p38 MAPK信號通路在異氟醚誘導(dǎo)新生大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用

廖朝霞，王 飛，曹德雄，柳垂亮，李玉娟

（1.中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院麻醉科，廣東廣州 510120；2.廣東省佛山市禪城中心醫(yī)院麻醉科，廣東佛山 528030）

吸入麻醉藥異氟醚是臨床常用的吸入麻醉藥。目前有多篇研究報道異氟醚可導(dǎo)致哺乳類動物（包括嚙齒類，靈長類等）發(fā)育期大腦神經(jīng)細(xì)胞毒性并損害幼年和成年時期的空間學(xué)習(xí)記憶［1－3］，而誘導(dǎo)發(fā)育神經(jīng)細(xì)胞凋亡是異氟醚神經(jīng)毒性的主要機(jī)制之一，但其誘導(dǎo)凋亡的信號調(diào)節(jié)通路目前尚未完全明確。

絲裂原激活的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）為絲氨酸－蘇氨酸蛋白激酶，介導(dǎo)信號從細(xì)胞表面向核內(nèi)傳遞的重要信號系統(tǒng)，參與細(xì)胞生長、增殖、分化、凋亡等多種生理過程。p38 MAPK是MAPKs家族中重要的一員，主要介導(dǎo)炎癥、應(yīng)激、損傷等信號傳遞，能被促炎細(xì)胞因子、毒素等應(yīng)激因素所激活，在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、神經(jīng)退行性改變和神經(jīng)細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮作用，p38通路異常過度激活可導(dǎo)致細(xì)胞生長停滯和凋亡［4］。

我們前期研究發(fā)現(xiàn)，異氟醚和七氟醚誘導(dǎo)的發(fā)育幼鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡過程中，可以不同程度地影響MAPK通路的活性，異氟醚可以同時減少磷酸化ERK1／2表達(dá)，增加磷酸化 JNK和磷酸化 p38表達(dá)［5］，誘導(dǎo)更多的神經(jīng)細(xì)胞凋亡。JNK抑制劑可以減少異氟醚誘導(dǎo)的幼鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡，提示JNK信號通路激活參與了異氟醚誘導(dǎo)的發(fā)育期海馬神經(jīng)細(xì)胞毒性［6］。是否p38 MAPK也參與了異氟醚誘導(dǎo)的發(fā)育期海馬神經(jīng)細(xì)胞毒性目前未見相關(guān)報道。本研究擬使用p38 MAPK抑制劑觀察p38 MAPK信號通路在異氟醚誘導(dǎo)的發(fā)育大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡中的作用。

1 方法

1.1 儀器與試劑 麻醉氣體檢測儀（美國歐米達(dá)公司），Olympus IX70倒置顯微鏡（日本奧林巴斯公司）。異氟醚（美國雅培制藥有限公司），SB203580（美國Selleck公司）。一抗均為兔抗大鼠（美國Cell Signal生物技術(shù)公司），羊抗兔二抗（武漢博士德公司），TUNEL熒光染色試劑盒（美國Promega公司），Hoechst33258染色液（碧云天生物技術(shù)研究所）。

1.2 動物處理及分組 出生后7 d（P7）的SD大鼠，隨機(jī)分為4組：空氣 ＋DMSO組（Air＋DMSO組）、空氣 ＋SB203580組（Air＋SB20組）、異氟醚 ＋DMSO組（Iso＋DMSO組）、異氟醚 ＋SB203580組（Iso＋SB20組）。其中SB203580為p38 MAPK抑制劑，溶解于DMSO，經(jīng)側(cè)腦室注射，SB203580的注射劑量為20 nmol。前2組吸入空氣，后2組吸入體積分?jǐn)?shù)為0.011異氟醚4 h。DMSO組與抑制劑組在處理前30min側(cè)腦室注射體積分?jǐn)?shù)為0.1DMSO或p38 MAPK抑制劑5μl。幼鼠麻醉結(jié)束后6 h，一部分?jǐn)囝^取腦，取新鮮的海馬組織，Western blot方法檢測海馬激活型 caspase-3，磷酸化 p38（phosphop38，p-p38）及其下游分子磷酸化 NF-κB（phospho-NF-κB，p-NF-κB），Bax和Bcl-2等蛋白的表達(dá)；一部分幼鼠經(jīng)心臟灌注后取腦組織，使用原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記（terminal deoxyribonucleotide transferase-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）法檢測海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

