siRNA沉默MAG促進(jìn)腦出血后大鼠運(yùn)動(dòng)功能的改善*

劉安民，羅銘，蔡望青，陳舒，何明亮，潘偉生

(中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院1神經(jīng)外科，2腫瘤科，廣東廣州 510120;3香港中文大學(xué)，中國香港)

siRNA沉默MAG促進(jìn)腦出血后大鼠運(yùn)動(dòng)功能的改善*

劉安民1△，羅銘2，蔡望青1，陳舒1，何明亮1，潘偉生3

(中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院1神經(jīng)外科，2腫瘤科，廣東廣州 510120;3香港中文大學(xué)，中國香港)

目的:研究慢病毒介導(dǎo)的siRNA沉默髓鞘相關(guān)糖蛋白(MAG)對腦出血后脫髓鞘再生和神經(jīng)功能恢復(fù)的影響。方法：SD大鼠45只，隨機(jī)分為3組:模型+siRNA組、模型+PBS組和正常對照組，每組15只。膠原酶誘導(dǎo)建立腦出血模型，據(jù)不同組別于模型術(shù)后1 d立體定向下進(jìn)行側(cè)腦室注射攜帶MAG基因siRNA的慢病毒和PBS。分別于治療前1 d和治療后1、7、14、21 d用Rotarod運(yùn)功功能評分檢測大鼠神經(jīng)功能情況，應(yīng)用勞克堅(jiān)牢藍(lán)(luxol fast blue)檢測腦損傷區(qū)的神經(jīng)纖維恢復(fù)情況，利用免疫組化和Western blotting檢測MAG的表達(dá)變化。結(jié)果:Rotarod評分檢測腦出血模型大鼠術(shù)后的運(yùn)動(dòng)功能，模型+siRNA組的神經(jīng)功能改善和神經(jīng)纖維修復(fù)較模型+ PBS組明顯提高(P＜0.05)，勞克堅(jiān)牢藍(lán)染色示siRNA組較PBS組的神經(jīng)纖維損害范圍縮小，siRNA組的MAG蛋白的表達(dá)較PBS組明顯下降(P＜0.05)。結(jié)論:siRNA沉默MAG后明顯提高神經(jīng)纖維髓鞘再生能力，促進(jìn)腦出血后神經(jīng)功能缺失的修復(fù)。

髓鞘相關(guān)糖蛋白;RNA干擾;髓鞘再生;腦出血;大鼠

自發(fā)性腦出血(intracerebral hemorrhage，ICH)是一種臨床常見病，其發(fā)病率、死亡率很高，即使生存者也往往留下明顯的神經(jīng)功能障礙，但至今對其病理損傷機(jī)制尚不完全明確［1］。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，髓鞘相關(guān)糖蛋白(myelin-associated glycoprotein，MAG)是維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)纖維髓鞘結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定的重要結(jié)構(gòu)，ICH后MAG蛋白的表達(dá)顯著升高，MAG是抑制ICH后髓鞘再生的重要原因之一［2-3］。許多研究證實(shí)，髓鞘的相關(guān)抑制因子(如MAG等)是神經(jīng)再生的關(guān)鍵性抑制因素［4-5］。在近期的研究中，我們采用RNA干擾技術(shù)，構(gòu)建重組慢病毒載體，篩選鑒定出的shRNA能高效、特異性沉默MAG的表達(dá)［6］。本研究將把已經(jīng)鑒定的、穩(wěn)定表達(dá)MAG siRNA的慢病毒載體利用腦定向注入ICH模型的側(cè)腦室內(nèi)，探討沉默MAG對ICH后腦損傷髓鞘再生的作用。

