硫化氫對缺氧誘導(dǎo)的大鼠皮層神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用*

魏楚蓉，劉路寬，田立兵，余艷貞，曾九江，白帥，毛慕華，文秀華，羅友根

(井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)退行性疾病與衰老研究中心，江西吉安 343000)

硫化氫對缺氧誘導(dǎo)的大鼠皮層神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用*

魏楚蓉，劉路寬，田立兵，余艷貞，曾九江，白帥，毛慕華，文秀華，羅友根△

(井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)退行性疾病與衰老研究中心，江西吉安 343000)

目的:探討硫化氫(H2S)對缺氧誘導(dǎo)的皮層神經(jīng)元損傷的影響及作用機(jī)制。方法：將SD大鼠皮層神經(jīng)元在2%O2、5%CO2、93%N2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，建立細(xì)胞缺氧模型。以硫氫化鈉(NaHS)作為H2S的供體，應(yīng)用CCK-8分析細(xì)胞活性;采用熒光探針DCFH-DA檢測神經(jīng)元活性氧(ROS)含量;用Rh123染色測定線粒體膜電位(MMP);采用乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒分析神經(jīng)元LDH釋放率，反映神經(jīng)元的損傷情況。結(jié)果:(1)缺氧引起神經(jīng)元ROS含量和LDH釋放率升高，NaHS預(yù)處理可抑制缺氧所致神經(jīng)元ROS含量和LDH釋放率的升高; (2)缺氧降低神經(jīng)元MMP和細(xì)胞活性，NaHS和活性氧清除劑NAC預(yù)處理均顯著抑制缺氧所致神經(jīng)元MMP和細(xì)胞活性的降低。結(jié)論:缺氧增加神經(jīng)元ROS含量，降低神經(jīng)元MMP和細(xì)胞活性，而H2S通過其抗氧化作用，減輕缺氧所致神經(jīng)元的損傷。

缺氧;神經(jīng)元損傷;硫化氫;活性氧類

神經(jīng)元凋亡是缺氧性疾病的主要病理改變之一，已成為影響神經(jīng)系統(tǒng)疾病死亡率和致殘率的主要因素。研究表明自由基活動是缺氧誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷的一個重要機(jī)制［1-2］。低氧暴露，氧分壓迅速降低，引起細(xì)胞內(nèi)活性氧快速增多，脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［3］。

內(nèi)源性硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)主要由半胱氨酸和同型半胱氨酸在胱硫醚γ-裂解酶(cystathionine γ-lyase，CSE)和胱硫醚β-合成酶(cystathionine β-synthase，CBS)作用下產(chǎn)生，在哺乳動物心血管、呼吸和神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用。近年來，研究發(fā)現(xiàn)H2S通過舒張血管［4］、調(diào)節(jié)神經(jīng)突觸傳遞及抗氧化作用［5-6］等多種途徑，減少細(xì)胞損傷。而H2S在抑制缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)中的作用機(jī)制還不夠明確。硫氫化鈉(sodium hydrosulfide，NaHS)在體內(nèi)分解為Na+及HS-，后者與H+結(jié)合生成H2S，H2S和NaHS在體內(nèi)形成動態(tài)平衡;因此，NaHS常被用來作為H2S的供體［7-8］。本研究采用原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元，建立細(xì)胞缺氧模型;檢測細(xì)胞活性、活性氧(reactive oxygen species，ROS)、線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)水平及乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)釋放率，探討H2S對缺氧誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用。

材料和方法

1 材料

NaHS、2＇，7＇-二氫二氯熒光素二乙酸酯(2＇，7＇-dichlorodihydrofluorescin diacetate，DCFH-DA)、L-多聚賴氨酸和xestospongin C(Xesto C)購自Sigma;Fura-2/AM、0.25%胰酶、Neurobasal和B27購自Invitrogen;阿糖胞苷購自Roche;胎牛血清和馬血清購自HyClone;LDH試劑盒購自南京建成生物工程研究所;CCK-8、Rh123和N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine，NAC)購自碧云天生物技術(shù)研究所;激光共聚焦皿購自無錫耐思生物科技有限公司;SD大鼠購自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)SD大鼠懷孕至17～19 d頸椎脫臼處死，75%乙醇浸泡1～2 min，取出胎鼠，游離出全腦，分離皮層，剪碎后用0.25%的胰蛋白酶37℃消化10 min，加含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化。1 000×g離心8 min，棄上清，細(xì)胞用種板液(含10%胎牛血清、10%馬血清、25 μmol/L L-谷氨酸和2 mmol/L L-谷氨酰胺的DMEM培養(yǎng)基)稀釋成1×109/L的密度，接種于經(jīng)0.04 g/L L-多聚賴氨酸包被的共聚焦皿。在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后吸出培養(yǎng)液，換用Neurobasal+B27培養(yǎng)基，培養(yǎng)2 d后加入5 μmol/L阿糖胞苷以抑制膠質(zhì)細(xì)胞的生長，每2 d進(jìn)行半量換液1次。細(xì)胞培養(yǎng)7 d后用于下列實(shí)驗(yàn)。

