沉默NANOG表達(dá)對人肝癌細(xì)胞HepG2中cyclin D1表達(dá)及細(xì)胞增殖的影響*

周嘉嘉，陳汝福，鄧小耿，周雨，周泉波，張杰，伍耀豪，曾樂祥，邱榮林

(中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院外科，廣東廣州 510120)

沉默NANOG表達(dá)對人肝癌細(xì)胞HepG2中cyclin D1表達(dá)及細(xì)胞增殖的影響*

周嘉嘉，陳汝福△，鄧小耿，周雨，周泉波，張杰，伍耀豪，曾樂祥，邱榮林

(中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院外科，廣東廣州 510120)

目的:探討RNA干擾沉默NANOG表達(dá)后對肝癌細(xì)胞HepG2中細(xì)胞周期素D1(cyclin D1)表達(dá)及細(xì)胞增殖的影響。方法：將以NANOG基因?yàn)榘悬c(diǎn)的NANOG-siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞HepG2，real-time PCR和Western boltting檢測NANOG、cyclin D1 mRNA和蛋白的表達(dá)，CCK-8和平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖能力，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期情況。結(jié)果:與mock組比較，轉(zhuǎn)染NANOG-siRNA后，肝癌細(xì)胞HepG2中NANOG、cyclin D1 mRNA和蛋白水平均下調(diào)(P＜0.05)，細(xì)胞增殖能力下降(P＜0.05)，進(jìn)入G0/G1期的細(xì)胞比例增多(P＜0.05)。結(jié)論:沉默NANOG表達(dá)可引起肝癌細(xì)胞HepG2中cyclin D1的表達(dá)下降，導(dǎo)致細(xì)胞增殖能力下降。

肝腫瘤;NANOG蛋白;細(xì)胞增殖;細(xì)胞周期蛋白D1

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是臨床上最常見的惡性腫瘤之一，據(jù)統(tǒng)計(jì)全世界每年新發(fā)肝癌患者約60萬，居惡性腫瘤的第5位。目前我國發(fā)病人數(shù)約占全球的半數(shù)以上，占全球肝癌病人的55%，嚴(yán)重威脅國人的健康和生命。NANOG是近年來發(fā)現(xiàn)的一個(gè)維持胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ESCs)自我更新和多向分化潛能的重要轉(zhuǎn)錄因子，是干細(xì)胞具有發(fā)育成各種類型細(xì)胞能力的“總開關(guān)”，被認(rèn)為是全能性或多能性干細(xì)胞的標(biāo)志物［1-3］。研究發(fā)現(xiàn)NANOG在乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌等異常表達(dá)，提示NANOG也可能是某些腫瘤的標(biāo)志之一［4-5］。細(xì)胞周期素D1(cyclin D1)作為重要的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子之一，其過度表達(dá)是多種人類原發(fā)性腫瘤的特征，對腫瘤的診斷和預(yù)后判斷具有重要意義［6］。Cyclin D1蛋白表達(dá)增加主要見于一些原發(fā)性惡性腫瘤，例如乳腺癌、肝細(xì)胞癌［6-7］。本研究通過RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)沉默肝癌細(xì)胞HepG2中NANOG的表達(dá)，探討其對肝癌細(xì)胞cyclin D1表達(dá)以及肝癌細(xì)胞增殖活性的影響。

材料和方法

1 材料

人肝癌細(xì)胞株HepG2由本實(shí)驗(yàn)室保存，RPMI-1640培養(yǎng)基及胰蛋白酶購自Gibco;脂質(zhì)體2000(LipofectamineTM2000)購自Invitrogen;NANOG和cyclin D1兔抗人單克隆抗體購自CST;總RNA提取試劑Trizol購自Invitrogen;real-time PCR試劑盒購自TaKaRa;CCK-8試劑購自日本同仁化學(xué)研究所。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2和相對濕度95%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，1～2 d換液。取對數(shù)生長期HepG2細(xì)胞，接種于6孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后待細(xì)胞融合達(dá)85%左右時(shí)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前2 h更換不含血清的新鮮培養(yǎng)基。設(shè)計(jì)siRNA干擾序列靶點(diǎn):GFP 5’-ACT ACC TGT TCC ATG GCC A-3’;NANOG 5’-CCA GAC CTG GAA CAA TTC A-3’;由廣州銳博生物公司合成。實(shí)驗(yàn)分組:以無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)+脂質(zhì)體2000處理組(以下簡稱mock組);脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染GFP-siRNA組(以下簡稱siGFP組);脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染NANOG-siRNA組(以下簡稱siNANOG組)。按脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，24～48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。如接種在96孔板中，按說明書相應(yīng)地調(diào)整細(xì)胞數(shù)及轉(zhuǎn)染試劑量。

