應(yīng)用Micro CT觀察洛伐他汀和秋水仙堿對CCl4致肝損傷后小鼠骨代謝的影響

呂思敏，于 瓊，夏海珊，崔 燎，2，吳 鐵

（1.廣東醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，廣東東莞 523808；2.廣東天然藥物研究與開發(fā)重點實驗室，廣東湛江 524023）

四氯化碳（CCl4）是建立肝損傷模型最常用的物質(zhì)，其作用機制與氧自由基的脂質(zhì)過氧化相關(guān)［1－2］。慢性肝病常伴有骨代謝的改變，可致肝性骨營養(yǎng)不良及骨質(zhì)疏松等肝性骨病的發(fā)生，以骨質(zhì)疏松最為常見［3］。目前發(fā)現(xiàn)，不僅原發(fā)性膽汁性肝硬化可發(fā)生骨質(zhì)疏松癥，其它原因的肝臟疾病也可引起。因此，防治肝臟疾病所導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松癥日漸受到重視。

秋水仙堿是公認(rèn)的抗肝纖維化藥物，但邱永祥等［4］試驗證明，秋水仙堿對小鼠的肝臟有損傷作用。臨床研究表明［5］，服用他汀類藥物可以升高血清骨鈣素水平。但在肝損傷后的治療中是否能夠預(yù)防骨丟失，目前還未見報道。

本實驗旨在用小鼠建立肝損傷的動物模型，通過Micro CT觀察骨組織結(jié)構(gòu)，以探討在肝損傷中骨丟失的狀況，并同時觀察洛伐他汀、秋水仙堿在護(hù)肝的同時是否有減少骨丟失的作用，為其應(yīng)用于肝硬化性骨病的防治提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物 本院實驗動物中心提供的普通級昆明種小白鼠32只，體質(zhì)量（36.77±5.23）g，♀♂兼用。

1.2 藥物 四氯化碳（分析純），購于天津市大茂化學(xué)試劑廠。實驗時，用花生食用調(diào)和油配成體積分?jǐn)?shù)為 40%的 CCl4溶液。秋水仙堿片，批號120125，購于西雙版納版納藥業(yè)有限責(zé)任公司；洛伐他汀片，批號20120108，購于北京萬生藥業(yè)有限責(zé)任公司；實驗時用蒸餾水配制成混懸液。

1.3 儀器與試劑 Micro CT儀（viva CT40；SCANCO Medical AG），BioTek Synergy 2多功能酶標(biāo)儀，Eppendorf 5415R小型高速冷凍離心機，賽多利斯BT 25S電子天平。谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST／GOT）測定試劑盒、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT／GPT）測定試劑盒、總超氧化物歧化酶（T-SOD）測試盒、丙二醛（MDA）測試盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）測試盒、考馬斯亮藍(lán)蛋白測定試劑盒均購于南京建成生物工程研究所。

1.4 實驗方法 取上述小鼠隨機分為4組，每組8只，分籠飼養(yǎng)，對照組（CON）：給予花生油0.1 ml·（10 g）－1皮下注射，首劑加倍，每隔5天注射1次，于造模次日給予蒸餾水10 ml·kg－1灌胃，每日1次，連續(xù)1個月；四氯化碳組（CTC）：為肝損傷模型組，給予體積分?jǐn)?shù)為40%的CCl4花生油溶液按0.1 ml·（10 g）－1皮下注射，首劑加倍，每隔5天注射1次，注射后給予蒸餾水10 ml·kg－1灌胃，每日1次，連續(xù)1個月；洛伐他汀組（LOV）：按模型組同法給予CCl4后，按2.6 mg·kg－1給予洛伐他汀溶液灌胃，每日1次，連續(xù)1個月；秋水仙堿組（COL）：按模型組同法給予CCl4后，按0.065 mg·kg－1給予秋水仙堿溶液灌胃，每日1次，連續(xù)1個月。上述動物飼養(yǎng)條件相同，自由進(jìn)食和飲水。每隔5天稱體重1次，均于實驗d 30晚上禁食，禁食12 h后動物摘眼球取血，分離血清，測定AST、ALT；剝離肝臟，制備肝勻漿，測 GSH-Px、SOD、MDA；同時剝離右側(cè)脛骨，用于Micro CT檢測。

