正交設(shè)計優(yōu)選丹參－人參活性組分抗乳腺癌有效配伍

楊 燁，顏曉靜，畢 蕾，陳姍姍，朱晶晶，陳衛(wèi)平

（南京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江蘇南京 210023）

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率占惡性腫瘤的10%左右，已成為威脅婦女健康的主要病因。丹參和人參分別為活血化瘀、扶正固本類中藥的代表。人參的抗腫瘤功效已被廣泛證實，我們的前期研究也表明丹參的有效成分有抗腫瘤作用［1－3］。二者配伍常用于臨床抗腫瘤，但缺乏相關(guān)研究和報道。本實驗旨在通過正交實驗方法優(yōu)選丹參－人參活性成分抗乳腺癌的最佳配伍，并對其抗腫瘤機制進行初步研究，為中藥組方配伍治療乳腺癌提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 試劑 DMEM（Gibco，批號 8113261）；EMEM（Gibco，批號 1291856）；澳洲進口胎牛血清（Gibco，16000-044）；2.5 g· L－1胰蛋白酶 （Gibco，批號1297729）；青 －鏈霉素（Gibco，批號 1266382）；CCK-8（Cell counting kit-8）細胞毒性試劑盒（DOJINDO日本株式會社同仁化學(xué)研究所，批號EY683）；Hoechst 33342試劑盒（Thermo Scientific，批號62249）；Alexa Fluor 488 Annexin V和PI細胞凋亡檢測試劑盒（Invitrogen，批號 V1324）；40g·L－1多聚甲醛（Sigma，批號20120421）。

1.2 儀器 高內(nèi)涵細胞成像系統(tǒng)（VTI700，美國Thermo Scientific公司）；CO2恒溫培養(yǎng)箱（NU4950E，美國NUAIRE公司）；倒置相差顯微鏡（DFC-259，德國Leica公司）；多功能酶標儀（spectramax M5，美國Molecular Devices公司）；多功能冷凍離心機（SL-16R，美國Thermo Scientific公司）；實時無標記細胞傳感電阻儀（3X16，瑞士Roche公司）。

1.3 細胞株與藥物 人正常乳腺細胞株MCF-10A和人乳腺癌細胞株MCF-7購自于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心；丹參總酚酸（80%，批號 ZL20130112）、丹參總酮（90%，批號 ZL20130206）、人參總皂苷（80%，批號ZL20130211）和人參總多糖（60%，批號ZL20130203）均購自于南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司。

2 方法

2.1 正交設(shè)計 本實驗采用正交實驗法優(yōu)選人參－丹參活性成分的有效配伍。人參－丹參組分配伍優(yōu)選選取丹參總酚酸（A）、丹參總酮（B）、人參總皂苷（C）、人參多糖（D）為考察因素，每個因素選取3個水平，以MCF-10A和MCF-7細胞的抑制率為評價指標，因素水平見Tab 1。用L9（34）正交表安排實驗，見Tab 2。

2.2 細胞培養(yǎng) 正常乳腺MCF-10A細胞采用含體積分數(shù)為0.1的胎牛血清、0.1U·L－1的青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液。乳腺癌MCF-7細胞采用含體積分數(shù)為0.1的胎牛血清、0.1 U·L－1的青霉素和鏈霉素的EMEM培養(yǎng)液，置于37℃、含體積分數(shù)為0.05的CO2飽和濕度細胞培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng)。

Tab 1 Factors and levels of orthogonal test

Tab 2 L 9（34）table of orthogonal test

2.3 CCK-8法測定細胞相對抑制率 取對數(shù)生長期MCF-10A和 MCF-7細胞株，2.5 g·L－1胰酶消化，調(diào)整細胞密度為每毫升1×105個細胞，每孔100 μl接種于96孔板中，置37℃，含體積分數(shù)為0.05的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。按Tab 2配制丹參－人參組分1～9組，另設(shè)陰性對照組。細胞培養(yǎng)24 h后，小心吸棄上清，以每孔100μl依次加入所配備好的藥物，陰性對照組加入等體積的細胞培養(yǎng)液，每組設(shè)3個復(fù)孔。37℃，含體積分數(shù)為0.05的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，小心吸棄上清，每孔加入CCK-8溶液100μl，繼續(xù)培養(yǎng)30 min，酶標儀于450 nm波長處測定吸光度（A）。按公式計算各組藥對細胞生長的抑制率（IR）：IR%＝（1－A藥物組均值／A陰性對照組均值）×100%。