材料和方法

1 主要材料

SD大鼠(中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，膠原酶Ⅳ型(Sigma)，鼠抗人MAG單克隆抗體和鼠抗actin多克隆抗體為Santa Cruz產(chǎn)品。立體定位儀為David Kopf Instruments產(chǎn)品，微型顱鉆為NSK Volvere GX產(chǎn)品，上海安亭微量進(jìn)樣器廠微量進(jìn)樣器，Rotarod motor test測試儀由中山大學(xué)藥學(xué)院提供，Bio-Rad電泳儀，OKAMOTO X3自動(dòng)X線顯影儀，Bio-Rad Model GS-670灰度分析掃描儀，Canon照相機(jī)和Zeiss顯微鏡成像系統(tǒng)。

2 動(dòng)物和分組

健康雄性SD大鼠45只，體重220～230 g，鼠齡10周。實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為模型+siRNA組、模型+PBS組和正常對照組，每組15只。

3 模型制作

內(nèi)囊腦出血?jiǎng)游锬Ｐ投ㄎ唬?］:腹腔注射麻醉后，俯臥位將大鼠頭部固定在立體定位儀上，保持前囟和后囟在同一水平。于顱正中線上切開皮膚約1.5 cm，據(jù)定位用顱鉆鉆一直徑約1 mm的骨孔，通過立體定位儀定位，利用微量進(jìn)樣器將0.21 CDU/1.5 μL膠原酶Ⅳ型緩慢推進(jìn)腦內(nèi)，注射時(shí)間維持5 min，注射完后將針停留5 min后緩慢退針，再用骨蠟封閉骨孔、縫合頭皮。

4 重組慢病毒MAG基因siRNA的制備

我們成功完成了運(yùn)用慢病毒載體系統(tǒng)進(jìn)行重組慢病毒MAG siRNA的制備，并證實(shí)慢病毒介導(dǎo)的shRNA干擾技術(shù)可特異性沉默MAG的表達(dá)，見參考文獻(xiàn)［6］。

5 側(cè)腦室注射方法

大鼠左側(cè)腦室模型定位［2-3］，顱骨背側(cè)中線左旁1.3 cm，前囟前0.8 cm，深度為腦表面下3.7 cm。操作步驟:操作步驟基本同模型制作，通過立體定位儀定位，利用微量進(jìn)樣器據(jù)不同組別將6 μL慢病毒MAG基因siRNA(1×1011cfu/L)和6 μL PBS緩慢推進(jìn)ICH模型大鼠的左側(cè)腦室內(nèi)，注射時(shí)間維持5 min，注射完后將針停留5 min后緩慢退針。

6 大鼠行為學(xué)檢測

大鼠行為學(xué)檢測:運(yùn)用Rotarod運(yùn)動(dòng)功能測試評分［2，7］。前3 d開始進(jìn)行Rotarod功能訓(xùn)練，大鼠放在加速、旋轉(zhuǎn)的圓柱體上(5 min內(nèi)4～40 r/min)，記錄大鼠在Rotarod上停留的時(shí)間。以大鼠從柱上掉下、抱住圓柱、旋轉(zhuǎn)2圈或以上為測試結(jié)束。分別記錄術(shù)前1 d和治療后1、7、14、21 d大鼠在Rotarod柱上的持續(xù)時(shí)間。每個(gè)時(shí)點(diǎn)測試3次，取最長的持續(xù)時(shí)間(以秒計(jì)算)為每次測試時(shí)間。將術(shù)后測試時(shí)間與術(shù)前最長測定時(shí)間相比的百分率作為比較參數(shù)。

7 標(biāo)本處理、組織學(xué)染色和蛋白定量分析

于術(shù)后第21 d行為學(xué)實(shí)驗(yàn)后處死大鼠，腦組織按常規(guī)處理，石蠟包埋固定，做層厚5 μm切片，進(jìn)行勞克堅(jiān)牢藍(lán)(Luxol fast blue)染色觀察神經(jīng)纖維情況和免疫組化染色觀察MAG。常規(guī)取腦組織，Western bloting測定MAG蛋白含量。

8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，運(yùn)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量分析