1.5 觀察指標(biāo)及測定方法

1.5.1 小鼠體重及肝臟重量的觀察 小鼠肝臟系數(shù)的計算：肝臟系數(shù) ＝［肝臟重量（g）／小鼠體重（g）］×100%

1.5.2 血清學(xué)指標(biāo)AST、ALT活性的檢測 小鼠血樣3 000 r·min－1離心 10 min（4℃），取血清，采用比色法，用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測，具體步驟均按試劑盒說明書操作。

1.5.3 肝勻漿抗氧化指標(biāo)的檢測 準(zhǔn)確稱取肝臟相同部位0.2 g，用冷生理鹽水1.8 ml制備10%肝勻漿，按試劑盒說明書分別測定SOD活性、MDA和GSH-Px水平。

1.5.4 Micro CT對小鼠脛骨骨小梁的分析［6－7］將小鼠脛骨除盡肌肉和附著組織，放入Micro CT儀，對脛骨近干骺端進(jìn)行X射線掃描。掃描條件為：電壓70 kVp，電流114μA，掃描時間為24.8 min（單層），間隔時間為200 ms，分辨率為中度（Medium）。進(jìn)行角度為180°的投射，對同一樣品掃描獲得500張不同截面的1024×1024像素的圖片，對于脛骨選取距生長板遠(yuǎn)端1 mm，層厚2 mm的骨組織為興趣區(qū)域（region of interest，ROI）進(jìn)行三維重建。完成圖像二值化，選定ROI內(nèi)松質(zhì)骨進(jìn)行三維可視化呈現(xiàn)。定量分析使用其軟件（SCANCO Medical AG），分析參數(shù)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)用ˉx±s表示，多組用F檢驗，兩兩比較用q檢驗。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠實驗前及實驗后的體重變化 小鼠體重各組間無統(tǒng)計學(xué)意義，但有下列趨勢：對照組小鼠體重隨時間稍有增加趨勢，在實驗結(jié)束時，體重比實驗前增幅10.54%，其余各組小鼠在給予CCl4后體重下降，后逐步回升（Tab 1）。

2.2 各組小鼠實驗后肝重量及肝指數(shù)的變化 如Tab 2所示，與對照組比較，模型組小鼠肝臟指數(shù)明顯升高，升高了約28.48%（P＜0.05）。與對照組相比，洛伐他汀組、秋水仙堿組的肝臟指數(shù)明顯升高（P＜0.05），與模型組相比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

Tab1 EffectsofdrugsonbodyweightinCCl4inducedliverinjuryinmice（ˉx±s，n＝8）

Tab2 EffectsofdrugsonliverindexinCCl4induced liverinjuryinmice（ˉx±s，n＝8）

2．3 各組小鼠實驗后血清AST和ALT活性的變化 實驗數(shù)據(jù)表明（Tab3），由CCl4引起的肝損傷模型組血清AST、ALT活性比對照組明顯升高，分別升高了37.54%、97.59%（P＜0.05），差異有顯著性，提示造模成功。但洛伐他汀組、秋水仙堿組的AST和ALT活性均高于對照組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

Tab3 EffectsofdrugsonactivitiesofserumASTandALTin CCl4inducedliverinjuryinmice（ˉx±s，n＝8）

2．4 各組小鼠實驗后肝勻漿SOD活性及GSH-Px和MDA水平的變化 如Tab4所示，與對照組比較，模型組小鼠肝勻漿中SOD活性和GSH-Px水平明顯降低，分別降低了18.48%（P＜0.05）、24.96%（P＜0.05），MDA水平明顯升高，升高了約52.63%（P＜0.05），提示造模成功。與模型組比較，洛伐他汀組、秋水仙堿組小鼠肝勻漿中GSH-Px水平均明顯增強，分別增加了39.74%、29.09%（P＜0.05）。洛伐他汀和秋水仙堿組小鼠肝勻漿中SOD活性、MDA水平與模型組相比，差異均無顯著性。