2.4 細胞形態(tài)學(xué)觀察 取對數(shù)生長期的MCF-10A和MCF-7細胞制成單細胞懸液，按每毫升1×105個細胞的密度接種于96孔板上，每孔100μl，置于37℃，含體積分數(shù)為0.05的CO2飽和濕度條件下，細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。設(shè)給藥組、陰性對照組和陽性對照組，給藥組按Tab 2配制丹參－人參組分1～9組，陰性對照組加入等體積的細胞培養(yǎng)液，陽性對照組為順鉑（cisplatin，DDP）和紫杉醇（paclitaxel，PTX），終濃度為 10 mg·L－1，每組設(shè) 3個復(fù)孔。37℃，含體積分數(shù)為0.05的CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)48 h后，放置于倒置顯微鏡下，觀察細胞形態(tài)及生長情況并拍照。

2.5 實時細胞分析技術(shù)檢測細胞增殖 取E-plate16細胞增殖檢測板，加入培養(yǎng)基每孔100μl，培養(yǎng)箱中平衡30 min，置于RTCA DP中檢測基線值。將細胞消化懸浮于含有血清的培養(yǎng)液中，吹打均勻，調(diào)整細胞密度為每毫升1×105個細胞，每孔100μl接種于E-plate16細胞增殖檢測板，培養(yǎng)箱中平衡30 min，置于RTCA DP中動態(tài)監(jiān)測24 h。吸棄E-plate16細胞增殖檢測板中上清，加入配制好藥物，每孔100μl，設(shè)置給藥組和陰性對照組，給藥組加入正交篩出的最佳組分配伍組合A2B3C1D2，即第6組，陰性對照組加入等體積的細胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)箱中平衡30 min，再置于實時無標記細胞傳感電阻儀中動態(tài)監(jiān)測48 h，觀察細胞增殖曲線。

2.6 高內(nèi)涵細胞分析技術(shù)檢測細胞凋亡 取96孔板，每孔加入多聚賴氨酸100μl包被過夜。為充分除去多聚賴氨酸，將包被好的96孔板用PBS清洗3次，每孔每次100μl。將MCF-10A和MCF-7分別消化懸浮于各自含有血清的培養(yǎng)液中，吹打均勻，調(diào)整細胞密度為每毫升1×105個細胞，接種于96孔板，置于37℃，含體積分數(shù)為0.05的CO2飽和濕度條件下細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后給藥。設(shè)置給藥組和陰性對照組，給藥組加入正交篩出的最佳組分配伍組合A2B3C1D2，即第6組，陰性對照組加入等體積的細胞培養(yǎng)液，每組設(shè)3個復(fù)孔。再將96孔板置于37℃，含體積分數(shù)為0.05的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。取培養(yǎng)48 h的96孔板，棄去細胞培養(yǎng)上清，然后加入Annexin V和100 mg·L－1的PI工作液，每孔50μl，室溫避光孵育15 min。孵育后棄除染液，每孔加入1×Annexin-Binding buffer 100 μl，洗兩遍，然后每孔加入多聚甲醛100μl，室溫避光固定20 min，固定后棄除多聚甲醛，各孔加入1×Annexin-Binding buffer 100μl，洗兩遍，而后加入Hoechst染液，每孔100μl，于室溫避光孵育10 min。棄除染液，每孔加入1×Annexin-Binding buffer 100 μl，洗兩遍，最后各孔加入100μl的1×Annexin-Binding buffer，于高內(nèi)涵細胞成像系統(tǒng)檢測。