1.3 麻醉處理 按照我們以前報道的方法［5－6］，將新生大鼠放置于密閉麻醉箱中，該麻醉箱放置于預(yù)設(shè)溫度為37℃的水浴箱中。麻醉箱與麻醉機(jī)相連，Iso組使用體積分?jǐn)?shù)為0.011的異氟醚處理4 h，空氣組則吸入空氣，麻醉氣體通過麻醉機(jī)的揮發(fā)罐由壓縮空氣輸送通過該麻醉箱，氣體流量為2 L·min－1。幼鼠呼氣末麻醉氣體的濃度、氧氣和二氧化碳濃度由連接于麻醉箱的麻醉氣體監(jiān)測儀監(jiān)測。

1.4 組織處理 各組分別在麻醉處理結(jié)束后6 h，取6只幼鼠，斷頭取腦，冰上分離腦海馬組織，液氮速凍后轉(zhuǎn)移至－80℃保存，組織用來做Western blot分析。另外在麻醉結(jié)束6 h后每組均取6只幼鼠，經(jīng)心臟灌注40 g·L－1多聚甲醛固定液15 min后取腦。腦組織在同樣的灌注液中4℃后固定48 h后梯度脫水，石蠟包埋，參照幼鼠腦解剖圖譜，分別在前囟－3.14～－4.16 mm區(qū)經(jīng)冠狀平面切取5μm連續(xù)石蠟切片，每隔200μm取3個腦片，每個腦組織取18張腦片，進(jìn)行TUNEL染色。

1.5 W estern blot 按照我們以前報道的方法［5－6］。簡述如下，新鮮冰凍的腦海馬組織經(jīng)超聲裂解后提取蛋白，根據(jù)其蛋白濃度（BCA法測定），配平使各樣本蛋白等量。1∶1 000兔抗大鼠cleaved caspase-3多克隆抗體，1∶1 000兔抗大鼠pp38抗體，1∶1 000兔抗大鼠p38抗體，1∶1 000兔抗大鼠p-NF-κB抗體，1∶1 000兔抗大鼠Bax抗體，1∶1 000兔抗大鼠Bcl-2抗體以及1∶2 000β-actin，4℃孵育過夜，1∶5 000二抗室溫孵育1 h，使用ECL進(jìn)行膠片顯影。

1.6 TUNEL 參照我們以前報道的方法進(jìn)行［6］。簡述如下，石蠟組織切片脫蠟水化后，蛋白酶 K工作液（20 mg· L－1）室溫反應(yīng)15 min，平衡緩沖液分別處理10 min，每個樣本滴加50μl的酶反應(yīng)液（TdT 5μl，熒光素連接的dUTP混合緩沖液45μl）于37℃、濕盒中避光孵育60 min。去離子水終止反應(yīng)，Hoechst33258避光反應(yīng)5 min，抗熒光淬滅封片劑封片。Olympus IX70倒置熒光顯微鏡獲得海馬CA1區(qū)200×圖像用Image-Pro Plus軟件進(jìn)行圖像分析，并采用盲法計算單位面積的陽性細(xì)胞數(shù)。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 實驗數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，以ˉx±s表示，以Graphpad Prism 6.0統(tǒng)計軟件分析。采用單因素方差分析（one-way ANOVA）檢驗，組間采用Turkey法檢驗進(jìn)一步對各組進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 SB203580減少了異氟醚誘導(dǎo)的新生鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡 在幼鼠海馬CA1區(qū)，Iso＋DMSO組單位面積（mm2）的 TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)（133.71±30.19），比 Air＋DMSO組（22.74±11.92）增加了約4.8倍（P＜0.01），而 Iso＋SB20組的單位面積（mm2）TUNEL陽性細(xì)胞（51.05±10.25）比 Iso＋DMSO組降低了約 3／5（P＜0.01）（Fig 1，Tab 1）。Western blot檢測海馬早期凋亡蛋白cleaved caspase-3的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)異氟醚增加了海馬cleaved caspase-3的表達(dá)（P＝0.003），而 SB203580逆轉(zhuǎn)了異氟醚誘導(dǎo)的cleaved caspase-3的表達(dá)增多（P＝0.007）。上述結(jié)果提示p38抑制劑可以減輕異氟醚誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡（Fig 2，Tab 2）。Air＋SB20組TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)目及cleaved caspase-3表達(dá)與Air＋DMSO組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明SB203580本身不會引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

