內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)高脂及棕櫚酸致骨骼肌胰島素抵抗及非諾貝特的干預(yù)機制初探

鮑瑩瑩，魯云霞，陳冠軍，程靜靜，章 秋

（1.安徽醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，安徽合肥 230022；2.安徽醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)教研室，安徽 合肥 230032；3.安徽醫(yī)科大學(xué)化學(xué)教研室，安徽合肥 230032）

隨著人們生活方式和飲食習(xí)慣的改變，代謝綜合征已成為新型流行性疾病，胰島素抵抗（insulin resistance，IR）是其重要的病理學(xué)特征之一［1］。骨骼肌是體內(nèi)最大、分布最廣的代謝活性組織，約占機體重量的40%，承擔(dān)了機體絕大部分脂肪酸的攝取和氧化利用，以及胰島素刺激下70%～90%的葡萄糖吸收，是發(fā)生IR的主要外周組織［2］，但其參與IR的具體機制目前尚不很清楚。

近年來，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）作為IR和肥胖發(fā)生的重要環(huán)節(jié)，已引起了廣泛的關(guān)注［3］。非諾貝特（fenofibrate，F(xiàn)F）是臨床常用的調(diào)脂藥，可降脂、抗炎、抗氧化應(yīng)激和改善IR，但尚無其參與 ERS介導(dǎo)骨骼肌 IR的報道［4］。本研究擬通過動物實驗研究非諾貝特對高脂血癥大鼠骨骼肌組織ERS及IR的影響；非諾貝特酸（fenofibric acid，F(xiàn)A）是非諾貝特在體內(nèi)的代謝產(chǎn)物，通過細胞驗研究FA對棕櫚酸（palmitic acid，PA）誘導(dǎo)小鼠骨骼肌細胞C2C12中產(chǎn)生ERS及IR的影響，旨在揭示非諾貝特改善IR的機制是否與減少ERS有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與細胞株 SD大鼠45只，8周齡，清潔級，♀，體質(zhì)量180～200 g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。小鼠C2C12骨骼肌細胞株，由中國科學(xué)院北京生物物理學(xué)研究所劉平生研究員惠贈。

1.2 主要藥物與試劑 非諾貝特購自江蘇神龍藥業(yè)有限公司；非諾貝特酸、胰島素、棕櫚酸、衣霉素、無游離脂肪酸的牛血清白蛋白購自美國Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基購自美國Invitrogen公司；四季青胎牛血清購自浙江天杭生物科技有限公司；RT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Fermentas Life Sciences；RNAiso Reagent、Real-time PCR試劑盒購自大連寶生物工程有限公司；所有引物均采用Primer 5.0軟件設(shè)計，由上海生工生物工程公司合成（Tab 1和Tab 2）。RIPA裂解液購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。鼠抗GAPDH單克隆抗體、鼠抗CHOP單克隆抗體、兔抗Akt和p-Akt多克隆抗體均購自美國CST公司；兔抗GRP78多克隆抗體購自美國Abcam公司；羊抗小鼠二抗、羊抗兔二抗、FITC標記羊抗小鼠二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；增強化學(xué)發(fā)光底物檢測試劑盒（ECL發(fā)光劑）購自碧云天生物技術(shù)研究所；DAPI購自Biosharp生物科技有限公司。

1.3 動物和分組 將SD大鼠隨機分為標準飲食組（SCD，n＝12）和高脂飲食組（HFD，n＝33）。SCD組給予標準飼料，由安徽醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供；HFD組給予國際標準化高脂飲食（D12451，脂肪含量為45%）。20周后，取體重明顯增加的大鼠24只隨機分為HFD組（n＝12）和高脂飲食＋非諾貝特組（HFD＋FF，n＝12），HFD組繼續(xù)給予高脂飲食8周，HFD＋FF組在給予高脂飲食的同時給予非諾貝特灌胃治療，參考文獻［5］采用單一劑量（30 mg·kg－1·d－1）干預(yù)8周。

1.4 胰島素抵抗檢測 28周時，大鼠禁食12 h，灌胃給予葡萄糖（2 g·kg－1體重，生理鹽水配制），分別于0、30、60、90、120 min鼠尾采血測定血糖水平，行葡萄糖耐量實驗（GTT）；4 d后大鼠禁食4 h，腹腔注射胰島素（1 U·kg－1體重），分別于 0、30、60、90、120 min鼠尾采血測定血糖水平，行胰島素耐量實驗（ITT）。采血量約為5μl，采血過程中大鼠生命體征平穩(wěn)。