皮層神經(jīng)元于2%O2、5%CO2、93%N2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)復(fù)制缺氧模型。細(xì)胞缺氧前分別用50、100、200、300或600 μmol/L NaHS預(yù)處理30 min 和1 mmol/L NAC預(yù)處理60 min。

2.2 細(xì)胞活性檢測將神經(jīng)元以1×104/well接種于96孔板，培養(yǎng)7 d后進(jìn)行細(xì)胞活性檢測。各組細(xì)胞分別與CCK-8(每孔100 μL體積加10 μL CCK-8)孵育1.5 h，隨后采用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測定各孔的吸光度(A)值。加相應(yīng)量培養(yǎng)基和CCK-8溶液但沒有細(xì)胞的孔作為空白對照。按公式:細(xì)胞活性(%)=(實(shí)驗(yàn)組A值-空白A值)/(對照組A值-空白A值)×100%，求出各組細(xì)胞活性。

2.3 神經(jīng)元ROS測定DCFH-DA本身沒有熒光，穿過膜進(jìn)入細(xì)胞后，在胞內(nèi)酶的作用下轉(zhuǎn)變成DCFH?；钚匝醮嬖跁r，DCFH被氧化生成綠色熒光物質(zhì)DCF，綠色熒光強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)活性氧水平呈正相關(guān)。因此，通過檢測細(xì)胞DCF的熒光強(qiáng)度反映細(xì)胞內(nèi)ROS含量。

神經(jīng)元處理后，用含5 μmol/L DCFH-DA的Neurobasal+B27培養(yǎng)基于37℃避光孵育50 min，細(xì)胞用EBSS(6 800 NaCl，400 KCl，264 CaCl2·2H2O，200 MgCl2·7H2O，2 200 NaHCO3，140 NaH2PO4· H2O，及1 000葡萄糖，單位:mg/L;pH 7.2)清洗3次。DCF熒光值采用TCS SP5激光共聚焦系統(tǒng)(Leica)進(jìn)行檢測，隨機(jī)選取3個視野進(jìn)行成像，重復(fù)3次，DCF平均熒光強(qiáng)度采用LAS AF 5.2.1.6757軟件進(jìn)行分析。

2.4 神經(jīng)元MMP測定Rh123是一種為線粒體所吸收的熒光染料，其吸收值隨MMP的改變而呈現(xiàn)相應(yīng)的變化，從而改變細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。因此，可通過檢測細(xì)胞Rh123的熒光強(qiáng)度反映細(xì)胞的MMP。神經(jīng)元處理后，加入5 mg/L Rh123，避光于37℃孵育45 min，用激光共聚焦顯微鏡(激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm)隨機(jī)選取3個視野拍照，重復(fù)3次，以平均熒光強(qiáng)度表示MMP。

2.5 神經(jīng)元LDH活性測定實(shí)驗(yàn)方法參照試劑說明書。簡而言之，收集培養(yǎng)液0.1 mL，加人1 mL含70%乳酸鈉基質(zhì)液和0.2 mg的輔酶I充分反應(yīng)，在堿性條件下用2，4-二硝基苯肼顯色，在440 nm讀取吸光度。用同樣的方法測定相應(yīng)細(xì)胞裂解液中總的LDH，用培養(yǎng)液中LDH活性與相應(yīng)細(xì)胞LDH總活性的比值來表示LDH釋放率。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 硫化氫抑制缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)元活性的下降

缺氧處理24 h，神經(jīng)元活性降至對照組的(52.5±3.3)%(P＜0.01)，而NaHS(100、200、300和600 μmol/L)孵育神經(jīng)元30 min后再行缺氧處理，細(xì)胞活性分別升至對照組的(63.5±4.0)%、(66.5± 7.4)%、(71.8±9.7)%和(73.6±8.4)%，見圖1A。用不同濃度NaHS單獨(dú)處理神經(jīng)元，與對照組相比，細(xì)胞活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見圖1B。上述數(shù)據(jù)表明，硫化氫抑制缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)元活性的降低。