Tab 1 Effect of SB203580 on isoflurane-induced increase of TUNEL positive cells in hippocampus CA1 area（±s，n＝6）

Tab 1 Effect of SB203580 on isoflurane-induced increase of TUNEL positive cells in hippocampus CA1 area（±s，n＝6）

The count of TUNEL positive cellswas catulated by diving the number of TUNEL positive cells by the area of hippocampus CA1.**P＜0.01 vs Air＋DMSO；＃＃P＜0.01 vs Iso＋DMSO

Group TUNEL positive cells／mm－2 Air＋DMSO 22.710±5.964 Air＋SB20 20.367±4.273 Iso＋DMSO 133.714±7.503**Iso＋SB20 39.964±5.139＃＃

2.2 SB203580對異氟醚麻醉誘導(dǎo)的海馬p-p38及其下游p-NF-κB表達(dá)的影響 與Air＋DMSO組比較，Iso＋DMSO組幼鼠海馬p38（P＜0.01）及其下游 NF-κB（P＝0.004）的磷酸化表達(dá)增加，提示異氟醚麻醉激活了p38 MAPK通路。與Iso＋DMSO組比較，Iso＋SB20組 p-p38（P＜0.01）及 p-NF-κB（P＝0.028）的表達(dá)降低，提示p38抑制劑SB203580抑制了異氟醚誘導(dǎo)的p38及其下游NF-κB的激活。Air＋SB20組p-p38及p-NF-κB表達(dá)與Air＋DMSO組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明SB203580對正常幼鼠的p38及 NF-κB活性沒有明顯影響（Fig 2，Tab 2）。

Fig 1 TUNEL positive cell in hippocam pus CA1 area（×200）Representative photomicrographs of Hoechest-and TUNEL-positive cells.Green staining indicated TUNEL positive cells and blue staining indicated nuclei.Scan bar＝50μm.

Fig 2 Expression of cleaved caspase-3，phospho-p38，p38，phospho-NF-κB，Bcl-2 and Bax proteins in hippocam pus by W estern blot

2.3 SB203580對異氟醚麻醉誘導(dǎo)的新生大鼠海馬Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的變化 與Air＋DMSO組比，Iso＋DMSO組海馬 Bax表達(dá)增加（P＜0.01）和Bcl-2表達(dá)降低（P＜0.01），Bcl-2／Bax比值下降（P＜0.01），提示異氟醚麻醉激活了Bcl-2家族凋亡相關(guān)蛋白通路；與Iso＋DMSO組相比，Iso＋SB20組幼鼠海馬 Bax表達(dá)下調(diào)（P＜0.01），Bcl-2表達(dá)增加（P＜0.01），Bcl-2／Bax比值上升（P＝0.006），提示 p38抑制劑SB203580逆轉(zhuǎn)了異氟醚誘導(dǎo)的Bcl-2家族凋亡相關(guān)蛋白的變化。Air＋SB20組Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)與Air＋DMSO組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示SB203580本身不會引起B(yǎng)cl-2家族凋亡相關(guān)蛋白的變化（Fig 2，Tab 2）。

3 討論

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)異氟醚可以通過誘導(dǎo)p38及其下游分子NF-κB磷酸化表達(dá)增加而激活p38 MAPK通路，并且通過增加Bax表達(dá)，降低Bcl-2的表達(dá)，從而降低Bcl-2／Bax比值，誘導(dǎo)海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡。而p38抑制劑SB203580能通過抑制異氟醚誘導(dǎo)的p38及NF-κB磷酸化激活，逆轉(zhuǎn)異氟醚誘導(dǎo)的Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)以及Bcl-2／Bax比值的變化，減輕異氟醚麻醉引起的神經(jīng)細(xì)胞凋亡。結(jié)果提示，p38 MAPK信號通路激活是異氟醚引起的幼鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一。

凋亡是異氟醚誘導(dǎo)發(fā)育神經(jīng)細(xì)胞毒性的主要機(jī)制之一。TUNEL是檢測細(xì)胞凋亡的金指標(biāo)，而caspase-3是檢測早期細(xì)胞凋亡的常用指標(biāo)。有研究報道［7］，異氟醚麻醉誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的高峰時間發(fā)生在麻醉結(jié)束后6 h左右。本研究發(fā)現(xiàn)，在麻醉后6h，異氟醚麻醉可以引起突觸發(fā)育期SD大鼠海馬cleaved caspase-3表達(dá)增加，TUNEL染色陽性數(shù)目增加，與其他學(xué)者報道以及我們前期研究結(jié)果一致［5－7］。