2．5 MicroCT對小鼠脛骨骨組織結(jié)構(gòu)參數(shù)的分析

2.5.1 MicroCT測定小鼠脛骨BVF、Tb.N、Tb.Sp和Tb.Th值 如Tab5所示，模型組的骨體積分?jǐn)?shù)（BVF）、骨小梁數(shù)量（Tb.N）明顯低于對照組，分別降低了約48.01%（P＜0.05）、48.52%（P＜0.05），而骨小梁分離度（Tb.Sp）明顯高于對照組，升高了約154.54%（P＜0.05），但骨小梁厚度（Tb.Th）和對照組相比，差異無顯著性。表明小鼠脛骨的松質(zhì)骨在給予CCl4后出現(xiàn)了明顯的骨小梁體積分?jǐn)?shù)下降，骨小梁數(shù)量降低，間隙增寬，出現(xiàn)較為嚴(yán)重的結(jié)構(gòu)退變，表現(xiàn)骨質(zhì)疏松癥狀。秋水仙堿治療組的BVF值、Tb.N值明顯低于對照組（P＜0.05），Tb.Sp值明顯高于對照組（P＜0.05），Tb.Th值與對照組相比差異無顯著性，這表明秋水仙堿組骨量丟失嚴(yán)重，骨量與模型組相當(dāng)，說明秋水仙堿對CCl4致肝損傷所引發(fā)的骨小梁減少以及結(jié)構(gòu)退變的改善作用較弱。洛伐他汀治療組的BVF、Tb.N值介于模型組與對照組之間，且數(shù)據(jù)結(jié)果更為接近對照組，Tb.Th值與對照組相比差異無顯著性，這表明兩者骨小梁量相仿，骨量增加，說明洛伐他汀對CCl4致肝損傷所引發(fā)的骨小梁數(shù)量減少及骨小梁結(jié)構(gòu)退變的改善作用較強。

Tab4 EffectsofdrugsonSOD，GSH-PxandMDAinliverhomogenateinCCl4inducedliverinjuryinmice（ˉx±s，n＝8）

Tab5 ChangesofdrugsonBVF，Tb．N，Tb．SpandTb．Thof proximaltibialinCCl4inducedliverinjuryinmice（ˉx±s，n＝8）

2.5.2 MicroCT測定的小鼠脛骨TMD和Conn.D.值 如Tab6所示，模型組的組織礦物密度（TMD）值明顯低于對照組，降低了約46.51%（P＜0.05），說明小鼠的骨密度降低，模型組的連接密度（Conn.D.）值明顯低于對照組，降低了 71.83%（P＜0.05），說明小鼠的骨小梁網(wǎng)絡(luò)之間的連接數(shù)量較低，提示出現(xiàn)骨質(zhì)疏松癥狀。秋水仙堿治療組的Conn.D.值介于模型組與對照組之間，且數(shù)據(jù)結(jié)果更為接近模型組，但其TMD值與模型組相比差異有顯著性，增加了約88.24%（P＜0.05），說明秋水仙堿組能增加骨量，但是連接性不好。洛伐他汀治療組的Conn.D.值介于模型組與對照組之間，數(shù)據(jù)結(jié)果更為接近對照組，且其TMD值與模型組相比差異有顯著性，增加了約196.28%（P＜0.05），說明洛伐他汀能夠增加骨量且連接性較好。

Tab 6 Changes of drugs on TMD and Conn．D．of proximal tibial in CCl4 induced liver injury in mice（ˉx±s，n＝8）

2.5.3 Micro CT測定的小鼠脛骨SMI和DA值如Tab 7所示，模型組的結(jié)構(gòu)模型指數(shù)（SMI）值明顯高于對照組，增加了61.29%（P＜0.05），說明小鼠的骨小梁結(jié)構(gòu)形態(tài)由板狀結(jié)構(gòu)退變成桿狀結(jié)構(gòu)，呈現(xiàn)出骨質(zhì)疏松癥狀。模型組的各向異性的程度（DA）低于對照組，降低了25.48%（P＜0.05），也提示出現(xiàn)骨質(zhì)疏松癥狀。秋水仙堿治療組的DA值介于模型組與對照組之間，SMI數(shù)值接近于模型組，說明秋水仙堿對骨小梁的板狀結(jié)構(gòu)與桿狀結(jié)構(gòu)的調(diào)整無影響。洛伐他汀治療組的DA值明顯低于模型組（P＜0.05），SMI接近于模型組，說明洛伐他汀對骨小梁的板狀結(jié)構(gòu)與桿狀結(jié)構(gòu)的調(diào)整亦無影響。

Tab 7 Changes of drugs on SMI and DA of proximal tibial in CCl4 induced liver injury in mice（ˉx±s，n＝8）

