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    高效液相色譜法同時測定板藍(lán)根藥材中5種成分的含量*

    2014-05-15 01:26:18肖平陳建偉李祥李進(jìn)
    醫(yī)藥導(dǎo)報 2014年11期
    關(guān)鍵詞:尿嘧啶鳥苷次黃嘌呤

    肖平,陳建偉,李祥,李進(jìn)

    (南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,南京 210023)

    ·藥物制劑與藥品質(zhì)量控制·

    高效液相色譜法同時測定板藍(lán)根藥材中5種成分的含量*

    肖平,陳建偉,李祥,李進(jìn)

    (南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,南京 210023)

    目的 建立高效液相色譜法同時測定板藍(lán)根藥材中尿嘧啶、次黃嘌呤、鳥苷、胸腺嘧啶、(R,S)-告依春5種成分的含量。方法Hanbon Hedera C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相乙腈(A)-水(B),線性梯度洗脫,流速1.0 mL·min-1;檢測波長254 nm,柱溫30℃。結(jié)果尿嘧啶、次黃嘌呤、鳥苷、胸腺嘧啶、(R,S)-告依春的線性范圍分別為1.97~39.40 mg·L-1(r=0.999 9),1.25~50.00 mg·L-1(r=0.999 9),0.25~10.40 mg·L-1(r=0.999 6),2.84~56.70 mg·L-1(r=0.999 9),0.72~28.80 mg·L-1(r=0.999 8);平均回收率分別為99.36%(RSD=0.91%),99.79% (RSD=1.12%),100.90%(RSD=1.71%),98.67%(RSD=1.50%),99.33%(RSD=0.94%)。結(jié)論該方法簡便,重復(fù)性好,靈敏度高,結(jié)果準(zhǔn)確可靠,可作為板藍(lán)根質(zhì)量控制的有效方法。

    板藍(lán)根;核苷;告依春;色譜法,高效液相;含量測定

    板藍(lán)根為十字花科植物菘藍(lán)(Isatis indigoticaFort.)的干燥根,具有清熱解毒、涼血利咽等功效[1],臨床上常用于病毒及細(xì)菌感染性疾病,尤其在抗病毒方面療效確切[2]。板藍(lán)根含有生物堿、有機酸、苯丙素、氨基酸、核苷等成分[3]。(R,S)-告依春為板藍(lán)根中的抗病毒活性成分之一,2010年版《中華人民共和國藥典》采用反相高效液相色譜(reverse phase high performance liquid chromatography,RP-HPLC)法測定板藍(lán)根中(R,S)-告依春的含量并對其進(jìn)行質(zhì)量控制[1-4]。核苷類成分大多具有抗病毒、抗菌、抗腫瘤、提高免疫力等活性,是板藍(lán)根中抗病毒的有效部位之一[5-6]。近年來高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)法測定板藍(lán)根及其制劑中(R,S)-告依春、腺苷、尿苷、鳥苷含量的文獻(xiàn)報道較多[7-9],但筆者未見對板藍(lán)根藥材中尿嘧啶、次黃嘌呤、胸腺嘧啶進(jìn)行含量測定的報道。本研究首次采用HPLC同時測定10批次板藍(lán)根藥材中尿嘧啶、次黃嘌呤、鳥苷、胸腺嘧啶、(R,S)-告依春含量,以期為板藍(lán)根的質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