Tab 2 Effects of SB203580 on isoflurane-induced activation of p38／NF-κB pathway and apoptosis pathway（±s，n＝6）

Tab 2 Effects of SB203580 on isoflurane-induced activation of p38／NF-κB pathway and apoptosis pathway（±s，n＝6）

The objective of protein bandswasexpressed by the density ratio of the corresponding band toβ-actin or p38 after densitometric analysis.Each value was presented after normalization.**P＜0.01 vs Air＋DMSO；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs Iso＋DMSO

Group cleaved caspase-3／β-actin p-p38／p38 p-NF-κB／β-actin Bax／β-actin Bcl-2／β-actin Bcl-2／Bax Air＋DMSO 1.000±0.163 1.073±0.147 0.993±0.130 0.964±0.137 0.989±0.111 1.030±0.103 Air＋SB20 0.946±0.218 0.965±0.223 0.931±0.136 0.922±0.142 0.892±0.130 0.977±0.179 Iso＋DMSO 2.095±0.383** 1.887±0.426** 1.662±0.233** 1.960±0.354** 0.328±0.260** 0.278±0.156**Iso＋SB20 1.210±0.270＃＃ 1.173±0.173＃＃ 1.172±0.163＃ 1.100±0.273＃＃ 0.987±0.254＃＃ 0.587±0.121＃＃

異氟醚誘導(dǎo)發(fā)育神經(jīng)細(xì)胞凋亡的機(jī)制中，線粒體凋亡通路起著重要的作用。Bcl-2家族蛋白的表達(dá)平衡對維持正常的線粒體膜電位至關(guān)重要。我們前期的研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)可通過抑制Akt／Bad通路，減少Bad磷酸化，降低Bcl-xl／Bad比值誘導(dǎo)幼鼠皮質(zhì)和海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡［8－10］。小鼠在體和離體模型均證實了暴露于體積分?jǐn)?shù)為0.02的異氟醚6h可以上調(diào)神經(jīng)元Bax水平，降低Bcl-2表達(dá)，同時增加ROS的蓄積，促進(jìn)細(xì)胞色素C從線粒體釋放到胞質(zhì)，導(dǎo)致caspase-9和caspase-3的激活，最終引起細(xì)胞凋亡［11］。這與本研究發(fā)現(xiàn)的積分?jǐn)?shù)為0.011的異氟醚增加P7大鼠海馬Bax水平，降低Bcl-2表達(dá)以及降低Bcl-2／Bax比值的結(jié)果一致。此外，異氟醚也可通過開放線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mitochondrial permeability transition pore，MPTP）介導(dǎo)對小鼠海馬神經(jīng)元的毒性，提高ROS的水平，降低線粒體膜電位和 ATP的生成，激活 caspase-3，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［12］。

異氟醚不僅能誘導(dǎo)發(fā)育期神經(jīng)細(xì)胞凋亡，且短時間的異氟醚預(yù)處理對缺血大鼠模型和缺氧皮質(zhì)神經(jīng)元均有神經(jīng)保護(hù)作用。Zheng等［13］發(fā)現(xiàn)體積分?jǐn)?shù)為0.02的異氟醚預(yù)處理對大鼠腦缺血的神經(jīng)保護(hù)作用與p38 MAPK通路激活密切相關(guān)。Bickler等［14］則發(fā)現(xiàn)異氟醚減少缺氧皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡的作用與異氟醚誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)Ca2＋濃度輕度增加，以及Ca2＋依賴的 Pyk2／ERK，JNK／C-Jun和 PI3-kinase／Akt通路激活有關(guān)；然而單獨(dú)的異氟醚或缺氧均可誘導(dǎo)皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡和p38磷酸化增加，異氟醚和缺氧共同處理的神經(jīng)元中p38磷酸化則減少，這是否與異氟醚預(yù)處理的神經(jīng)保護(hù)作用有關(guān)還不清楚。