2．6 Micro CT對小鼠脛骨ROI區(qū)的三維重建圖的分析 如Fig 1所示，通過掃描重建所得的三維圖像觀察到骨結(jié)構(gòu)形態(tài)，以及骨小梁的數(shù)量變化情況，模型組出現(xiàn)了骨小梁斷裂、變短的情況，而且在中央還出現(xiàn)了很大的間隙，這表明CCl4致肝損傷后能夠誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松的產(chǎn)生。而洛伐他汀組、秋水仙堿組骨小梁的形態(tài)結(jié)構(gòu)、緊密程度介于對照組與模型組之間，但洛伐他汀組的骨小梁較秋水仙堿的更為緊密，且間隙較小，表明洛伐他汀對于CCl4致肝損傷所引發(fā)的骨質(zhì)疏松癥狀有更好的保護(hù)作用。

3 討論

3.1 四氯化碳可誘導(dǎo)小鼠肝損傷并出現(xiàn)骨質(zhì)疏松本實驗用體積分?jǐn)?shù)為40%的CCl4花生油對小鼠進(jìn)行皮下注射，5 d 1次，連續(xù)1個月，從血清學(xué)指標(biāo)以及肝勻漿的抗氧化指標(biāo)檢測結(jié)果來看，說明CCl4對肝細(xì)胞具有明顯的破壞作用，故在本實驗條件下，用CCl4染毒小鼠造成肝損傷的實驗動物模型是成功的。CCl4是目前用于誘導(dǎo)肝損傷的經(jīng)典物質(zhì)，其機制是CCl4進(jìn)入機體后，在肝內(nèi)代謝生成三氯甲基和氯甲基自由基，從而啟動脂質(zhì)過氧化作用，進(jìn)而破壞肝細(xì)胞的膜性結(jié)構(gòu)。三氯甲基自由基還能抑制鈣泵的活性，使胞內(nèi)鈣離子濃度升高，造成肝細(xì)胞受損［8］。

Fig 1 Three-dimensional reconstruction scheme of ROI area for mice tibial

與對照組相比，模型組的 BVF、Tb.N、TMD、Conn.D.、DA值明顯降低，而Tb.Sp、SMI明顯升高，說明骨小梁大量丟失，間隙增寬，骨密度降低，出現(xiàn)嚴(yán)重的結(jié)構(gòu)退變，而且骨小梁結(jié)構(gòu)形態(tài)由板狀結(jié)構(gòu)退變成桿狀結(jié)構(gòu)，表明CCl4致肝損傷后的小鼠出現(xiàn)骨質(zhì)疏松癥狀。肝性骨病是臨床常見的疾病，該病常常發(fā)生于原發(fā)性膽汁淤積性肝硬化、慢性活動性肝炎、酒精性肝硬化以及肝移植，引起骨密度減少、骨質(zhì)疏松等骨代謝異常。由實驗結(jié)果可知，用CCl4對小鼠造成肝損傷的實驗動物模型造成了骨質(zhì)疏松，其骨量的丟失可能與肝受損不能合成某些蛋白或是細(xì)胞因子有關(guān)。因為肝損傷不能代償時，對體內(nèi)許多激素、細(xì)胞因子、有毒物質(zhì)等的代謝都有影響，從而影響到骨代謝。肝損傷時，單核細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞過度分泌IL-1、IL-6、TNF-α等細(xì)胞因子，這些因子可共同促進(jìn)破骨細(xì)胞形成，使骨吸收增強，影響骨重建，從而誘導(dǎo)骨丟失［9］。另外，肝功能異常引起維生素D、鈣磷代謝異常，使骨形成減少，影響骨代謝［10］。陶坤明等［11］提出，由膽汁淤積導(dǎo)致的高膽紅素血癥損傷成骨細(xì)胞的增殖能力，亦會導(dǎo)致骨質(zhì)疏松。也有研究報道［12］，骨銅和骨鎂增加，抑制成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的功能，降低骨的轉(zhuǎn)換率而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松。

3.2 秋水仙堿抗肝纖維化作用及對骨密度的影響本實驗用CCl4造成小鼠肝損傷，給予秋水仙堿后雖能升高GSH-Px水平，但未能降低血清AST、ALT活性，從試驗結(jié)果可以看出，本次實驗秋水仙堿用藥后對小鼠肝損傷沒有明顯的保護(hù)作用。關(guān)于秋水仙堿是否有抗肝纖維化作用一直存在著爭議，多數(shù)研究報道秋水仙堿有抗肝纖維化的作用。但秋水仙堿與細(xì)胞中微管蛋白結(jié)合，阻止其聚合，亦可使微管解聚，從而抑制細(xì)胞的增殖、分化和物質(zhì)運輸傳遞，使肝細(xì)胞受損［4］，因此，未能產(chǎn)生明顯的抗肝纖維化作用。本實驗周期為30 d，用CCl4造成小鼠肝損傷，實驗結(jié)果未能看出秋水仙堿具有保肝作用，可能因為CCl4用量不足，不足以顯示細(xì)胞毒作用；亦可能是由于試驗周期短的緣故，本實驗為應(yīng)激反應(yīng)，肝損傷處于前期，未惡化成為肝纖維化，而秋水仙堿未能發(fā)揮明顯的保護(hù)作用。