所有動(dòng)物術(shù)后均存活，無一傷口感染、死亡等。術(shù)后腦出血模型大鼠均出現(xiàn)肢體偏癱癥狀，再次手術(shù)進(jìn)行治療后大鼠均存活，無一死亡例數(shù)。所有45只大鼠均進(jìn)入結(jié)果分析。

2 siRNA干預(yù)對ICH大鼠運(yùn)動(dòng)功能的影響

模型+PBS組和模型+siRNA組大鼠治療后1、7 d的Rotarod評分無顯著差異(P＞0.05)。治療后14 d，模型+siRNA組的Rotarod持續(xù)時(shí)間較模型+ PBS組明顯延長(P＜0.05)，此種差異一直延續(xù)到治療后21 d，見圖1。

Figure 1.Results of Rotarod motor test.Model+siRNA group showed better performance from 14 d and these benefits continuned up to the 21st day.Mean±SD.n= 6.*P＜0.05 vs model+PBS group.圖1 大鼠Rotarod運(yùn)動(dòng)功能評分比較

3 siRNA治療對有髓神經(jīng)纖維的修復(fù)

術(shù)后21 d的腦組織切片勞克堅(jiān)牢藍(lán)染色結(jié)果顯示，有髓纖維呈鮮藍(lán)色，神經(jīng)細(xì)胞胞體及尼氏體呈微紫色。正常組腦內(nèi)有髓纖維正常分布，模型+PBS組血腫周圍組織僅有少量藍(lán)染的有髓神經(jīng)纖維，模型+siRNA組可見較多的藍(lán)染有髓神經(jīng)纖維;在血腫周圍組織，模型+siRNA組較模型+PBS組的神經(jīng)纖維損害范圍縮小，見圖2。

Figure 2.Representative images of Luxol fast blue staining of myelin in coronal sections of the ipsilateral internal capsule with intracerebral hemorrhage(ICH)on the 21st day(×50).A:normal rat;B:remarkable demyelination in ICH rat with intracerebroventricular injection of PBS;C:significant remyelination in ICH rat treated with lentiviral-siRNA of MAG gene.圖2 術(shù)后21 d腦組織勞克堅(jiān)牢藍(lán)染色結(jié)果

4 siRNA治療對腦組織MAG蛋白表達(dá)的影響

免疫組織化學(xué)染色顯示，MAG主要位于胼胝體和白質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞漿內(nèi);模型+siRNA組血腫周圍組織的MAG表達(dá)較模型+PBS組明顯下降，見圖3。經(jīng)Western blotting定量分析可見，與模型+ PBS組比較，模型+siRNA組MAG的含量明顯降低(P＜0.05)，見圖4。

討論

腦出血是指原發(fā)的非外傷性的腦實(shí)質(zhì)內(nèi)出血，其急性期病死率高，即使幸存，也約有75%不同程度喪失勞動(dòng)能力，重度致殘者占40%以上，給社會(huì)和家庭帶來了巨大的負(fù)擔(dān)。由于對ICH的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，目前臨床實(shí)踐中還無特別有效的治療方法。近來研究發(fā)現(xiàn)，ICH后可引起血腫周圍髓鞘和軸索損傷，與維持神經(jīng)纖維髓鞘結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定的MAG等出現(xiàn)明顯的改變;由此導(dǎo)致的脫髓鞘損傷是ICH后神經(jīng)功能缺損的重要原因［2-3，8］。

