體外活細胞定向遷移研究方法的建立

蔡文杰，王銘潔

（1.上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)教研室，上海 200093；2.復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院生理與病理生理學(xué)系，上海 200032）

趨化是指細胞隨環(huán)境中化學(xué)物質(zhì)的分布梯度作定向運動的現(xiàn)象［1］。許多細胞具有感受環(huán)境中趨化因子的能力，從而產(chǎn)生特定的生理與病理生理現(xiàn)象。比如細菌釋放炎癥因子，中性粒細胞感知后能朝向炎癥部位運動，最終到達該部位，發(fā)揮吞噬功能，起到免疫防護作用［2］。在創(chuàng)傷修復(fù)、組織再生、干細胞歸巢以及腫瘤轉(zhuǎn)移等過程中也都存在趨化現(xiàn)象［3］。本研究通過建立活細胞定向遷移研究平臺，探索在體外評價細胞運動和趨化能力的標準，為細胞遷移信號通路的研究提供實驗方法。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 蔡司倒置顯微鏡，Eppendorf顯微操縱儀、顯微注射儀和毛細管針，腔室蓋玻片（丹麥NUNC公司）。HL-60細胞株（ATCC），DMSO、牛血漿來源纖連蛋白、N-甲酰甲硫氨酰－亮氨酰－苯丙氨酸（N-formylmethionyl-leucylphenyl-alanine，fMLP）和 AS605240（美國 SIGMA公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 誘導(dǎo)HL-60細胞株成為中性粒細胞 人原髓細胞白血病細胞株（HL-60）在體積分數(shù)為0.20的胎牛血清－RPMI 1640培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)，用體積分數(shù)為0.013的 DMSO處理細胞5～6 d，誘導(dǎo)其分化為中性粒細胞。

1.2.2 慢病毒介導(dǎo)基因表達 把PH-Akt-GFP克隆到慢病毒表達載體FUW2中，將其與另外3個質(zhì)粒pMDL、pRSV、pCMV同時轉(zhuǎn)染293T細胞，2～3 d后將培養(yǎng)液超速離心得到病毒顆粒。慢病毒感染HL-60細胞后通過流式細胞術(shù)分選陽性細胞，最終得到表達PH-Akt-GFP的穩(wěn)轉(zhuǎn)株。

1.2.3 準備供成像的活細胞 中性粒細胞離心后用改良HBSS緩沖液（137 mmol·L－1NaCl，4 mmol·L－1KCl，1.2 mmol·L－1MgCl2，10 mmol·L－1glucose和 20 mmol·L－1HEPES，pH 7.4）洗滌，再次離心后用含質(zhì)量分數(shù)為0.2%的BSA緩沖液重懸細胞，接種于預(yù)先用100 mg·L－1人纖連蛋白包被的腔室蓋玻片，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育15～20 min，換液后去除未貼壁細胞。

1.2.4 準備顯微鏡和顯微注射系統(tǒng) 趨化因子（1μmol·L－1fMLP）用 0.22μm濾膜過濾，離心 5 min（10 000 r·min－1）去除未溶解雜質(zhì)。毛細管針內(nèi)注入10μl fMLP后安裝于顯微注射儀上，鏡下確認針尖端通暢且無氣泡。

1.2.5 顯微成像 研究單細胞遷移和趨化時，采用低倍（100～200倍）光鏡拍攝，圖像采集間隔為30～60 s。研究信號分子和骨架的動態(tài)分布時，采用高倍（400～630倍）熒光顯微鏡（或者激光共聚焦）拍攝，圖像采集間隔為5 s到10 s。

1.2.6 數(shù)據(jù)評價 用遷移速度（motility speed）、趨化速度（chemotaxis motility）、趨化指數(shù)（chemotaxis index）和持續(xù)性（persistency）來評價采集到的數(shù)據(jù)。得到的結(jié)果以ˉx±s表示，統(tǒng)計學(xué)分析采用單因素方差分析方法比較組間差異。

2 結(jié)果

2.1 fMLP可促進中性粒細胞隨機遷移 無fMLP處理的HL-60遷移速率為（1.40±0.28）μm·min－1，fMLP處理后細胞遷移速率明顯增加，達到（5.94±0.38）μm·min－1，見Fig 1。

2.2 fMLP可誘導(dǎo)中性粒細胞定向遷移 在未放置含1 μmol·L－1fMLP的毛細管針時，細胞隨機運動。當把毛細管針放置到觀察視野中心位置底面時候，很快引起細胞出現(xiàn)暫時性的鋪展。在2 min內(nèi)，細胞分辨出fMLP的方向，開始朝向毛細管針遷移，直到到達針尖處（趨化因子濃度最高點）。見Fig 2。