2.2 Real-time PCR檢測NANOG mRNA表達(dá)細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，Trizol法提取各組細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測RNA濃度及純度。按real-time PCR試劑盒操作說明書合成cDNA。NANOG(109 bp)上游引物5’-CAG AAG GCC TCA GCA CCT AC-3’，下游引物5’-TGG CAC CCA GCA CAA TGA A-3’;βactin(186 bp)上游引物5’-ATT GTT CCA GGT CTG GTT GC-3’，下游引物5’-CTA AGT CAT AGT CCG CCT AGA AGC A-3’。PCR反應(yīng)條件:95℃20 s，95 ℃10 s，60℃30 s，70℃10 s，35個(gè)循環(huán)。所有標(biāo)本均重復(fù)檢測3次，計(jì)算出Ct值，采用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算分析。

2.3 Western blotting測定NANOG和cyclin D1蛋白的表達(dá)細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，按說明書提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。配制10%SDS-PAGE凝膠，各上樣孔加入25 μg蛋白樣品，電泳后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜(PVDF)膜上。PVDF膜以50 g/L脫脂奶粉封閉2 h。分別加入NANOG和cyclin D1兔抗人單克?、窨?1∶1 000)于4℃孵育過夜。經(jīng)TBST漂洗3次后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔Ⅱ抗(1∶5 000)，室溫孵育1 h，TBST漂洗3次，ECL化學(xué)發(fā)光法試劑盒顯影、曝光。經(jīng)Bio-Rad公司圖形分析軟件Quantity One對圖片進(jìn)行分析并測定灰度值。

2.4 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖情況取對數(shù)生長期HepG2細(xì)胞，接種于96孔板，培養(yǎng)24 h，轉(zhuǎn)染siRNA。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后12 h、24 h、36 h、48 h、60 h和72 h，更換為不含血清的新鮮培養(yǎng)基，并加入10 μL CCK-8試劑。置于37℃孵育2 h，用酶標(biāo)儀測定450 nm的吸光度，每個(gè)時(shí)點(diǎn)每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。

2.5 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，將細(xì)胞用胰酶消化后吹散成單細(xì)胞懸液，取500個(gè)細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)孔。于37℃、5% CO2和相對濕度95%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d。用多聚甲醛固定，1%結(jié)晶紫染色。顯微鏡下計(jì)算克隆形成數(shù)(含有10個(gè)細(xì)胞以上的集落為1個(gè)克隆)，克隆形成率(%)=克隆形成數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。

2.6 流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞周期細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞，用PBS制備成單細(xì)胞懸液，用75%乙醇4℃固定過夜，固定后細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌2次。避光條件下加入PI染液，室溫孵育30 min，上流式細(xì)胞儀分析樣品，測定細(xì)胞周期。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 RNAi對NANOG表達(dá)的影響

Real-time PCR檢測顯示，siNANOG組NANOG mRNA表達(dá)水平均較mock組明顯下降，比值為0.340±0.055，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05); siGFP組與mock組相比NANOG mRNA表達(dá)水平無明顯差異，比值為0.980±0.038(P＞0.05)，見圖1。Western blotting結(jié)果顯示，siNANOG組NANOG蛋白表達(dá)水平較mock組明顯下降，灰度比值為0.430±0.077，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);siGFP組與mock組的NANOG蛋白表達(dá)水平則無明顯差異，灰度比值為0.960±0.047(P＞0.05)，見圖2。