    1 儀器與試藥

    1.1 儀器 Agilent1200 HPLC配G1315D型DAD檢測器(美國Agilent公司),電子天平(SHIMADZU,AY-220型)。

    1.2 試藥 尿嘧啶對照品(批號:20331-201207,純度: 99.8%)、次黃嘌呤對照品(批號:20333-201205,純度: 98.7%)、鳥苷對照品(批號:20332-201205,純度: 98.9%)、胸腺嘧啶對照品(批號:20330-201209,純度: 99.9%)均購自南昌貝塔生物技術(shù)有限公司。(R,S)-告依春對照品(批號:10122601,純度:99.5%)購自揚子江藥業(yè)集團南京海陵藥業(yè)有限公司。各對照品經(jīng)HPLC法檢測純度均>98%。乙腈(MERCK公司,色譜純,批號:1102374),水為超純水(由Millipore純水器制得),其他試劑均為分析純。板藍(lán)根藥材采集于全國各地,經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)生藥學(xué)教研室陳建偉教授鑒定為十字花科植物菘藍(lán)(Isatis indigoticaFort.)的干燥根。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 色譜條件 Hanbon Hedera C18色譜柱(4.6 mm× 250 mm,5 μm);流動相:乙腈(A)-水(B),線性梯度洗脫,0~6 min,100%B,~25 min,100%B→90%B,~29 min,90%B→75%B;流速:1.0 mL·min-1;檢測波長254 nm;柱溫30℃;進(jìn)樣量10 μL。根據(jù)液相色譜保留時間和紫外光譜信息對5種成分進(jìn)行指認(rèn),各色譜峰的峰形及分離度較好,結(jié)果見圖1[10]。

    2.2 溶液的制備

    2.2.1 對照品溶液的制備 取于干燥器中放置>24 h的尿嘧啶、次黃嘌呤、鳥苷、胸腺嘧啶、(R,S)-告依春對照品適量,精密稱定,加水配成濃度分別為394.0,250. 0,104.0,1 134.0,144.0 mg·L-1的對照品儲備液。分別移取一定體積的上述對照品儲備液于量瓶定容,配成含尿嘧啶、次黃嘌呤、鳥苷、胸腺嘧啶、(R,S)-告依春濃度分別為78.8,50.0,10.4,113.4,28.8 mg·L-1的混合儲備溶液,備用。

    2.2.2 供試品溶液的制備 參照2010年版《中華人民共和國藥典》方法,并稍作調(diào)整,取板藍(lán)根藥材粉末(過4號篩,篩孔內(nèi)徑250 μm)約1 g,精密稱定,置圓底燒瓶中,精密加入純化水50 mL,稱定質(zhì)量,連續(xù)回流提取2 h后放冷,再稱定質(zhì)量,用水補足減少的質(zhì)量。搖勻,取上清液適量過孔徑0.45 μm微孔濾膜,取續(xù)濾液作為供試品溶液[1]。

    2.3 方法學(xué)考察

    2.3.1 線性關(guān)系考察 取尿嘧啶、次黃嘌呤、鳥苷、胸腺嘧啶、(R,S)-告依春混合對照品儲備溶液,按不同比例加水稀釋成7個不同濃度,按含量測定方法測定。以對照品質(zhì)量濃度(mg·L-1)為橫坐標(biāo)(X),以相應(yīng)對照品峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸,得線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)。將上述混合對照品溶液進(jìn)行逐級稀釋,進(jìn)樣分析,以信噪比(S/N)約為10計定量限,以S/N約為3計檢出限,線性回歸參數(shù)、檢測限、定量限結(jié)果見表1。

    A.對照品;B.樣品;1.尿嘧啶;2.次黃嘌呤;3.鳥苷;4.胸腺嘧啶;5.(R,S)-告依春圖1 對照品和樣品的HPLC圖A.reference substances;B.Sample;1.uracil;2.hypoxanthine; 3.guanosine;4.thymine 5.(R,S)-goitrinFig.1 HPLC chromatograms of reference substances and sample

    2.3.2 精密度實驗 取同一混合對照品溶液在上述色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次,尿嘧啶、次黃嘌呤、鳥苷、胸腺嘧啶、(R,S)-告依春峰面積的RSD(n=6)分別為0.4%, 0.4%,2.0%,0.1%,0.2%,表明該儀器精密度良好。