本試驗中，秋水仙堿治療組的BVF值明顯低于對照組，TMD值比模型組明顯增加，說明秋水仙堿能增加骨量，但是連接性不好，這表明秋水仙堿對肝損傷后的骨量丟失無明顯的保護(hù)作用，可能是因為實驗中秋水仙堿未能降低轉(zhuǎn)氨酶的活性，所以未能體現(xiàn)出其有抗骨丟失的作用。秋水仙堿的LD50較低，過量則會對骨髓和肝臟有損害。另有試驗證明［4］，秋水仙堿通過影響GSH系統(tǒng)和細(xì)胞巰基的穩(wěn)態(tài)，使細(xì)胞對藥物更為敏感。

3.3 洛伐他汀護(hù)肝作用及預(yù)防骨質(zhì)疏松的作用本研究中，洛伐他汀雖能升高GSH-Px活性，但血清AST、ALT活性未發(fā)生改變，從實驗結(jié)果來看，洛伐他汀用藥后對肝損傷沒有明顯影響。他汀類藥物有一定肝臟毒性，可引起肝酶升高，但小劑量洛伐他汀對肝臟是安全的［13］。洛伐他汀治療組的TMD值與模型組相比差異有顯著性，這說明洛伐他汀能夠增加骨量且連接性較好，表明洛伐他汀對肝損傷導(dǎo)致的骨丟失有明顯的保護(hù)作用。洛伐他汀對CCl4致肝損傷后骨量丟失的保護(hù)作用較秋水仙堿好，不僅洛伐他汀治療組BVF、Conn.D.、TMD值更為接近對照組，而且Tb.N、Tb.Th值比秋水仙堿的大，Tb.Sp值比秋水仙堿的小，表明洛伐他汀能使骨小梁數(shù)量增加，骨小梁厚度增大，骨小梁分離度變小，抗骨丟失效果優(yōu)于秋水仙堿。洛伐他汀能夠增加骨密度，可能是因為有促骨形成作用和（或）抑制骨吸收作用。洛伐他汀是新型調(diào)節(jié)血脂及抗動脈粥樣硬化藥，有報道［5］發(fā)現(xiàn)他汀類藥物可以增強骨形態(tài)發(fā)生蛋白的表達(dá)，具有成骨潛能。也有研究［14］發(fā)現(xiàn)，洛伐他汀可以抑制骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化，而促進(jìn)其向成骨細(xì)胞分化。亦有報道［15］，他汀類藥物通過抑制HMG-CoA還原酶活性等相關(guān)途徑，誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化，促進(jìn)成骨因子表達(dá)，促進(jìn)骨質(zhì)吸收來刺激骨形成，和（或）抑制骨吸收來增加骨密度。

綜上所述，本實驗通過小鼠皮下注射CCl4，成功建立肝損傷的動物模型，且骨丟失嚴(yán)重，出現(xiàn)明顯的骨質(zhì)疏松癥狀。對肝損傷后骨代謝的改變，通過Micro CT的結(jié)果分析，秋水仙堿組能增加骨量但是連接性不好，表明秋水仙堿對肝損傷后的骨量丟失無明顯的保護(hù)作用。洛伐他汀BVF、TMD、Conn.D.值等表明洛伐他汀能增加骨量且連接性較好，對肝損傷導(dǎo)致的骨丟失有明顯的保護(hù)作用。而且Tb.N、Tb.Th、Tb.Sp值顯示洛伐他汀能使骨小梁數(shù)量增加，骨小梁厚度增大，骨小梁分離度變小，表明洛伐他汀對于CCl4造成肝損傷后的抗骨丟失的作用強于秋水仙堿。另外，本實驗觀察到洛伐他汀、秋水仙堿用藥后，洛伐他汀及秋水仙堿對小鼠的保肝作用并不明顯，可能由于小鼠皮下注射CCl4藥物劑量不足，或是試驗周期短等的原因所致，有待下一步進(jìn)行探討。

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