1.5 血清脂代謝指標測定 所有大鼠禁食12 h后稱重，水合氯醛麻醉，腹主動脈取血，3 000 r·min－1離心5 min，分離血清，分析血清葡萄糖（FBG）、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）。

1.6 骨骼肌基因表達的檢測 提取各組大鼠比目魚肌總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，Real-time RT-PCR分析PPARα及GRP78、CHOP基因的表達，在美國ABI公司StepOnePlus儀上進行擴增，用比較Ct法（△△Ct）分析結(jié)果。

1.7 骨骼肌細胞培養(yǎng) 高糖DMEM培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清、105IU·L－1青霉素、105IU·L－1鏈霉素為完全培養(yǎng)基，骨骼肌細胞株C2C12用完全培養(yǎng)基在37℃、5%CO2、95%濕度的條件下培養(yǎng)。當(dāng)細胞生長密度達80%時，換成含0.5%無游離脂肪酸的牛血清白蛋白（BSA）的DMEM，將細胞分為正常對照組（NC組）、模型組（0.4 mmol·L－1棕櫚酸組，PA）、陽性對照藥組（1 mg·L－1衣霉素組，TM）、治療組（0.4 mmol·L－1棕櫚酸 ＋0.2 mmol·L－1非諾貝特酸組，PA＋FA），均孵育24 h，PA和FA的作用劑量和時間參考文獻［6－7］，并根據(jù) RT-PCR結(jié)果確定，其中FA提前8 h預(yù)孵育。收集細胞用于RTPCR、細胞免疫熒光和Western blot檢測。100 nmol·L－1胰島素刺激細胞30 min后收集蛋白樣品，Western blot檢測Akt蛋白及p-Akt水平。

Tab 1 Primer sequences used for Realtime RT-PCR analysis of gene expression in rat skeletal muscles

Tab 2 Primer sequences used for RT-PCR analysis of gene expression in mouse skeletal cells

1.8 細胞基因表達的檢測 提取各組細胞總RNA，RT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA，檢測GRP78、CHOP的基因表達，以大鼠GAPDH基因作為內(nèi)參，在英國TECHNE PCR儀上進行擴增，2%瓊脂糖凝膠電泳，檢測基因表達水平。

1.9 細胞免疫熒光 4%多聚甲醛4℃固定細胞后，0.5%Triton-100破膜，5%BSA封閉后加鼠抗CHOP單克隆抗體，4℃孵育過夜，F(xiàn)ITC標記山羊抗小鼠孵育1 h，DAPI孵育10 min，抗熒光淬滅封片劑封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.10 Western blot 取0.1 g比目魚肌或1×106的C2C12細胞，RIPA裂解液制備勻漿，12 000 r·min－1、4℃離心15 min，取上清抽提總蛋白。12%SDS-PAGE分離膠和5%SDS-PAGE濃縮膠凝膠電泳后，轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉后，分別孵育 GAPDH、GRP78、Akt、p-Akt一抗，4℃過夜，HRP標記的二抗孵育1.5 h，X線片曝光、顯影及定影。

1.11 統(tǒng)計學(xué)方法 SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，所有實驗數(shù)據(jù)以ˉx±s表示，多組間均數(shù)比較采用方差分析（ANOVA），兩兩比較采用最小顯著差異法（LSD法）。

2 結(jié)果

2.1 非諾貝特對高脂血癥大鼠體重、糖脂代謝指標的影響 與SCD組相比，28周的國際標準化高脂飲食（D12451）導(dǎo)致 HFD組大鼠體重、血 FBG、TG、TC水平明顯增加、HDL-C水平明顯下降（P＜0.05）。與HFD組相比，8周非諾貝特干預(yù)后，HFD＋FF組大鼠體重、血FBG、TG水平明顯降低、HDL-C水平明顯上升（P＜0.05）；血清TC水平雖然降低，但差異無顯著性（P＞0.05）。各組大鼠之間血清LDL-C水平差異均無顯著性（P＞0.05）（Tab 3）。

Tab 3 Effects of fenofibrate on glucose and lipid metabolic parameters in hyperlipidemic rats±s，n＝12）