Figure 1.Inhibitory effect of H2S on the hypoxia-induced decrease in the viability of neurons.CCK-8 was employed to analysis the viability after cortical neurons were treated.A:the effect of H2S on the hypoxia-induced decrease in the viability of neurons; B:the effect of H2S on the viability of neurons.Mean±SD.n=4.＊＊P＜0.01 vs control;△P＜0.05，△△P＜0.01 vs 0 μmol/L NaHS+hypoxia.圖1 H2S對缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)元活性下降的抑制作用

2 硫化氫對缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)元ROS含量變化的影響

如圖2，缺氧24 h神經(jīng)元DCF熒光值升高至48.1±12.5，為對照組(11.1±2.7)的4.4倍(P＜0.01)，而100 μmol/L和300 μmol/L NaHS預(yù)處理30 min后再缺氧處理，DCF熒光值分別降低至30.4±7.7和21.6±5.8，與缺氧組相比明顯降低(P＜0.01)，但仍高于對照組(P＜0.01)。單獨(dú)使用100 μmol/L和300 μmol/L NaHS處理神經(jīng)元，DCF熒光值分別是10.6±2.5和10.6±2.4，與對照組相比無顯著差異(P＞0.05)。上述結(jié)果表明H2S顯著減少缺氧所致的神經(jīng)元ROS含量的升高。

Figure 2.Effect of H2S on the hypoxia-induced variation of ROS content in neurons.The neurons were incubated with 5 μmol/L DCFH-DA for 50 min and then they were washed with EBSS.The fluorescent images were taken with a laser scanning confocal microscope and DCF fluorescent value was analyzed by LAS AF 5.2.1.6757 software.Mean±SD.n=3.＊＊P＜0.01 vs control(without treatment);△P＜0.05;△△P＜0.01 vs hypoxia alone.圖2 H2S對缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)元ROS含量變化的影響

3 硫化氫對缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)元MMP變化的影響

MMP降低是細(xì)胞凋亡早期的重要特征之一。實(shí)驗(yàn)采用1 mmol/L NAC清除缺氧產(chǎn)生的ROS。如圖3所示，缺氧組Rh123熒光值(10.6±2.1)顯著低于對照組(22.1±3.4;P＜0.01)。但用300 μmol/L NaHS或1 mmol/L NAC預(yù)處理后再行缺氧，Rh123熒光值分別回升到15.1±2.2和15.7±2.7，比缺氧組分別升高了(42.7±37.6)%和(49.0±35.6)%，但仍低于對照組(P＜0.01)。單獨(dú)用300 μmol/L NaHS或1 mmol/L NAC處理神經(jīng)元，Rh123熒光值分別為22.9±3.9和23.0±4.7，與對照組相比無顯著差異(P＞0.05)。結(jié)合前面的結(jié)果提示，H2S通過清除活性氧從而抑制缺氧誘導(dǎo)的皮層神經(jīng)元MMP的降低。

Figure 3.Effect of H2S on the hypoxia-induced change of MMP in neurons.The neurons were incubated with 5 mg/L Rh123 for 45 min at 37℃in the dark，and then three randomly selected fields were taken with a laser scanning confocal microscope.The fluorescence intensity was analyzed with LAS AF 5.2.1.6757 software.Mean±SD.n=3.＊＊P＜0.01 vs control(without treatment);△△P＜0.01 vs hypoxia.圖3 H2S對缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)元MMP變化的影響

4 硫化氫對缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)元LDH釋放的影響

以缺氧組LDH釋放率作為100%，將其它各組LDH釋放率與之相比。如圖4所示，缺氧組LDH釋放率顯著高于對照組(P＜0.01)，而300 μmol/L NaHS或1 mmol/L NAC預(yù)處理后再缺氧，LDH釋放率分別降低至缺氧組的(66.1±8.0)%和(60.5± 10.6)%(P＜0.01)。單純使用NaHS或NAC處理神經(jīng)元，LDH釋放率與對照組相比無顯著差異(P＞0.05)。上述結(jié)果表明，H2S通過清除活性氧減少缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)元LDH的釋放。

討論

Figure 4.Effect of H2S on the hypoxia-induced LDH release in neurons.The commercial kit of LDH was used to analyze cell injury induced by hypoxia after neurons was treated.The LDH release rate was determined by LDH activity ratio between cell culture supernatant and cell lysate.Mean±SD.n=4.＊＊P＜0.01 vs control(without treatment);△△P＜0.01 vs hypoxia alone.圖4 H2S對缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)元LDH釋放的影響

