěn)轉細胞株的生長和轉移特性鑒定 選擇4T1-Luc／HER2穩(wěn)轉細胞株克隆 8C10、4B10、2C6在不含有G418的培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)和計數(shù)，發(fā)現(xiàn)它們的體外增殖速度與野生型4T1-Luc細胞基本一致。將3個穩(wěn)轉細胞株分別接種5只BALB／c小鼠和裸鼠皮下乳房墊部位，構建原位移植瘤，每周2次測量腫瘤體積并作腫瘤生長曲線。結果顯示，4T1-Luc／HER2細胞接種約1周后即可見明顯的腫瘤形成，在BALB／c小鼠和裸鼠中成瘤率均為100%。而且4T1-Luc／HER2移植瘤生長速度較快，第3周末在BALB／c小鼠體內的腫瘤體積接近1 000 mm3，在裸鼠模型體內腫瘤體積超過1 000 mm3，但二者之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見Fig 4。

Fig 4 Tumor growth curve of 4T1-Luc／HER2 cells in mice

Fig 5 Tumor metastasis in BALB／c and nude mouse models by bioluminescence imaging technology

在4T1-Luc／HER2細胞接種小鼠30 d時，注射熒光素酶底物，并用活體成像儀觀察腫瘤是否有轉移現(xiàn)象。結果如Fig 5所示，除了腫瘤原發(fā)灶有很強的熒光信號，小鼠的肺、腹股溝與面部等部位出現(xiàn)不同程度的熒光信號，提示腫瘤細胞發(fā)生了轉移。通過活體成像儀及病理解剖等手段，對BALB／c小鼠和裸鼠模型體內腫瘤轉移部位及病灶數(shù)量進行統(tǒng)計與比較，結果顯示，在BALB／c小鼠和裸鼠體內4T1-Luc／HER2轉移情況相似，在肺部的轉移率最高，約為93.3%；其次是腹股溝部位，約為27%；轉移到面部的比率約為13%和7%（Tab 1）。而在小鼠心、肝、脾、腎、腦和股骨等器官與組織，未發(fā)現(xiàn)有明顯的腫瘤轉移。這些結果表明所篩選得到的4T1-Luc／HER2穩(wěn)轉細胞株具有較強的移植瘤形成和轉移特性。

Tab 1 Metastasis organs and rates of 4T1-Luc／HER2 tumor

2.4 抗HER2抗體抑制腫瘤生長和轉移的作用研究 為進一步考察抗HER2腫瘤靶向抗體藥物對4T1-Luc／HER2腫瘤生長和轉移的影響，我們選擇體內成瘤率和轉移能力均較強的克隆8C10，如上方法建立BALB／c小鼠和裸鼠移植瘤模型。在BALB／c小鼠接種細胞2周后，隨機分為4組，分別給予 PBS對照、chA21（30 mg·kg－1）、Trastuzumab（30 mg·kg－1）、chA21＋Trastuzumab（各15 mg·kg－1），每周 2次給藥直至實驗結束。實驗結果見Fig 6，抗體單用組藥效作用不明顯，chA21組抑瘤率僅為11.1%，Trastuzumab組抑瘤率為23%，兩組腫瘤體積與對照組相比差異均無顯著性；抗體聯(lián)用組則有明顯藥效，抑瘤率達43.3%，與對照組的差異有顯著性（P＜0.05）。以上結果提示，Trastuzumab與chA21抗體聯(lián)用對BALB／c小鼠體內腫瘤生長的抑制作用具有明顯的協(xié)同效應。同時，用小動物活體成像儀監(jiān)測各組小鼠腫瘤轉移情況，實驗結束時處死小鼠，解剖觀察腫瘤轉移灶，結果顯示，抗體聯(lián)用組小鼠肺部出現(xiàn)的熒光強度和腫瘤轉移灶的數(shù)目與對照組相比均有明顯降低，但是抗體單用組與對照組之間無明顯差異。另外，抗體單用和聯(lián)用在裸鼠移植瘤模型體內均未見明顯藥效，腫瘤生長和轉移情況基本未受影響（數(shù)據(jù)未顯示），其機制尚有待進一步研究。

Fig 6 Effects of anti-HER2 antibodies on tumor growth in BALB／c mice*P＜0.05 vs control.