Tab 3 Effects of fenofibrate on glucose and lipid metabolic parameters in hyperlipidemic rats±s，n＝12）

*P＜0.05 vs SCD group；＃P＜0.05 vs HFD group

Parameter SCD HFD HFD＋FF Body weight／g 294±14 416±19* 352±16＃FBG／mmol·L－1 6.03±0.23 8.69±0.30*7.68±0.22＃TG／mmol·L－1 0.36±0.07 1.16±0.11*0.69±0.08＃TC／mmol·L－1 2.28±0.44 3.92±0.48*3.59±0.45 LDL-C／mmol·L－1 0.41±0.09 0.49±0.08 0.48±0.08 HDL-C／mmol·L－1 1.42±0.13 1.18±0.11*1.39±0.14＃

2.2 非諾貝特對高脂血癥大鼠胰島素抵抗的影響GTT和ITT實驗都顯示HFD組空腹血糖比SCD組、HFD＋FF組均高。GTT實驗顯示，HFD組給予葡萄糖30 min后血糖達高峰，且比SCD組、HFD＋FF組峰值均高，此后緩慢下降；與HFD組相比，HFD＋FF組空腹血糖降低，給予葡萄糖后30 min時峰值降低，血糖波動較小。ITT實驗顯示，注射胰島素后，SCD組血糖迅速下降，30 min時達最低值后血糖緩慢上升；HFD組血糖緩慢下降，且始終維持在較高水平，90 min時達最低值后血糖緩慢上升；HFD＋FF組各點血糖值介于HFD和SCD組之間，注射胰島素后血糖下降至60 min時達最低值，隨后緩慢上升（Fig 1）。

2.3 非諾貝特對高脂血癥大鼠骨骼肌ERS基因表達的影響 與SCD組相比，HFD組PPARα表達無明顯改變（P＞0.05），但 HFD＋FF組PPARα表達水平明顯增加（P＜0.05），表明FF明顯激活骨骼肌中PPARα的表達。與SCD組相比，HFD組GRP78、CHOP的基因表達水平均明顯增加（P＜0.05），表明標準化高脂飲食明顯激活了骨骼肌組織中的ERS；與HFD組比較，HFD＋FF組GRP78和CHOP基因表達水平均明顯降低（P＜0.05），顯示骨骼肌組織中激活的 ERS被明顯改善（Fig 2）。Western blot檢測了各組大鼠骨骼肌GRP78蛋白表達水平的變化，其結(jié)果與mRNA水平的表達改變相一致（Fig 3）。

2.4 非諾貝特酸對棕櫚酸誘導(dǎo)的C2C12中ERS基因表達的影響 與NC組相比，PA或TM誘導(dǎo)的骨骼肌細胞GRP78和CHOP的mRNA表達水平均明顯增加（P＜0.05），表明ERS被激活。PA＋FA組GRP78和 CHOP mRNA明顯降低（P＜0.05），ERS得到明顯改善（Fig 4）。Western blot、免疫熒光分別檢測各組細胞GRP78和CHOP蛋白表達水平，與其mRNA水平表達變化的結(jié)果相一致（Fig 5、6）。PA或TM誘導(dǎo)的C2C12細胞Akt Ser473磷酸化水平明顯降低，PA＋FA組Akt Ser473磷酸化水平增加（Fig 5）。

3 討論

ER是細胞內(nèi)膜型／分泌型蛋白質(zhì)合成的細胞器，對細胞的營養(yǎng)和能量狀況高度敏感，在新合成蛋白的折疊和成熟過程中起重要作用。錯誤折疊的蛋白質(zhì)聚集和脂質(zhì)合成紊亂時，引發(fā)未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR）和 ERS［8－9］。在骨骼肌細胞中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)被稱為肌漿網(wǎng)（sarcoplasmic reticulum，SR），調(diào)控細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)和蛋白質(zhì)的合成。

已有研究報道高脂飲食可能通過激活骨骼肌的ERS而介導(dǎo)IR［10］，而C2C12中ERS也可能介導(dǎo)PA誘導(dǎo)的IR［6］。非諾貝特是PPARα的特異性激動劑，具有抗氧化應(yīng)激、抑制炎癥反應(yīng)、抗凋亡等作用，可降低2型糖尿病血管并發(fā)癥的風(fēng)險［11］，但尚無其對骨骼肌ERS影響的報道。本研究的創(chuàng)新之處是通過研究非諾貝特（酸）對高脂血癥大鼠骨骼肌組織和細胞中IR和ERS的影響，討論了非諾貝特改善骨骼肌IR的新機制。