    2.3.3 重復(fù)性實驗 取同一批板藍(lán)根藥材粉末(S2)按“2.2.2”項下供試品溶液制備方法平行處理6份,進(jìn)行測定,以峰面積外標(biāo)法計算含量,尿嘧啶、次黃嘌呤、鳥苷、胸腺嘧啶、(R,S)-告依春的含量分別為0.45,0.54,0.06,0.01,0.20 mg·g-1,RSD(n=6)分別為0.5%,2.5%,1.9%,2.3%,2.6%,結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

    2.3.4 穩(wěn)定性實驗 取同一批次板藍(lán)根藥材粉末,按“2.2.2”項供試品溶液制備方法操作,制備供試品溶液,分別在0,2,4,6,8,12,24 h進(jìn)樣分析,測得尿嘧啶、次黃嘌呤、鳥苷、胸腺嘧啶、(R,S)-告依春含量的RSD(n=7)分別為0.3%,1.1%,2.3%,2.1%,1.8%,表明供試品溶液室溫放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

    表1 5種成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、定量限和檢出限Tab.1 Regression equations,correlation coefficients(r),linear ranges,limits of quantification(LOQ)and limits of detection (LOD)of five compounds

    2.3.5 加樣回收率實驗 精密稱取同批次已知含量的板藍(lán)根藥材粉末(S10)約0.2 g,共6份,每份按一定比例加入適量尿嘧啶、次黃嘌呤、鳥苷、胸腺嘧啶、(R,S)-告依春對照品儲備液,按“2.2.2”項下供試品溶液制備方法制備,按“2.1”項色譜條件進(jìn)樣分析,計算回收率結(jié)果,見表2。

    表2 5成分加樣回收率實驗結(jié)果Tab.2 Recoveries of five compounds n=6

    2.4 樣品測定 取不同批次板藍(lán)根藥材粉末,按“2.2.2”項供試品溶液制備方法制備樣品,按“2.1”項色譜條件進(jìn)行含量測定,計算各批次藥材不同成分的平均含量(n=3),結(jié)果見表3。

    表3 不同產(chǎn)地板藍(lán)根5種成分含量測定結(jié)果Tab.3 Contents of five compounds in Radix Isatidis from different districts n=3,mg·g-1

    3 討論

    3.1 供試品溶液配制方法的選擇 本實驗選用水和80%甲醇作為提取溶劑進(jìn)行提取,比較發(fā)現(xiàn)水提取效率較高且對人體無毒害,故選擇水作為提取溶劑。比較了煎煮、回流提取與超聲提取3種提取方法,發(fā)現(xiàn)回流提取效率優(yōu)于其他兩種提取方法,且可以減少提取溶劑的損失。在此基礎(chǔ)上,考察了回流提取時間對實驗結(jié)果的影響,結(jié)果表明采用水連續(xù)回流提取2 h后5種成分基本提取完全。

    3.2 高效液相色譜條件的建立 《中華人民共和國藥典》2010年版中板藍(lán)根的指標(biāo)性成分是(R,S)-告依春,檢測波長為245 nm,在200~400 nm范圍內(nèi)用二極管陣列檢測器對樣品進(jìn)行全波長掃描,5種成分的最大吸收波長在240~265 nm范圍內(nèi),在254 nm處色譜峰數(shù)較多,且所測成分的響應(yīng)值較大,綜合考慮選擇254 nm作為檢測波長。在流動相系統(tǒng)的選擇中,試用了甲醇-0.02%磷酸溶液、甲醇-水-0.2%甲酸、水-乙腈3種流動相系統(tǒng),結(jié)果表明采用水-乙腈系統(tǒng)時分離度較好。由于所測的成分極性較大,起始時較大比例的乙腈造成出峰時間過于提前,經(jīng)摸索后確定選用水-乙腈系統(tǒng)梯度洗脫,5種成分分離效果較好,可避免使用緩沖鹽作為流動相造成色譜柱的損害,延長色譜柱使用壽命。