ROS介導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激在細(xì)胞損傷早期階段起著重要作用［9-10］。組織在缺氧環(huán)境下，能量代謝紊亂導(dǎo)致ROS產(chǎn)生增多;另一方面缺氧時抗氧化酶如過氧化物歧化酶、過氧化氫酶等的活性降低，ROS清除減少，隨后對細(xì)胞造成氧化應(yīng)激損傷［11］。ROS促進(jìn)DNA、RNA、脂質(zhì)及蛋白質(zhì)的氧化損傷，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞、功能障礙，甚至凋亡［12-13］。本研究發(fā)現(xiàn)H2S抑制缺氧時皮層神經(jīng)元的ROS增多，發(fā)揮抗氧化能力，提高神經(jīng)元的活性。

線粒體是細(xì)胞內(nèi)氧化磷酸化和ATP生成的主要場所，能量代謝的過程中伴隨著ROS的產(chǎn)生［14］。因此，線粒體是細(xì)胞內(nèi)ROS的主要來源地。同時線粒體又是氧化應(yīng)激的主要靶點(diǎn)，對氧化應(yīng)激損傷非常敏感［14-15］。過多ROS使線粒體膜通透性升高，細(xì)胞色素C釋放，引起線粒體膜結(jié)構(gòu)和功能受損。線粒體內(nèi)膜損傷直接導(dǎo)致膜通透小孔開放，MMP降低，多種凋亡因子釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，這些是細(xì)胞凋亡啟動的關(guān)鍵因素［16］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，H2S通過清除ROS阻止缺氧誘導(dǎo)的MMP下降，神經(jīng)元活性顯著升高。

LDH釋放率被作為細(xì)胞膜是否完整的重要標(biāo)準(zhǔn)［17］。缺氧誘導(dǎo)ROS增多，引起細(xì)胞膜損傷，細(xì)胞內(nèi)的酶類(如LDH)釋放到細(xì)胞外。因此，細(xì)胞培養(yǎng)基中LDH活性高低可以反映細(xì)胞損傷嚴(yán)重程度［18］。我們的實(shí)驗(yàn)表明，缺氧誘導(dǎo)LDH釋放率升高，而H2S減少缺氧所致的LDH釋放，提高神經(jīng)元活性。ROS清除劑NAC有相似的效果。

綜上所述，H2S的神經(jīng)保護(hù)作用可能以線粒體為靶點(diǎn)，通過抑制缺氧誘導(dǎo)的ROS增多，維持MMP的穩(wěn)定和減少LDH釋放率，減輕缺氧誘導(dǎo)神經(jīng)元的損傷。然而缺氧誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷是一個多因素參與的復(fù)雜過程，需要更進(jìn)一步地探討氣體信號分子H2S的潛在作用，以期為臨床治療相關(guān)疾病提供確切的理論指導(dǎo)。

［1］Abramov AY，Scorziello A，Duchen MR.Three distinct mechanisms generate oxygen free radicals in neurons and contribute to cell death during anoxia and reoxygenation ［J］.J Neurosci，2007，27(5):1129-1138.

［2］R?hnert P，Schr?der UH，Ziabreva I，et al.Insufficient endogenous redox buffer capacity may underlie neuronal vulnerability to cerebral ischemia and reperfusion［J］.J Neurosci Res，2012，90(1):193-202.

［3］Xu W，Chi L，Row BW，et al.Increased oxidative stress is associated with chronic intermittent hypoxia-mediated brain cortical neuronal cell apoptosis in a mouse model of sleep apnea［J］.Neuroscience，2004，126(2):313-323.

［4］Zhao W，Zhang J，Lu Y，et al.The vasorelaxant effect of H2S as a novel endogenous gaseous KATPchannel opener ［J］.EMBO J，2001，20(21):6008-6016.

［5］Tang XQ，Shen XT，Huang YE，et al.Hydrogen sulfide antagonizes homocysteine-induced neurotoxicity in PC12 cells［J］.Neurosci Res，2010，68(3):241-249.

［6］Luo Y，Yang X，Zhao S，et al.Hydrogen sulfide prevents OGD/R-induced apoptosis via improving mitochondrial dysfunction and suppressing an ROS-mediated caspase-3 pathway in cortical neurons［J］.Neurochem Int，2013，63(8):826-831.

［7］王興民，季海鋒，王萬鐵，等.硫化氫供體硫氫化鈉對肺缺血-再灌注損傷細(xì)胞凋亡的影響［J］.中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2010，15(5):496-501.

［8］陳曉波，杜軍保，耿彬，等.硫化氫對培養(yǎng)的大鼠主動脈平滑肌細(xì)胞增殖的抑制作用［J］.中國病理生理雜志，2003，19(8):1009-1011.