2.7 數(shù)據(jù)分析 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 15.0軟件進行統(tǒng)計分析，各組定量檢測數(shù)據(jù)以ˉx±s表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差（one-way ANOVA）分析，組間比較采用LSD檢驗。

3 結(jié)果

3.1 CCK-8法測定細胞相對抑制率 Tab 3顯示MCF-10A和MCF-7細胞經(jīng)丹參－人參組分1～9組給藥后，用CCK-8法測定細胞的吸光度值及經(jīng)計算所得細胞生長的抑制率（IR）。Tab 4顯示了各因素不同水平的平均值，從結(jié)果上直觀分析，各因素水平對結(jié)果影響的強弱順序為：A3＞A1＞A2，B1＞B2＞B3，C2＞C3＞C1，D1＞D3＞D2。Tab 5結(jié)果表明，A、D因素對實驗結(jié)果有影響（P＜0.01），B因素?zé)o影響（P＞0.05），影響因素主次順序為：A＞D＞C＞B。本實驗的結(jié)果是正常乳腺細胞MCF-10A抑制率與乳腺癌細胞MCF-7抑制率的比值越小，則表明藥物對正常乳腺細胞的抑制較低，而對乳腺癌細胞的抑制較高，所以平均值越小越好，確定最佳組分配伍為A2B3C1D2，即第6組藥物組合。

3.2 實時細胞分析技術(shù)檢測細胞增殖 Fig 1顯示，丹參－人參最佳組分配伍藥物對MCF-10A和MCF-7細胞增殖的影響，直觀地表明從基線開始到24 h時所有細胞均平穩(wěn)增殖，第24 h給藥后，給藥組與陰性對照組相比較，給藥組對乳腺癌細胞MCF-7和正常乳腺細胞MCF-10A均有抑制增殖的作用，給藥后24 h對MCF-7細胞的增殖抑制作用強于對MCF-10A細胞的增殖抑制作用，并且可以看出對MCF-7細胞呈現(xiàn)持續(xù)的抑制增殖作用，而對于正常乳腺細胞則呈現(xiàn)先抑制后又抑制減弱的狀態(tài)。提示所篩選出的丹參－人參組分配伍最優(yōu)組合對乳腺癌細胞確有較好的抑制增殖作用，而對正常乳腺細胞的增殖抑制作用較小。

Tab 3 Inhibition of MCF-10A and MCF-7 cell growth of orthogonal test（±s，n＝6）

Tab 3 Inhibition of MCF-10A and MCF-7 cell growth of orthogonal test（±s，n＝6）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs control

Group MCF-10A A（OD）IR／%MCF-7 A（OD）IR／%Control 1.789±0.098 － 0.611±0.098 －1 0.337±0.011**81.158±0.617 0.155±0.006**74.576±0.342 2 0.666±0.043**62.785±2.408 0.195±0.066**68.032±0.933 3 1.562±0.165 12.690±9.199 0.482±0.017*21.105±10.753 4 0.439±0.061**75.454±3.412 0.162±0.003**73.513±2.838 5 0.597±0.049**66.654±2.726 0.192±0.022**68.572±0.540 6 1.519±0.071*15.093±3.993 0.399±0.002**34.722±3.550 7 0.275±0.012**84.642±0.648 0.161±0.006**73.622±0.402 8 0.450±0.071**74.837±3.941 0.214±0.025**64.918±1.055 9 1.533±0.110*14.294±6.165 0.561±0.008*8.295±4.143

3.3 細胞形態(tài)學(xué)觀察 Fig 2顯示給藥后細胞形態(tài)學(xué)變化。與MCF-7陰性對照組比較，最佳組分配伍給藥后，明顯改變了MCF-7細胞的形態(tài)，呈現(xiàn)出細胞密度降低，細胞固縮，體積變小，細胞間連接明顯減少；與MCF-10A陰性對照組比較，最優(yōu)組合給藥后對乳腺正常MCF-10A細胞形態(tài)差異無顯著性。結(jié)果表明，最優(yōu)組分配伍能夠明顯改變MCF-7細胞形態(tài)，而對MCF-10A細胞的形態(tài)差異無顯著性。

