忍冬木層孔菌總酚的HPLC分離及其指示性成分分析

周 俊 孫文軍 張 玲 汪鋆植 羅友成 吳曉娟 閆喜明

（1.三峽食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，湖北 宜昌 443005；2.三峽大學(xué) 生物與制藥學(xué)院，湖北 宜昌 443002）

忍冬木層孔菌（phellinus lonicerinus（Bond.） Bond.et sing）是藥用真菌桑黃的品種之一，收載于《湖北中藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（2009年版）［1-3］，為湖北省藥用桑黃主流品種，是土家族常用藥物.桑黃是目前國(guó)際公認(rèn)的抗癌效果最好的藥用菌之一，具有“森林黃金”之美稱(chēng)，近年來(lái)，日本、韓國(guó)、中國(guó)相繼對(duì)其進(jìn)行開(kāi)發(fā)利用，應(yīng)用前景廣闊［4］.研究表明忍冬木層孔菌含有多種酚性成分，具有抗癌、抗炎等活性，在食品、藥品等領(lǐng)域內(nèi)具有很高利用價(jià)值.故本試驗(yàn)對(duì)忍冬木層孔菌總酚進(jìn)行了分析及制備，為忍冬木層孔菌的進(jìn)一步研究與利用提供了依據(jù).

1 儀器與材料

KQ－500DB型超聲波清洗儀，艾朗旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國(guó)），ME215S型十萬(wàn)分之一電子天平（德國(guó)Sartorios公司），25kg電子天平，紫外分光光度計(jì)（UV－2201，日本島津公司），高效液相色譜儀（DIONEX Ultimate 3000，美國(guó)戴安液相色譜有限公司），核磁共振儀（UltrashiedTM 400MHZ Plus，bruker布魯克公司），冷凍干燥機(jī)（FREEZ0NE PLUS 6，LABCONCO）.

忍冬木層孔菌子實(shí)體采自湖北省神龍架林區(qū)，經(jīng)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所卯曉蘭教授鑒定為phellinus lonicerinus（Bond.）Bond.et sing，標(biāo)本存放于天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（三峽大學(xué)）；95%乙醇，工業(yè)級(jí)；AB－8大孔樹(shù)脂.

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 忍冬木層孔菌總酚提取

將干燥的忍冬木層孔菌子實(shí)體粉碎，取2kg忍冬木層孔菌菌粉經(jīng)10L95%乙醇超聲輔助提取［5］，每次3h，提取3次，合并提取液，經(jīng)45℃減壓濃縮獲得忍冬木層孔菌醇提物浸膏.用少量水懸浮浸膏，上大孔吸附樹(shù)脂富集多酚，乙醇梯度洗脫（0、20%、40%、60%、70%、80%、95%）.洗脫液用三氯化鐵顯色劑定性鑒定多酚，將含有多酚的流分合并，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀45℃濃縮，干燥，稱(chēng)重，計(jì)算得率.即得忍冬木層孔菌總酚.2kg忍冬木層孔菌制得總酚約8g，提取率約為4‰.

2.2 忍冬木層孔菌總酚中指示性成分分離

2.2.1 忍冬木層孔菌總酚分析

采用分析型高效液相色譜法（HPLC）分析忍冬木層孔菌總酚，取適量總酚樣品，用甲醇溶解，0.22 μm濾膜過(guò)濾作為待測(cè)樣品.分析條件為：流動(dòng)相乙腈10%～100%，超純水90%～0%，變梯度洗脫，洗脫時(shí)間為30min，檢測(cè)器波長(zhǎng)采用254nm，色譜柱：迪馬科技鉆石二代C18色譜柱Diamonsil C18（250mm×4.6mm.id.，5μm），柱溫25℃.高效液相色譜圖如圖1所示.

圖1 忍冬木層孔菌總酚HPLC分析圖

分析表明，忍冬木層孔菌總酚含有較多的中等極性化合物，其中有幾個(gè)含量較大的成分，已達(dá)到基線(xiàn)分離，可以采用高效液相色譜進(jìn)行制備.

2.2.2 忍冬木層孔菌總酚中指示性成分制備

稱(chēng)取0.5g總酚樣品，用適量甲醇溶解，0.22μm濾膜過(guò)濾作為制備樣品.用半制備高效液相色譜進(jìn)行制備，制備液相條件為：流動(dòng)相，乙腈30%～60%，超純水70%～40%，洗脫時(shí)間35min，檢測(cè)器波長(zhǎng)采用254nm，制備柱：Agela Technologies，10×250nm，10 μm，柱溫25℃.收集主要峰洗脫液，40℃經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至少量（1～2mL）液體，移至干凈的安剖瓶，冷凍干燥，得黃色不定型粉末.