Figure 1.NANOG mRNA expression in HepG2 cells.Mean± SD.n=3.*P＜0.05 vs mock.圖1 HepG2細(xì)胞中NANOG mRNA的表達(dá)

Figure 2.NANOG protein expression in HepG2 cells.Mean± SD.n=3.*P＜0.05 vs mock.圖2 HepG2細(xì)胞中NANOG蛋白的表達(dá)

2 NANOG對細(xì)胞生長曲線的影響

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，siNANOG組細(xì)胞在48～72 h吸光度值顯著低于mock組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);siGFP組與mock組相比無顯著差異(P＞0.05)，見圖3。

3 NANOG對細(xì)胞克隆形成的影響

各組克隆形成率:siNANOG組為(7.4±3.8)%，siGFP組為(16.8±2.5)%，mock組為(17.3± 2.2)%。siNANOG組細(xì)胞克隆形成率低于mock組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);siGFP組與mock組細(xì)胞克隆形成率無明顯差異(P＞0.05)，見圖4。

Figure 3.Proliferation curves of HepG2 cells.Mean±SD.n= 5.*P＜0.05 vs mock.圖3 HepG2細(xì)胞增殖曲線

Figure 4.Flat plate colony formation assay of HepG2 cells.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs mock.圖4 HepG2細(xì)胞的克隆形成率

4 NANOG對細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與mock組細(xì)胞G0/G1期(57.8±5.05)%相比，siNANOG組細(xì)胞G0/G1期百分比升高，為(74.6±8.21)%，S+G2/M期細(xì)胞數(shù)相應(yīng)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。siGFP組與mock組細(xì)胞G0/G1期百分比無明顯差異(P＞0.05)，見圖5。

5 NANOG對cyclin D1蛋白表達(dá)的影響

Real-time PCR檢測顯示，采用siRNA抑制NANOG表達(dá)后siNANOG組細(xì)胞cyclin D1 mRNA表達(dá)水平均較mock組明顯下降，比值為0.390± 0.067，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);siGFP組與mock組相比，cyclin D1 mRNA表達(dá)水平則無明顯差異，比值為0.950±0.054(P＞0.05)，見圖6。Western blotting結(jié)果顯示，siNANOG組的cyclin D1蛋白表達(dá)水平較mock組明顯下降，灰度比值為0.400±0.075，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);siGFP組與mock組的cyclin D1蛋白表達(dá)水平則無明顯差異，灰度比值為0.920±0.063(P＞0.05)，見圖7。這表明RNAi沉默NANOG表達(dá)后降低HepG2細(xì)胞中cyclin D1 mRNA和蛋白的表達(dá)。

Figure 5.Cell cycle assay of HepG2 cells.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs mock.圖5 HepG2細(xì)胞的細(xì)胞周期情況

Figure 6.Cyclin D1 mRNA expression in HepG2 cells.Mean± SD.n=3.*P＜0.05 vs mock.圖6 HepG2細(xì)胞中cyclin D1 mRNA的表達(dá)

Figure 7.Cyclin D1 protein expression in HepG2 cells.Mean ±SD.n=3.*P＜0.05 vs mock.圖7 HepG2細(xì)胞中cyclin D1蛋白的表達(dá)