3 討論

HER2在乳腺癌、卵巢癌、胃癌等多種惡性腫瘤中存在過表達現(xiàn)象，且HER2過表達與腫瘤的高轉移特性及治療預后不良密切相關。HER2作為一個重要的腫瘤標志物分子，長期以來一直是抗腫瘤藥物開發(fā)的熱門靶點。建立合適的腫瘤動物模型不僅有助于研究乳腺癌生長和轉移的分子機制，更有助于評價相關候選藥物的藥效學活性特點和作用機制。免疫缺陷小鼠模型是腫瘤治療藥物研究的常用模型，但是它不具備完整的免疫系統(tǒng)，對依賴于免疫殺傷效應的單克隆抗體等靶向藥物的療效評價存在明顯的局限性。4T1細胞是BALB／c小鼠來源的乳腺癌細胞，具有快速生長和自發(fā)轉移的特點，因此被廣泛應用于腫瘤機制研究。由于4T1細胞僅表達極低水平的鼠源HER2蛋白，而且鼠源與人源HER2蛋白序列之間存在一定差異，因此，4T1小鼠乳腺癌模型無法準確評價針對人源HER2抗體治療藥物的免疫治療效果。

近年來，已有國內外學者報道通過穩(wěn)定轉染人源HER2基因，成功構建了表達HER2蛋白的4T1乳腺癌細胞株用于各項研究［12－15］。但是，利用常規(guī)的重組蛋白表達載體（比如pCDNA3.1）或者病毒類載體構建的穩(wěn)轉細胞株并不能有效保證HER2處于高水平表達狀態(tài)。因此，我們采用了一種新型表達載體pMH3用于HER2基因轉染，該載體已經(jīng)在多種哺乳動物細胞和腫瘤細胞中證明可以有效提高目的基因的表達水平［11，16］。結果表明，利用 pMH3-HER2質粒轉染4T1-Luc細胞獲得多個穩(wěn)轉細胞株克隆的HER2表達水平與人源乳腺癌BT-474細胞HER2水平相似，明顯高于國內文獻報道的HER2水平［15］。同時，由于該細胞表達熒光素酶基因，可采用活體成像技術實時監(jiān)測腫瘤細胞在體內生長及轉移情況，更直觀地評價藥物對腫瘤的治療作用。

我們研究顯示，4T1-Luc／HER2穩(wěn)轉細胞株表現(xiàn)出和野生型4T1細胞相似的體外生長和體內轉移特性，提示它們的乳腺癌生物學特性未受影響。值得提出的是，我們發(fā)現(xiàn)4T1-Luc／HER2細胞在BALB／c小鼠中具有很強的成瘤性和腫瘤轉移能力，該發(fā)現(xiàn)與大部分穩(wěn)定轉染人源HER2基因的4T1細胞的研究結果相似［12－13］。以上結果不同于 Rivera等［14］報道含有人源HER2基因的4T1細胞在BALB／c小鼠中不具備成瘤能力或者短暫成瘤后腫瘤消失現(xiàn)象。

體外實驗顯示，chA21和Trastuzumab兩種抗體均不能抑制4T1-Luc／HER2細胞的增殖。體內研究發(fā)現(xiàn)，在BALB／c小鼠腫瘤模型中chA21與Trastuzumab抗體單用僅具有較弱的抗腫瘤生長和轉移作用，抗體聯(lián)用的藥效作用明顯提高，且具有協(xié)同效應。雖然裸鼠中含有NK細胞和巨噬細胞，可能通過抗體ADCC效應發(fā)揮免疫細胞介導的細胞毒作用。但是，我們在裸鼠中兩種抗體單用或聯(lián)用均未發(fā)現(xiàn)明顯的抗腫瘤藥效，說明裸鼠腫瘤模型對抗體藥物研究的應用存在一定局限性。最新研究發(fā)現(xiàn)，抗HER2抗體藥物的腫瘤治療作用可能更多依賴于人體和動物中的固有免疫和適應性免疫應答［17］。因此，4T1-Luc／HER2小鼠腫瘤模型的成功建立對抗HER2腫瘤靶向藥物的開發(fā)和作用機制研究具有重要意義。

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