取少量經(jīng)分析高效液相色譜法檢驗(yàn)其純度.液相條件：流動(dòng)相，乙腈10%～100%，超純水90%～0%，變梯度洗脫，洗脫時(shí)間為30min，檢測(cè)器波長(zhǎng)采用254nm，色譜柱：Agela Technologies，10×250nm，10μm，柱溫25℃.其色譜圖如圖2～3所示.

圖2 化合物1HPLC分析圖

圖3 化合物2HPLC分析圖

經(jīng)峰面積歸一化法判斷，這兩個(gè)化合物的純度達(dá)到做核磁共振色譜的要求.經(jīng)核磁共振進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定.化合物1鑒定為原兒茶酸，化合物2鑒定為3，4－二羥基芐叉丙酮.核磁圖譜的數(shù)據(jù)如下：

化合物1，分子式：C7H6O4.無(wú)色針晶（甲醇），m.p.200～202℃.ESI－MS m／z：155 ［M＋H］＋.1HNMR（400MHz，methanol－d4）δH：7.44（1H，dd，J＝2.0，8.5Hz，H－6），7.41（1H，d，J＝2.0Hz，H－2），6.74（1H，d，J＝8.5Hz，H－5）.13C－NMR（100 MHz，methanol－d4）δC：170.3（COOH），151.6（C－3），146.1（C－4），123.9（C－1），123.1（C－6），117.5（C－2），115.7（C－5）.與文獻(xiàn)報(bào)道的原兒茶酸（protocatechuic acid）核磁數(shù)據(jù)相一致［6］.

化合物2，分子式：C10H10O3.淡黃色針狀結(jié)晶，溶于丙酮.1H－NMR（400MHz，CDCl3）δ：6.47（1H，d，J＝16.4Hz，8－H），7.45（1H，d，J＝16.4Hz，7－H），7.00（1H，J＝8.0，2.0Hz，6－H），6.77（1H，d，J＝8.0Hz，5－H），7.05（1H，d，J＝2.0Hz，2－H）；13CNMR（100MHz，CDCl3）δ：125.8（C－1），114.8（C－2），145.6（C－3），148.5（C－4），115.8（C－5），121.5（C－6），144.0（C－7），123.9（C－8），197.7（C＝O），27.1（CH3）.與文獻(xiàn)報(bào)道的3，4－二羥基芐叉丙酮一致［2］.

2.3 忍冬木層孔菌總酚含量測(cè)定

2.3.1 忍冬木層孔菌總酚中原兒茶酸及3，4－二羥基芐叉丙酮的含量測(cè)定

用高效液相測(cè)定忍冬木層孔菌總酚中原兒茶酸及3，4－二羥基芐叉丙酮的含量.精確稱(chēng)取原兒茶酸及3，4－二羥基芐叉丙酮，用色譜級(jí)甲醇配成1mg／mL溶液，0.22μm濾膜過(guò)濾作為標(biāo)準(zhǔn)品.精確稱(chēng)取5mg忍冬木層孔菌總酚，用色譜級(jí)甲醇配成1mg／mL，0.22μm濾膜過(guò)濾，作為待測(cè)樣品溶液.平行做3份樣.

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，分析條件：色譜柱Diamonsil C18（250mm×4.6mm.id.，5μm），柱溫25℃，流動(dòng)相乙腈17%，超純水83%，檢測(cè)原兒茶酸時(shí)波長(zhǎng)設(shè)定為256nm，檢測(cè)3，4－二羥基芐叉丙酮時(shí)波長(zhǎng)設(shè)定為328nm，分別進(jìn)樣不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液，計(jì)算各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：原兒茶酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)y＝636.74x＋34.850，r＝0.9995，3，4－二羥基芐叉丙酮 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn) y＝830.85x-693.45，r＝0.9996.標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性度較好.

進(jìn)樣10μL忍冬木層孔菌總酚待測(cè)液，重復(fù)5次，計(jì)算RSD，檢測(cè)方法的重復(fù)性，RSD＝2.19%，方法重復(fù)性良好.5份平行各進(jìn)樣10μL，計(jì)算RSD，檢測(cè)方法的重復(fù)性，RSD＝3.29%，方法重復(fù)性良好.另外取其中一平行樣，每隔0，2，4，6，8，10，24h，檢測(cè)方法的精確性，RSD＝2.91%，該方法24h內(nèi)穩(wěn)定性較好.