討論

2003年Chambers和Mitsui幾乎同時(shí)報(bào)道了一種在囊胚內(nèi)細(xì)胞群、原始生殖細(xì)胞及胚胎干細(xì)胞系表達(dá)的新轉(zhuǎn)錄因子，命名為NANOG，意即“生命綠洲”和“永不枯竭”［1-2］。在ESCs中，NANOG可特異性結(jié)合下游靶基因啟動(dòng)子區(qū)域ATTA結(jié)合元件，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用，維持ESCs自我更新和多向分化潛能［3，8］。最初以為NANOG只在胚胎干細(xì)胞、胚胎生殖細(xì)胞以及胚胎癌細(xì)胞等多能性細(xì)胞中表達(dá)，在正常成體組織中不表達(dá)。近年研究發(fā)現(xiàn)NANOG在精原細(xì)胞瘤、乳腺癌、前列腺癌和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤等異常表達(dá)［4-5，9-10］。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，將NANOG基因轉(zhuǎn)入造血干細(xì)胞后，引起了γδT細(xì)胞惡性腫瘤的發(fā)生，研究者認(rèn)為NANOG是一種癌基因，可導(dǎo)致惡性轉(zhuǎn)化［11］。外源表達(dá)NANOG能促進(jìn)NIH3T3細(xì)胞增殖，使細(xì)胞生長速度加快［12］。研究還發(fā)現(xiàn)，NANOG還與腫瘤進(jìn)展有關(guān):下調(diào)NANOG表達(dá)可阻止腫瘤惡性進(jìn)展，在某些情況下，改變了細(xì)胞分化［4］。本研究結(jié)果顯示，以未處理的mock組作為對照，肝癌細(xì)胞HepG2在轉(zhuǎn)染NANOG-siRNA后，NANOG mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著下降;細(xì)胞生長曲線及克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示，下調(diào)NANOG表達(dá)后HepG2細(xì)胞增殖能力減弱，增殖速度下降，而轉(zhuǎn)染GFP-siRNA 的HepG2細(xì)胞和mock組之間沒有明顯差異，表明下調(diào)NANOG表達(dá)可抑制肝癌細(xì)胞HepG2的細(xì)胞增殖。

細(xì)胞周期是細(xì)胞生命活動(dòng)的基本過程，主要分為4個(gè)時(shí)期G1期、S期、G2和M期，遵循G1-S-G2-M演變規(guī)律，其中G1/S和G2/M為2個(gè)重要的檢查點(diǎn)，而前者尤為重要。細(xì)胞一旦從G1跨入S則不再依靠外來信息刺激而自動(dòng)完成分裂過程［13］。在G1/S期，cyclin D1是G1期進(jìn)展的限速控制因素，在調(diào)控細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期進(jìn)程中有重要意義［6］。軟件分析發(fā)現(xiàn)cyclin D1基因啟動(dòng)子區(qū)域存在2個(gè)以上ATTA結(jié)合元件，這為NANOG直接調(diào)控cyclin D1基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)提供了可能。本研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染NANOG-siRNA后，cyclin D1 mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著下降，轉(zhuǎn)染GFP-siRNA的細(xì)胞和mock組之間則沒有明顯差異，表明下調(diào)NANOG表達(dá)可以降低肝癌細(xì)胞HepG2中cyclin D1蛋白的表達(dá)水平，NANOG可能是通過特異性結(jié)合cyclin D1基因啟動(dòng)子區(qū)域ATTA結(jié)合元件而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性的。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染NANOG-siRNA后，進(jìn)入G0/G1期的細(xì)胞較mock組明顯增多，轉(zhuǎn)染GFP-siRNA的細(xì)胞與mock組之間則沒有明顯差異，表明下調(diào)NANOG表達(dá)可以調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的進(jìn)程，而下調(diào)NANOG表達(dá)對細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響主要是通過阻滯細(xì)胞周期于G0/G1期實(shí)現(xiàn)的，這一功能的實(shí)現(xiàn)可能與下調(diào)NOANG表達(dá)后對cyclin D1的抑制作用有關(guān)。

綜上所述，通過RNAi技術(shù)沉默NANOG表達(dá)，可引起人肝癌細(xì)胞HepG2中cyclin D1表達(dá)的下降，細(xì)胞增殖能力的減弱以及細(xì)胞周期的改變。NANOG可能是通過作用于cyclin D1基因啟動(dòng)子區(qū)域的ATTA結(jié)合元件而調(diào)節(jié)cyclin D1的轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而下降cyclin D1的表達(dá)水平。Cyclin D1可能參與了NANOG對細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的調(diào)控作用。

［1］Chambers I，Colby D，Robertson M，et al.Functional expression cloning of Nanog，a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells［J］.Cell，2003，113 (5):643-655.