2.3 AS605240抑制中性粒細胞定向遷移 細胞預(yù)先使用PI3K抑制劑 AS605240（10μmol·L－1）或其溶劑 DMSO處理30min，然后將含1μmol·L－1fMLP毛細管針放置到視野中，開始記錄細胞的遷移情況。用Image J軟件分析趨化的各種指標，發(fā)現(xiàn)AS605240處理后的細胞與對照組細胞相比，遷移速度降低（1.94±0.21）vs（3.12±0.24）μm·min－1，趨化速度降低（0.51±0.13）vs（1.01±0.21）μm·min－1，趨化指數(shù)減少（0.19±0.03）vs（0.36±0.05），持續(xù)性變差（0.29±0.04）vs（0.47±0.05），且差異皆有統(tǒng)計學(xué)意義（Fig 3）。

Fig 1 fMLP promotes random migration of HL-60 neutrophils（n＝21）A：Control；B：100 nmol·L－1 fMLP treated.P＜0.01.

Fig 2 Directional migration of HL-60 neutrophils towards fMLP gradientA：0 min；B：1.5 min；C：24 min；D：Migrating tracks.

Fig 3 AS605240 inhibits directional migration of HL-60 neutrophils towards fMLP gradientA：Migration track of DMSO treated cells；B：Migration track of AS605240 treated cells；C：Statistics of motility speed and chemotaxis speed；D：Statistics of chemotaxis index and persistency.*in A and B indicates the location of micropipette.In C and D，*P＜0.05，**P＜0.01 vs DMSO group.

2.4 信號分子標記物在活細胞中的動態(tài)分布 含1μmol·L－1fMLP毛細管針放置到視野中后，引起細胞膜PIP3產(chǎn)生增加，PH-Akt-GFP熒光標記物轉(zhuǎn)位到細胞膜上；1 min后，PIP3的產(chǎn)生主要發(fā)生在細胞前端朝向高濃度fMLP處；重置毛細管針引起fMLP濃度梯度方向的改變，進而導(dǎo)致PH-Akt-GFP熒光標記物發(fā)生重定位，朝向新的濃度梯度（Fig 4）。

Fig 4 PIP3 probe PH-Akt-GFP relocate with fMLP micropipetteA：10 sec；B：1 min；C：Relocation of the micropipette.*indicates the location of micropipette.Arrows show local accumulation of PH-Akt-GFP on the plasma membrane.

3 討論

趨化通常包括方向感知、細胞極化和運動3個過程［4］，但這幾個過程并不是完全獨立的，而是相輔相成的。細胞通過膜上的趨化受體感知外界信號，通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，把環(huán)境中微弱的趨化因子濃度差異轉(zhuǎn)換為細胞膜上明顯的信號分子分布差異，進一步使細胞內(nèi)與運動相關(guān)的分子進行重分布，細胞出現(xiàn)形態(tài)上變長，其中一端成為前端，另一端成為后端或稱為尾端。前端的信號蛋白如Rac等引起肌動蛋白聚合［5］，后者又通過一種正反饋機制激活 PI3K，使得極性增強。PI3K活化后催化PIP2生成PIP3，PIP3可以結(jié)合蛋白的PH功能域，因此，當細胞過表達PH功能域后就可以實時監(jiān)測細胞PI3K的活化狀況［6］。中性粒細胞對fMLP的反應(yīng)以PI3Kγ的激活最為重要［7］，因此，當利用了 PI3Kγ特異性的抑制劑AS605240后，細胞的趨化能力明顯降低。

評價細胞趨化能力的常用指標有遷移速度、趨化速度、趨化指數(shù)和持續(xù)性［8］，其中，遷移速度是指細胞在單位時間內(nèi)實際遷移了多少距離，趨化速度是指細胞在單位時間內(nèi)向趨化源遷移了多少有效距離，趨化指數(shù)是指趨化速度除以遷移速度得到的商，持續(xù)性是指起點和終點的直線距離除以遷移的總距離。這些指標綜合起來可以較好地反映出細胞對趨化源的反應(yīng)能力和自身的趨化能力。

目前，常用的檢測細胞遷移的方法有細胞劃痕實驗、Transwell小室遷移實驗等［9］，這些方法簡單有效，不需要特殊的儀器設(shè)備，缺點是數(shù)據(jù)比較籠統(tǒng)，反映的是群體遷移，不能完全排除細胞增殖的影響，不能分辨出細胞對所加藥物是否具有趨化性。在我們的實驗中，藥物通過毛細管針緩慢釋放，維持一定的濃度梯度，從而可以很好地觀察細胞對藥物的反應(yīng)能力，而且，我們是對單細胞進行動態(tài)觀察，因此得到的信息量很大，可以進行多種后續(xù)分析。但該方法對顯微鏡要求比較高，需要得到高質(zhì)量的圖像，這樣才能通過軟件把細胞與背景區(qū)分開，實現(xiàn)數(shù)據(jù)的自動分析。雖然在我們的實驗中用的是快運動細胞，但相關(guān)方法也同樣適用于慢運動細胞的趨化，因此，該方法應(yīng)用前景廣泛。

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