經(jīng)計(jì)算，忍冬木層孔菌總酚中，原兒茶酸的含量為13.1%，3，4－二羥基芐叉丙酮的含量為12.2%.

2.3.2 忍冬木層孔菌總酚含量測(cè)定

用原兒茶酸作為對(duì)照品，采用普魯士藍(lán)紫外-可見(jiàn)分光光度法檢測(cè)忍冬木層孔菌總酚中酚的含量.

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制：吸取1mg／mL的原兒茶酸溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8mL 加入10mL容量瓶中，對(duì)應(yīng)加入1.0、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.2mL甲醇，再分別加入0.008mol／L 鐵氰化鉀溶液、0.1mol／L鹽酸、0.1mol／L三氯化鐵各0.2 mL，用純水定容至刻度，搖勻靜止15min.用比色皿在紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)上先進(jìn)行紫外掃描，發(fā)現(xiàn)最大吸收波長(zhǎng)為730nm，與文獻(xiàn)報(bào)道一致.在730nm處比色，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn).

顯色穩(wěn)定性：吸取0.5mL待測(cè)液加入10mL容量瓶，同繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的方法處理，每隔20min，測(cè)一次730nm的吸光度，以檢測(cè)顯色的穩(wěn)定性.

吸取0.5mL的忍冬木層孔菌總酚待測(cè)液加入10mL容量瓶，同繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的方法測(cè)總酚在730 nm處的吸光度.平行做3份，結(jié)果如圖4所示.

圖4 原兒茶酸幾種濃度下的吸光度

由圖6可知，原兒茶酸的加樣量在0.1～0.5mg時(shí)，吸光度與加樣量有線(xiàn)性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪圖如下，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為：y＝1.015x＋0.4475，線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)r＝0.9993.

顯色穩(wěn)定性：在2h內(nèi)，總酚在730nm處的吸光度RSD為2.59%，2h后，容量瓶中藍(lán)色液體開(kāi)始出現(xiàn)絮狀物.普魯士藍(lán)是一種藍(lán)色染料，水中溶解性很差.故該方法在2h內(nèi)，顯色有效.

忍冬木層孔菌總酚的測(cè)定結(jié)果：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)y＝1.015x＋0.4475，計(jì)算出吸光度y對(duì)應(yīng)下的酚x，除以0.5mg，即得忍冬木層孔菌總酚中的酚含量.

表1 忍冬木層孔菌總酚的酚含量

測(cè)定結(jié)果顯示供試品中的忍冬木層孔菌總酚的酚含量為63.35%.

3 討 論

酚性成分廣泛分布于中藥中，是多種中藥的有效成分，具有多種藥理活性，如抗炎、抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗凝血、清除自由基及保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞等.前期研究表明，忍冬木層孔菌中含有多種酚性成分，與其抗炎、抗腫瘤活性密切相關(guān)，因此，對(duì)忍冬木層孔菌總酚進(jìn)行了制備和分析.從總酚中得到兩種主要成分：原兒茶酸，3，4－二羥基芐叉丙酮.

采用乙醇超聲輔助提取，大孔樹(shù)脂吸附，乙醇洗脫制備忍冬木層孔菌總酚，得到總酚的含量達(dá)到63.35%，符合有效部位質(zhì)量要求，為進(jìn)一步研究總酚提供了基礎(chǔ).但該工藝制備總酚，得率較低，總酚的提取工藝需要進(jìn)一步優(yōu)化.

總酚中原兒茶酸的含量為13.1%，3，4－二羥基芐叉丙酮的含量為12.2%.兩種成分均具有抗腫瘤等藥理活性.可作為總酚的指示性成分.由于原兒茶酸易于獲得，故采用原兒茶酸為對(duì)照品測(cè)定總酚含量.原兒茶酸最大吸收波長(zhǎng)為256nm，3，4－二羥基芐叉丙酮最大吸收波長(zhǎng)為328nm.為了準(zhǔn)確測(cè)定含量，選用雙波長(zhǎng)同時(shí)測(cè)定兩種成分含量.

忍冬木層孔菌是桑黃的品種之一，具有良好的抗腫瘤作用，原兒茶酸，3，4－二羥基芐叉丙酮等酚性成分可能是忍冬木層孔菌發(fā)揮抗腫瘤作用的主要有效成分.但原兒茶酸、3，4－二羥基芐叉丙酮是否是忍冬木層孔菌抗腫瘤作用的主要有效成分及其相互作用有待進(jìn)一步深入研究.

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