［2］Mitsui K，Tokuzawa Y，Itoh H，et al.The homeoprotein Nanog is required for maintenance of pluripotency in mouse epiblast and ES cells［J］.Cell，2003，113(5): 631-642.

［3］Silva J，Nichols J，Theunissen TW，et al.Nanog is the gateway to the pluripotent ground state［J］.Cell，2009，138(4):722-737.

［4］Jeter CR，Badeaux M，Choy G，et al.Functional evidence that the self-renewal gene NANOG regulates human tumor development［J］.Stem Cells，2009，27(5):993-1005.

［5］Gu G，Yuan J，Wills M，et al.Prostate cancer cells with stem cell characteristics reconstitute the original human tumor in vivo［J］.Cancer Res，2007，67(10):4807-4815.

［6］Musgrove EA，Caldon CE，Barraclough J，et al.Cyclin D as a therapeutic target in cancer［J］.Nat Rev Cancer，2011，11(8):558-572.

［7］劉娟，殷飛，姚樹坤，等.細(xì)胞周期素D1、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤樣蛋白2及微小染色體維持蛋白7在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及對預(yù)后的意義［J］.中國病理生理雜志，2011，27(2):304-309.

［8］Boyer LA，Lee TI，Cole MF，et al.Core transcriptional regulatory circuitry in human embryonic stem cells［J］.Cell，2005，122(6):947-956.

［9］Ezeh UI，Turek PJ，Reijo RA，et al.Human embryonic stem cell genes OCT4，NANOG，STELLAR，and GDF3 are expressed in both seminoma and breast carcinoma ［J］.Cancer，2005，104(10):2255-2265.

［10］Seigel GM，Hackam AS，Ganguly A，et al.Human embryonic and neuronal stem cell markers in retinoblastoma ［J］.Mol Vis，2007，13:823-832.

［11］Tanaka Y，Era T，Nishikawa S，et al.Forced expression of Nanog in hematopoietic stem cells results in a γδT-cell disorder［J］.Blood，2007，110(1):107-115.

［12］Zhang J，Wang X，Chen B，et al.Expression of Nanog gene promotes NIH3T3 cell proliferation［J］.Biochem Biophys Res Commun，2005，338(2):1098-1102.

［13］Fry AM，O＇Regan L，Sabir SR，et al.Cell cycle regulation by the NEK family of protein kinases［J］.J Cell Sci，2012，125(Pt 19):4423-4433.

Effect of NANOG silencing on cyclin D1 expression and proliferation in human hepatoma HepG2 cells

ZHOU Jia-jia，CHEN Ru-fu，DENG Xiao-geng，ZHOU Yu，ZHOU Quan-bo，ZHANG Jie，WU Yao-hao，ZENG Le-xiang，QIU Rong-lin
(Department of Surgery，Sun Yat-sen Memorial Hospital，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510120，China.E-mail: chenrf63@163.com)

AIM:To investigate the effect of NANOG silencing on cyclin D1 expression and proliferation in human hepatoma HepG2 cells.METHODS:Transient transfection of NANOG targeting siRNA into HepG2 cells was performed.The expression of NANOG and cyclin D1 at mRNA and protein levels was detected by real-time PCR and Western blotting.Cell proliferation was examined by CCK-8 assay and colony formation assay，and cell cycle was tested by flow cytometry.RESULTS:After transfection with NANOG-targeting siRNA，the inhibition of NANOG expression was observed.Compared with mock group，the mRNA and protein expression levels of NANOG and cyclin D1 were decreased(P＜0.05).In addition，knockdown of NANOG expression inhibited the cell proliferation and increased the proportion of G0/ G1-phase cells(P＜0.05).CONCLUSION:Silencing of NANOG expression in HepG2 cells causes down-regulation of cyclin D1 expression and decreases the cell proliferation ability.

Liver neoplasms;NANOG protein;Cell proliferation;Cyclin D1

R735.7

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.02.009

1000-4718(2014)02-0245-05

2013-09-15

2013-12-02

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.30872485;No.81000889)

△通訊作者Tel:020-81332020;E-mail:chenrf63@163.com