MAG是一種跨膜糖蛋白，參與髓鞘化的啟動(dòng)及髓鞘化軸突與膠質(zhì)突起之間穩(wěn)定連接的維持［9］。研究還發(fā)現(xiàn)，MAG在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中有維持髓鞘的完整性和抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)軸突再生的作用［4-5］;研究表明，通過免疫耗竭法除去MAG后，可明顯減少髓鞘對軸突生長的抑制作用［9］。在合適的微環(huán)境下可以利于髓鞘的再生，即可以通過抑制阻礙再生和增強(qiáng)促進(jìn)再生的因素來促進(jìn)神經(jīng)的再生能力［10］。RNA干擾技術(shù)是由雙鏈RNA介導(dǎo)的，在轉(zhuǎn)錄后mRNA水平關(guān)閉相應(yīng)基因表達(dá)的過程，siRNA具有普遍性、高效性、特異性和記憶性，具有簡單、快速關(guān)閉特定基因功能的優(yōu)點(diǎn)［11-12］。本研究通過免疫組化和蛋白定量測定發(fā)現(xiàn)，重組慢病毒介導(dǎo)的MAG siRNA治療腦出血后能顯著降低腦組織中MAG蛋白的表達(dá)，基因沉默效果明顯。這為深入研究MAG在髓鞘損傷的發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

Figure 3.Representative images of immunohistochemical staining of myelin-associated glycoprotein(MAG;dark brown) in coronal sections of the ipsilateral internal capsule with intracerebral hemorrhage(ICH)on the 21st day (×100).A:normal rat;B:remarkable demyelination in ICH rat with intracerebroventricular injection of PBS;C:significant remyelination in ICH rat treated with lentiviral-siRNA of MAG gene.圖3 術(shù)后21 d血腫周圍組織MAG的免疫組化結(jié)果

Figure 4.Western blotting for myelin-associated glycoprotein (MAG)extracted from the ipsilateral cerebral tissues of rats on the 21st day.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs model+PBS group.圖4 Western blotting檢測術(shù)后21 d血腫周圍組織MAG蛋白的表達(dá)

研究證實(shí)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘磷脂中存在MAG軸突生長抑制性蛋白，它的抑制作用一方面與神經(jīng)節(jié)苷脂GD1a和GT1b結(jié)合，形成軸索結(jié)構(gòu)，維持軸索的穩(wěn)定性;另一方面它與Nogo receptor 1(NgR1)/ Nogo receptor 2(NgR2)受體結(jié)合，通過RhoA途徑，向胞內(nèi)傳遞抑制信號，明顯抑制突起的生長和生長錐的塌陷，抑制包括少突膠質(zhì)細(xì)胞在內(nèi)的軸突的生長［13］。本研究通過前期的量效關(guān)系預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，采用1×1011cfu/L的慢病毒MAG基因siRNA為最佳干擾劑量。因此，本研究采用該劑量siRNA能有效沉默MAG的表達(dá)，而且沉默MAG的表達(dá)后神經(jīng)纖維的修復(fù)較對照組明顯好轉(zhuǎn)，表現(xiàn)在行為學(xué)上大鼠的運(yùn)動(dòng)功能得到顯著改善。因此，本研究認(rèn)為，siRNA沉默MAG后能逆轉(zhuǎn)MAG抑制髓鞘再生的作用，從而有助于神經(jīng)纖維髓鞘再生，達(dá)到改善神經(jīng)缺失的目的。

［1］Thanvi BR，Sprigg N，Munshi SK.Advances in spontaneous intracerebral haemorrhage［J］.Int J Clin Pract，2012，66(6):556-564.

［2］Liu AM，Lu G，Tsang KS，et al.Umbilical cord-derived mesenchymal stem cells with forced expression of hepatocyte growth factor enhance remyelination and functional recovery in a rat intracerebral hemorrhage model［J］.Neurosurgery，2010，67(2):357-366.

［3］劉安民，羅銘，蔡望青，等.轉(zhuǎn)肝細(xì)胞生長因子的臍帶間質(zhì)干細(xì)胞移植促進(jìn)大鼠腦出血后髓鞘再生［J］.中國病理生理雜志，2009，25(10):1936-1940.

［4］Yiu G，He Z.Glial inhibition of CNS axon regeneration ［J］.Nat Rev Neurosci，2006，7(8):617-627.

［5］Mimura F，Yamagishi S，Arimura N，et al.Myelin-associated glycoprotein inhibits microtubule assembly by a Rho-kinase-dependent mechanism［J］.J Biol Chem，2006，281(23):15970-15979.