3.4 高內(nèi)涵細胞分析技術(shù)檢測細胞凋亡 最佳組分配伍對細胞凋亡的影響如Fig 3～6所示。對于正常乳腺細胞MCF-10A，對照組與給藥組相比Hoechst熒光強度無差異（P＞0.05），細胞核呈規(guī)則的類圓形或橢圓形，染色均勻，顯淡藍色熒光，為正常細胞處在分裂期細胞的細胞核；而對于乳腺癌細胞MCF-7，給藥組與對照組相比Hoechst熒光強度明顯降低（P＜0.01），細胞核明顯減少，細胞核固縮，呈致密顆粒塊狀熒光分布的凋亡典型形態(tài)。Annexin V和PI染色熒光顯示，對于正常乳腺MCF-10A細胞，對照組與給藥組相比Annexin V熒光值無差異（P＞0.05）；而對于乳腺癌細胞MCF-7，給藥組與對照組相比，AnnexinV和PI熒光值明顯增強（P＜0.01）。提示最優(yōu)組合藥物具有明顯誘導(dǎo)乳腺癌細胞凋亡的作用，但對正常乳腺細胞的誘導(dǎo)凋亡作用差異無顯著性。

Fig 2 Influence of best combination formula on cell morphology（×200）

Fig 3 Influence of best combination formula on cell apoptosis by HCS analysis（×200）MCF-7-Cand MCF-7-T means the negative control group and drug group of MCF-7；MCF-10A-Cand MCF-10A-T means the negative control group and drug group of MCF-10A

Fig4 Influenceofbestcombinationformula onHoechstfluorescence（n＝3）**P＜0.01vscontrolgroup

Fig5 Influenceofbestcombinationformula onAnnexinVfluorescence（n＝3）**P＜0.01vscontrolgroup

Fig6 Influenceofbestcombinationformulaon PIfluorescence（n＝3）**P＜0.01vscontrolgroup

4 討論

隨著中藥藥理學(xué)、細胞生物學(xué)、分子生物學(xué)等多學(xué)科研究方法和技術(shù)手段的發(fā)展，中藥及其有效成分的抗腫瘤作用研究已成為世界性的研究熱點［4］。中藥的有效組分配伍是根據(jù)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對疾病發(fā)生、發(fā)展規(guī)律的認識，采用細胞或整體動物模型研究有效組分配伍的增效機制。不僅體現(xiàn)了中藥多成分、多靶點、多層次產(chǎn)生作用的特點，而且相對于傳統(tǒng)中藥復(fù)方，其物質(zhì)基礎(chǔ)更為明確，針對性更強，質(zhì)量更加安全可控，有利于提高制劑工藝和質(zhì)量控制水平。中藥有效組分配伍結(jié)合正交實驗設(shè)計可篩選出較好的配伍比例。正交試驗設(shè)計是研究多因素多水平的一種設(shè)計方法，根據(jù)正交性從全面試驗中挑選出部分有代表性的點進行試驗，挑選出的有代表性的點具備了“均勻分散，齊整可比”的特點，與各試驗因素、各水平的全搭配試驗相比，可減少試驗個數(shù)，提高實驗效率，迅速得到較理想的實驗結(jié)果［5］。

丹參的現(xiàn)代藥理作用廣泛，化學(xué)成分主要有脂溶性的丹參酮類化合物和水溶性的酚酸類化合物兩大類［6］。丹參總酚酸（salvianolicacids）具有抗腫瘤作用，但其報道較少［7－8］。大量的研究顯示，丹參酮（tanshinone）可對腫瘤細胞產(chǎn)生殺傷、誘導(dǎo)分化和凋亡、抑制侵襲和轉(zhuǎn)移等作用［9］。人參總皂苷（saponinsofPanaxginseng，EPG）是人參根的主要生理活性物質(zhì)，有抗氧化、抗衰老、抗疲勞及抑制細胞凋亡、抑制腫瘤生長和降糖降脂等藥理活性［10－11］。人參多糖（ginsengpolysaccharide）是人參的另一類主要成分，具有提高免疫力、抗腫瘤和降血糖等藥理作用［12－14］。