p38 MAPK信號通路，在神經(jīng)細(xì)胞凋亡過程中也可發(fā)揮重要作用［15－16］。研究發(fā)現(xiàn) p38 MAPK的激活與阿爾采末病中β-淀粉樣沉積和tau蛋白高度磷酸化引起的神經(jīng)元凋亡密切相關(guān)［17－18］；p75神經(jīng)營養(yǎng)受體表達(dá)增加引起的氧自由基在線粒體的積聚和細(xì)胞凋亡也依賴于 p38 MAPK磷酸化激活［19］。我們前期的研究也發(fā)現(xiàn)異氟醚增加了幼鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡和p38 MAPK磷酸化表達(dá)［5］。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)積分?jǐn)?shù)為0.011的異氟醚誘導(dǎo)幼鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡的同時，也增加了海馬p38 MAPK與其下游NF-κB的磷酸化表達(dá)，說明異氟醚麻醉也激活了p38 MAPK信號通路。

p38 MAPK激活后，一方面可以直接激活Bax轉(zhuǎn)移并插入線粒體外膜。在線粒體外膜，Bax發(fā)生寡聚體化，形成MPTP，影響線粒體膜通透性，細(xì)胞色素 C釋放至胞質(zhì)，caspase級聯(lián)反應(yīng)被激活，cleaved caspase-3表達(dá)增加而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［16，20］。另一方面，磷酸化p38還可以磷酸化核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，激活的NF-κB可與許多靶基因的特異性同源DNA序列結(jié)合，調(diào)控細(xì)胞核凋亡相關(guān)基因的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，p38特異性抑制劑SB203580不僅逆轉(zhuǎn)了異氟醚誘導(dǎo)的p38 MAPK與其下游NF-κB蛋白磷酸化激活，也逆轉(zhuǎn)了異氟醚誘導(dǎo)的Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)以及Bcl-2／Bax比值的變化，減輕了異氟醚誘導(dǎo)的幼鼠海馬caspase-3激活和細(xì)胞凋亡，提示SB203580可以從線粒體通路以及細(xì)胞核通路兩方面減輕異氟醚麻醉引起的神經(jīng)細(xì)胞凋亡。Ghatan等［21］使用人SH-SY5Y神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞和原代皮質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)一氧化氮（NO）誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與激活p38 MAPK，促進(jìn)Bax從胞質(zhì)向線粒體轉(zhuǎn)移，增加線粒體膜通透性有關(guān)，與我們的結(jié)果一致。雖然本研究結(jié)果提示p38 MAPK激活參與了異氟醚誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，但是對于p38 MAPK激活后線粒體凋亡通路和細(xì)胞核凋亡通路哪一個優(yōu)先啟動，那一條通路占有主導(dǎo)地位，本研究尚不能得出結(jié)論。

已證明 p38 MAPK／NF-κB通路激活與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)［22］，而近期的研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)炎癥可以促進(jìn)吸入麻醉藥誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡和認(rèn)知功能障礙［23－25］。異氟醚麻醉可以增加老年小鼠海馬促炎性細(xì)胞因子白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）和白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）水平，而且NF-κB激活參與了異氟醚引起的海馬IL-1β和IL-6水平增加［25］。使用IL-1β基因敲除的小鼠可以改善異氟醚誘導(dǎo)的認(rèn)知功能障礙，提示IL-1β激活參與了異氟醚誘導(dǎo)的認(rèn)知功能障礙［23－24］。而 Shen等［26］發(fā)現(xiàn)使用抗炎藥能減輕七氟醚誘導(dǎo)的幼鼠神經(jīng)毒性和認(rèn)知功能損害，提示神經(jīng)炎性通路的激活與吸入麻醉藥的神經(jīng)毒性密切相關(guān)。我們的結(jié)果顯示p38抑制劑 SB203580抑制p38 MAPK／NF-κB通路激活，推測異氟醚誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡有可能與激活p38 MAPK／NF-κB通路引起的神經(jīng)炎癥有關(guān)，確切的結(jié)論需要進(jìn)一步檢測海馬炎性因子的表達(dá)變化來證明。

本研究的不足之處在于沒有應(yīng)用NF-κB抑制劑深入探討NF-κB通路下游的蛋白變化，沒有檢測異氟醚和p38 MAPK／NF-κB通路抑制劑對幼鼠海馬促炎性細(xì)胞因子IL-1β和IL-6表達(dá)水平的影響，以及對幼鼠成年期的認(rèn)知功能的影響。這些需在以后的研究中進(jìn)一步完善。

總之，本研究通過建立P7新生大鼠吸入體積分?jǐn)?shù)為0.011的異氟醚4 h模型，并聯(lián)合使用p38抑制劑SB203580處理，發(fā)現(xiàn)異氟醚可通過激活p38 MAPK通路來誘導(dǎo)新生大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。

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