［6］陳舒，羅銘，蔡望青，等.靶向MAG基因shRNA慢病毒載體的構(gòu)建及其對MAG基因表達(dá)的沉默［J］.中國病理生理雜志，2013，29(9):1725-1728.

［7］劉安民，羅銘，金華偉，等.膠原酶誘導(dǎo)不同部位腦出血大鼠模型的神經(jīng)功能比較［J］.中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2008，25(5):615-616.

［8］Wasserman JK，Schlichter LC.White matter injury in young and aged rats after intracerebral hemorrhage［J］.Exp Neurol，2008，214(2):266-275.

［9］McKerracher L，David S，Jackson DL，et al.Identification of myelin-associated glycoprotein as a major myelinderived inhibitor of neurite growth［J］.Neuron，1994，13 (4):805-811.

［10］Demjen D，Klussmann S，Kleber S，et al.Neutralization of CD95 ligand promotes regeneration and functional recovery after spinal cord injury［J］.Nat Med，2004，10(4): 389-395.

［11］Bakhtiyari S，Haghani K，Basati G，et al.siRNA therapeutics in the treatment of diseases［J］.Ther Deliv，2013，4(1):45-57.

［12］萬璟，李小毛，舒珊榮，等.慢病毒介導(dǎo)的靶向沉默胰島素樣生長因子1型受體的siRNA對人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響［J］.中國病理生理雜志，2012，28(8):1352-1357.

［13］Schnaar RL，Lopez PH.Myelin-associated glycoprotein and its axonal receptors［J］.J Neurosci Res，2009，87 (15):3267-3276.

Therapeutic effect of MAG gene silencing by siRNA on remyelination and motor recovery after intracerebral hemorrhage in rats

LIU An-min1，LUO Ming2，CAI Wang-qing1，CHEN Shu1，HE Ming-liang1，PAN Weisheng3
(1Department of Neurosurgery，2Department of Oncology，Sun Yat-sen Memorial Hospital，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510120，China;3Chinese University of Hongkong，Hongkong，China.E-mail:drliuam@aliyun.com)

AIM:To study the functional rehabilitative effects of lentiviral vector-mediated siRNA silencing myelin-associated glycoprotein(MAG)on neurological improvement and remyelination after intracerebral hemorrhage (ICH)in rats.METHODS:ICH was induced in 45 adult male Sprague-Dawley rats by a stereotactically guided injection of bacterial type IV collagenase into the right internal capsule.Lentiviral vector-mediated siRNA targeting MAG(siRNA)，or PBS was administered left intracerebroventricularly 1 d after right internal capsule ICH.The Rotarod motor test scores were determined 1 d before and 1 d，7 d，14 d and 21 d after treatment.Luxol fast blue staining，immunohistological staining and Western blotting were used to detect the changes of MAG.RESULTS:Compared with PBS group，the changes of Rotarod motor test scores indicated that the ICH rats receiving siRNA had significant functional recoveries.As indicated by Luxol fast blue staining，the area of demyelination in percentage was obviously reduced in siRNA treatment group as compared with PBS group after ICH(P＜0.05).The expression of MAG detected by immunohistological staining and Western blotting was significantly lower in siRNA-treated brain than that in PBS group(P＜0.05).CONCLUSION:siRNA targeting MAG contributes to the remarkable functional recovery after ICH.The treatment promotes nerve fiber remyelination by down-regulation of the MAG expression after ICH in rats.

Myelin-associated glycoprotein;RNA inference;Remyelination;Intracerebral hemorrhage;Rats

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.02.014

1000-4718(2014)02-0274-04

2013-09-23

2013-12-04

廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.S2011010002638);廣東省科技社會(huì)發(fā)展項(xiàng)目(No.2012B031800356)

△通訊作者Tel:020-81332016;E-mail:drliuam@aliyun.com