許多抗癌藥物都是通過觸發(fā)腫瘤細胞凋亡通路而達到抑制腫瘤生長的目的［15］。本實驗中Hoechst熒光染色和AnnexinV／PI雙染色法結(jié)果表明，最優(yōu)組合可誘導(dǎo)乳腺癌細胞發(fā)生凋亡。其中，Annexin V熒光染色結(jié)合Hoechst熒光染色表現(xiàn)的細胞核固縮提示藥物誘導(dǎo)細胞發(fā)生晚期凋亡，同時，PI熒光染色也提示藥物誘導(dǎo)細胞發(fā)生晚期凋亡。綜上所述，丹參－人參活性組分的最優(yōu)配伍是通過細胞晚期凋亡的途徑達到抗腫瘤的作用。

本實驗優(yōu)選丹參－人參活性組分：丹參總酚酸、丹參總酮、人參總皂苷和人參多糖的最佳配伍，以正常乳腺細胞MCF-10A與乳腺癌細胞MCF-7的細胞抑制率比值大小為指標，由正交實驗設(shè)計篩選出最佳配伍組合 A2B3C1D2，即由丹參總酚酸5mg·L－1、人參總皂苷 10mg·L－1、人參多糖 5mg·L－1的終濃度配比成的組合。實驗結(jié)果表明，丹參－人參活性成分有效配伍時，丹參酮的作用效果并無體現(xiàn)，其原因還有待進一步研究。篩選出的最佳組合在有效抑制乳腺癌MCF-7細胞增殖的同時，也誘導(dǎo)細胞的凋亡，而對正常乳腺細胞MCF-10A的影響并不明顯，表明該配比下的人參－丹參活性成分的配伍可能具有抑制乳腺癌細胞的增殖，并誘導(dǎo)乳腺癌細胞發(fā)生凋亡的作用，同時，對正常乳腺細胞的影響較小，提示抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡是其抗腫瘤的可能機制之一。本研究揭示了丹參－人參組分配伍抗乳腺癌的可能作用機制，為中藥組方配伍治療乳腺癌提供了科學(xué)依據(jù)，更進一步實現(xiàn)開創(chuàng)有效組分組成的現(xiàn)代中藥制劑，提高中藥科技含量的目標。

參考文獻：

［1］ 畢 蕾，陳衛(wèi)平，姜澤群，馮全服.丹酚酸A對肝癌HepG2細胞線粒體跨膜電位的影響［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2012，27（4）：1171－3.

［1］ Bi L，Chen W P，Jiang Z Q，F(xiàn)eng Q F.Effect of Salvianolic acid A on mitochondrial transmembrane potential of human hepatocellular carcinoma cell line HepG2［J］.China J Tradit Chin Med Pharm，2012，27（4）：1171－3.

［2］ 王 昕，田 迎，嚴曉鶯，陳衛(wèi)平.丹酚酸A抑制LTEP細胞遷移及對 ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響［J］.中成藥，2011，33（12）：2059－61.

［2］ Wang X，Tian Y，Yan X Y，Chen W P.Inhibitory effect of salvianolic acid A on migration of LTEPcells via ERK signaling［J］.Chin Tradit Patent Med，2011，33（12）：2059－61.

［3］ 溫 雅，畢 蕾，張義彪，陳衛(wèi)平.丹參水提液對肺癌A549細胞增殖的抑制作用［J］.中醫(yī)藥導(dǎo)報，2010，16（1）：2－5.

［3］ Wen Y，Bi L，Zhang Y B，Chen W P.Inhibitory effects of radix Salviae miltiorrhiae water extract on A549 cells in vitro［J］.Guiding J Tradit Chin Med Pharm，2010，16（1）：2－5.