Fig 1 Effects of fenofibrate on insulin resistance in hyperlipidemic rats*P＜0.05 vs SCD group；＃P＜0.05 vs HFD group

Fig 2 Effects of fenofibrate on mRNA expression of PPARα，GRP78 and CHOP in skeletal muscle of hyperlipidemic ratsReal-time RT-PCR analysis of PPARα，GRP78，CHOP mRNA expression and the relative mRNA level was normalized to a standard housekeeping gene GAPDH.*P＜0.05 compared with SCD group；＃P＜0.05 compared with HFD group

Fig 3 Effects of fenofibrate on GRP78 protein expression in skeletal muscle of hyperlipidemic ratsWestern blot analysis of GRP78 protein and the relative protein level was normalized to GAPDH.*P＜0.05 vs SCD group；＃P＜0.05 vs HFD group.

Fig 4 Effects of fenofibric acid on GRP78 and CHOP mRNA expression in C2C12 induced by palmitic acidNC：normal control；PA：palmitic acid；PA＋FA：palmitic acid＋fenofibric acid；TM：tunicamycin.*P＜0.05 compared with NCgroup；＃P＜0.05 compared with PA group

Fig 5 Effects of fenofibric acid on GRP78 protein expression and Akt phosphorylation in C2C12 induced by palmitic acid*P＜0.05 vs NCgroup；＃P＜0.05 vs PA group

♀大鼠由于雌激素的保護作用，發(fā)展為高脂血癥的時間一般比♂大鼠長［12］。本實驗通過國際標準化高脂飲食喂養(yǎng)♀SD大鼠28周，HFD組大鼠體重、血FBG、TG、TC水平均明顯增加，HDL-C水平明降低，GTT和ITT實驗提示HFD組出現(xiàn)明顯的IR，說明已成功建立了♀高脂血癥伴IR大鼠模型。參考文獻［5］，非諾貝特（30 mg·kg－1·d－1）灌胃治療8周后，體重、血FBG、TG水平明顯下降，HDL-C水平升高，IR明顯改善，說明非諾貝特具有明顯的降脂和改善IR的作用。高脂組骨骼肌組織GRP78、CHOP的基因表達水平均明顯增加，治療組這兩個指標的表達水平均明顯下降，說明標準化高脂飲食已誘導(dǎo)骨骼肌組織產(chǎn)生ERS，非諾貝特具有明顯的改善ERS作用。

棕櫚酸（PA）是高脂飲食中含量最多的飽和脂肪酸［13］，為了進一步明確高脂飲食誘導(dǎo)骨骼肌細胞產(chǎn)生ERS以及非諾貝特的體內(nèi)代謝形式非諾貝特酸（FA）的保護作用，在細胞實驗中，用FA預(yù)孵育骨骼肌細胞C2C12后再加入PA誘導(dǎo)，同時選用衣霉素作為誘導(dǎo)產(chǎn)生ERS的陽性對照藥。結(jié)果顯示，PA可誘導(dǎo)C2C12中CHOP和GRP78的mRNA和蛋白表達，同時Akt Ser473的磷酸化被明顯抑制，提示PA確實誘導(dǎo)骨骼肌C2C12細胞產(chǎn)生了ERS和IR，而FA的預(yù)孵育可明顯改善PA誘導(dǎo)的ERS和IR。

有研究提示，非諾貝特可通過增加骨骼肌組織中解偶聯(lián)蛋白3（UCP3）基因的表達來增加胰島素的敏感性［14］，而本研究從體內(nèi)和體外實驗兩方面來研究非諾貝特對高脂血癥大鼠骨骼肌組織、非諾貝特酸對棕櫚酸誘導(dǎo)骨骼肌細胞 ERS和IR的影響，初步證實了其降脂和改善IR的機制可能與其明顯減少ERS水平有關(guān)，為開發(fā)非諾貝特作為治療代謝綜合征的藥物奠定新的理論基礎(chǔ)。

Fig 6 Effects of fenofibric acid on CHOP protein expression in C2C12 induced by palmitic acid

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