    3.3 含量測定結(jié)果分析 《中華人民共和國藥典》2010年版中規(guī)定(R,S)-告依春含量不得低于0.020%,10批次藥材中產(chǎn)于安徽和四川綿陽的板藍(lán)根(R,S)-告依春含量分別為0.012%,0.013%,低于《中華人民共和國藥典》(2010年版)標(biāo)準(zhǔn),其他批次藥材均符合標(biāo)準(zhǔn)。從5種成分總量來看,產(chǎn)自甘肅河西(S3)的板藍(lán)根含量最高,而同產(chǎn)自于甘肅的S4樣品的總含量最低。10批次板藍(lán)根中胸腺嘧啶含量普遍都較低,產(chǎn)自于內(nèi)蒙古赤峰的板藍(lán)根中尿嘧啶和次黃嘌呤的含量均最高,而產(chǎn)自甘肅的S4樣品中尿嘧啶和次黃嘌呤含量最低。不同批次板藍(lán)根藥材中各成分的含量差異性較大,即使同一產(chǎn)地的板藍(lán)根藥材中核苷類成分含量差異也較大。

    本實驗首次采用高效液相法同時測定板藍(lán)根藥材中尿嘧啶、次黃嘌呤、鳥苷、胸腺嘧啶、(R,S)-告依春的含量。該方法簡便,測定結(jié)果準(zhǔn)確、可靠,重復(fù)性較好,可用于板藍(lán)根藥材及其制劑的質(zhì)量控制。

    [1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:191.

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    DOI 10.3870/yydb.2014.11.023

    Simultaneous Determination of Five Compounds in Isatidis Radix by HPLC

    XIAO Ping,CHEN Jian-wei,LI Xiang,LI Jin
    (College of Pharmacy,Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023,China)

    ObjectiveTo establish a HPLC method for simultaneous determination of uracil,hypoxanthine,guanosine, thymine,and(R,S)-goitrin inIsatidis Radix.MethodsThe determination was performed on a Hanbon Hedera C18column (4.6 mm×250 mm,5 μm).The mobile phase consisted of acetonitrile(A)and water(B)with linear gradient elution at the flow rate of 1.0 mL·min-1.The column temperature was 30℃.Detection wavelength was 254 nm.ResultsThe linear range of uracil,hypoxanthine,guanosine,thymine,and(R,S)-goitrin was 1.97-39.40 mg·L-1(r=0.999 9),1.25-50.00 mg·L-1(r= 0.999 9),0.25-10.40 mg·L-1(r=0.999 6),2.84-56.70 mg·L-1(r=0.999 9),and 0.72-28.80 mg·L-1(r=0.999 8), respectively.The average recovery was 99.36%(RSD=0.91%),99.79%(RSD=1.12%),100.90%(RSD=1.71%),98.67% (RSD=1.50%),and 99.33%(RSD=0.94%),respectively.ConclusionThe method is simple,accurate,reliable,reproducible and sensitive,which can be used as an effective method for quality control ofIsatidis Radix.

    Isatidis Radix;Nucleosides;(R,S)-goitrin;HPLC;Content determination

    R286;R927.2

    B

    1004-0781(2014)11-1481-05

    2013-10-25

    2013-11-22

    *國家自然科學(xué)基金資助項目(81073023);江蘇省產(chǎn)學(xué)研聯(lián)合創(chuàng)新獎金項(BY2009109);南京中醫(yī)藥大學(xué)“康緣中醫(yī)藥科技創(chuàng)新基金”項目(HZ0808KY);江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項目(YSXK-2010);江蘇省2013年度普通高校研究生科研創(chuàng)新計劃項目(CXZZ13_06)

    肖平(1987-),男,湖南衡陽人,在讀博士,主要從事中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。電話:025-85811512, E-mail:pingxiao58@126.com。

    李祥(1953-),女,教授,博士生導(dǎo)師,從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。電話:025-85811512,E-mail:lixiang_8182 @163.com。

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