［4］ 梁欣娜，張興燊，滕紅麗.中藥及其有效成分抗腫瘤作用研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2013，24（1）：119－22.

［4］ Liang X N，Zhang X S，Teng H L.The anti-tumor effect Chinese medicine and its active ingredient［J］.Lishizhen Med Mat Med Res，2013，24（1）：119－22.

［5］ 李衛(wèi)娜，陳衛(wèi)平，袁冬平，李國春.正交設(shè)計優(yōu)選涼血化瘀方及其防治肝衰竭的藥效研究［J］.中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志，2007，17（5）：281－3.

［5］ Li W N，Chen W P，Yuan D P，Li G C.Optimization of formula with the function of cooling blood to remove stasis by orthogonal design and study on curative effect on FHF［J］.Chin J Integr Tradit West Med on Liver，2007，17（5）：281－3.

［6］ 何根云.丹參的藥理作用與臨床應(yīng)用［J］.浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志，2011，21（2）：124－5.

［6］ He G Y.The pharmacological action and clinical application of salvia miltiorrhiza［J］.Zhejiang J Integr Tradit Chin West Med，2011，21（2）：124－5.

［7］ 張曉雷，陳俊華，郭春霞，辛現(xiàn)良.丹參多酚酸鹽的藥理作用研究［J］.世界臨床藥物，2013，34（5）：292－7.

［7］ Zhang X L，Chen J H，Guo C X，Xin X L.Research progress on pharmacological activities of salvianolate［J］.World Clin Drugs，2013，34（5）：292－7.

［8］ 梁家紅，張水娟，姚 立.丹酚酸B對肺上皮細胞凋亡和急性肺損傷的影響［J］.中國藥理學(xué)通報，2013，29（4）：531－4.

［8］ Liang JH，Zhang SJ，Yao L.Effect of salvianolic acid B on lung epithelial cell apoptosis and acute lung injury［J］.Chin Pharmacol Bull，2013，29（4）：531－4.

［9］ 宋少華，郭聞淵，傅志仁，等.丹參多酚酸鹽通過線粒體途徑誘導(dǎo)人肝癌SMMC-7721細胞的凋亡［J］.中國腫瘤生物治療雜志，2010，17（1）：62－6.

［9］ Song SH，Guo WY，F(xiàn)u Z R，et al.Salvianolate induces apoptosis of human hepatoma SMMC-7721 cells through mitochondrial path way［J］.Chin J Cancer Biother，2010，17（1）：62－6.

［10］何道同，王 兵，陳珺明.人參皂苷藥理作用研究進展［J］.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2012，14（7）：118－21.

［10］He D T，Wang B，Chen JM.Research progress on pharmacological effects of ginsenoside［J］.J Liaoning Univ Tradit Chin Med，2012，14（7）：118－21.

［11］Xiang Y Z，Shang H C，Gao X M，et al.A comparison of the ancient use of ginseng in traditional Chinese medicine with modern pharmacological experiments and clinical trials［J］.Phytother Res，2008，22（7）：851－8.

［12］Kim M H，Byon Y Y，Ko E J，et al.Immunomodulatory activity of ginsan，a polysaccharide of Panax ginseng，on dendritic cells［J］.Korean J Physiol Pharmacol，2009，13（3）：169－73.

［13］Li C，Cai J，Geng J，et al.Purification，characterization and anticancer activity of a polysaccharide from Panax ginseng［J］.Int J Biol Macromol，2012，51（5）：968－73.

［14］Niu J，Pi Z，Yue H，et al.Effect of ginseng polysaccharide on the urinary excretion of type 2 diabetic rats studied by liquid chromatography-mass spectrometry［J］.J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2012，907：7－12.

［15］Ramos A M，Aller P.Quercetin decreases intracellular GSH content and potentiates the apoptotic action of the antileukemic drug arsenic trioxide in human leukemia cell lines［J］.Biochem Pharmacol，2008，75（10）：1912－23.