［9］Stowe DF，Camara AK.Mitochondrial reactive oxygen species production in excitable cells:modulators of mitochondrial and cell function［J］.Antioxid Redox Signal，2009，11(6):1373-1414.

［10］Kulkarni AC，Kuppusamy P，Parinandi N.Oxygen，the lead actor in the pathophysiologic drama:enactment of the trinity of normoxia，hypoxia，and hyperoxia in disease and therapy［J］.Antioxid Redox Signal，2007，9(10):1717-1730.

［11］Xiao L，Lan A，Mo L，et al.Hydrogen sulfide protects PC12 cells against reactive oxygen species and extracellular signal-regulated kinase 1/2-mediated downregulation of glutamate transporter-1 expression induced by chemical hypoxia［J］.Int J Mol Med，2012，30(5):1126-1132.

［12］Cui H，Kong Y，Zhang H.Oxidative stress，mitochondrial dysfunction，and aging［J］.J Signal Transduct，2012，2012:646354.

［13］尤壽江，石際俊，張艷林，等.ROS介導(dǎo)的自噬及其在相關(guān)疾病中的作用［J］.中國病理生理雜志，2011，27(1): 187-190，195.

［14］Kudin AP，Bimpong-Buta NY，Vielhaber S，et al.Characterization of superoxide-producing sites in isolated brain mitochondria［J］.J Biol Chem，2004，279(6):4127-4135.

［15］劉朝巍，張濤，楊卓.氧化應(yīng)激損傷線粒體參與癲癇病理過程［J］.中國病理生理雜志，2008，24(1):198-200.

［16］Halestrap AP，Clarke SJ，Javadov SA.Mitochondrial permeability transition pore opening during myocardial reperfusion:a target for cardioprotection［J］.Cardiovasc Res，2004，61(3):372-385.

［17］Shih CL，Chi SI，Chiu TH，et al.Ethanol effects on nitric oxide production in cerebral pial cultures［J］.Alcohol Clin Exp Res，2001，25(4):612-618.

［18］Duan J，Yu Y，Li Y，et al.Toxic effect of silica nanoparticles on endothelial cells through DNA damage response via Chk1-dependent G2/M checkpoint［J］.PLoS One，2013，8(4):e62087.

Protective effect of hydrogen sulfide on hypoxia-induced injury of rat cortical neurons

WEI Chu-rong，LIU Lu-kuan，TIAN Li-bing，YU Yan-zhen，ZENG Jiu-jiang，BAI Shuai，MAO Mu-hua，WEN Xiu-hua，LUO You-gen
(Research Center of Neurodegenerative Diseases and Aging，Medical College of Jinggangshan University，Ji’an 343000，China.E-mail:lyougen@163.com)

AIM:To explore the role of hydrogen sulfide(H2S)in cortial neuronal injury induced by hypoxia.METHODS:The SD rat cortical neurons were cultured in hypoxic conditions(2%O2，5%CO2and 93%N2at 37°C) to establish the hypoxic model.Sodium hydrosulfide(NaHS)was used as the donor of H2S and neuronal viability was detected by CCK-8 assay.Neuronal content of reactive oxygen species(ROS)was determined by DCFH-DA method，and mitochondrial membrane potential(MMP)was detected using Rh123 staining.Lactate dehydrogenase(LDH)release rate was measured by a commercial kit to reflect the degree of neuronal injury.RESULTS:Hypoxic treatment increased ROS content and the release rate of LDH in the neurons.However，NaHS pretreatment significantly inhibited the hypoxia-induced increases in ROS content and LDH release.Hypoxia decreased MMP and cell viability.Pretreatment with NaHS and N-acetyl-L-cysteine(NAC)，a ROS scavenger，significantly inhibited the decreases in MMP and viability of the neurons.CONCLUSION:Hypoxia induces ROS generation in the neurons，thereby decreases MMP and neuronal viability.H2S significantly attenuates hypoxia-induced neuronal injury by its antioxygenation.

Hypoxia;Neuronal injury;Hydrogen sulfide;Reactive oxygen species

Q421

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.02.002

1000-4718(2014)02-0203-05

2013-11-11

2013-12-08

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.31360238);江西省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.20132BAB205020);井岡山大學(xué)2013年度國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃資助項(xiàng)目(No.2013001);吉安市科技支撐資助項(xiàng)目［No.(2012)32號10］;井岡

山大學(xué)自然科學(xué)科研項(xiàng)目(No.JZ1210)

△通訊作者Tel:0796-8117893;E-mail:lyougen@163.com