孕馬尿中雌酮硫酸鈉單克隆抗體的研制*

阿曼古力·托洪爾別克,馮曉輝,鞏月紅,齊新偉,阿爾孜古麗·吐爾遜,高曉黎

(新疆醫(yī)科大學(xué) 1.藥學(xué)院;2.第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究院,烏魯木齊 830054)

孕馬尿中雌酮硫酸鈉單克隆抗體的研制*

阿曼古力·托洪爾別克1,馮曉輝2,鞏月紅2,齊新偉2,阿爾孜古麗·吐爾遜2,高曉黎1

(新疆醫(yī)科大學(xué) 1.藥學(xué)院;2.第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究院,烏魯木齊 830054)

目的 建立雌酮硫酸鈉(ESS)單克隆抗體的制備方法。方法以ESS為抗原免疫Balb/c小鼠,篩選小鼠免疫方法,并通過方陣滴定法確定間接酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)方法;再以雜交瘤抗體技術(shù)獲得抗ESS單克隆抗體細(xì)胞株。結(jié)果ESS抗原5次以初次免疫200 μg,加強(qiáng)免疫100 μg的免疫劑量多點(diǎn)注射小鼠背部皮下免疫為小鼠最佳免疫方法;確定10 μg·L-1為抗原包被濃度,1∶2 000的一抗血清稀釋倍數(shù);細(xì)胞融合率達(dá)90.2%,ELISA法篩選陽性率為4.4%,并篩選得到兩株特異性較好的細(xì)胞株2C8和8A7。結(jié)論該研究篩選建立了ESS小鼠免疫方法及靈敏度高、特異性好的間接ELISA篩選體系,可用于ESS單克隆抗體的制備及檢測,且建立了ESS單克隆抗體制備方法。

雌酮硫酸鈉;單克隆抗體;測定法,酶聯(lián)免疫吸附;雜交瘤細(xì)胞

雌酮硫酸鈉(sodium estrone sulfate,ESS)是甾體激素類化合物中雌性激素的一種,為孕馬尿中的一種天然結(jié)合雌激素。結(jié)合雌激素在臨床上主要用于雌激素替代療法,通過緩解因雌激素不足引起的臨床癥狀來治療和預(yù)防女性生理或人工絕經(jīng)后出現(xiàn)的更年期綜合征、骨質(zhì)疏松癥[1]、冠心病[2]以及老年性癡呆癥[3]。孕馬尿中富含雌激素[4-6],每升孕馬尿中雌激素的平均含量在70～130 mg,可以充分利用孕馬尿來提取天然雌激素。但是在大規(guī)模采集孕馬尿生產(chǎn)結(jié)合雌激素的產(chǎn)業(yè)化過程中急需一種快速地檢測和有效控制孕馬尿質(zhì)量的方法。ESS作為孕馬尿中主要結(jié)合雌激素,可應(yīng)用純化的ESS作為抗原與牛血清清蛋白偶聯(lián)制備完全抗原免疫Balb/c小鼠后,制備分泌特異性抗ESS的單克隆抗體(monoclonal antibody,McAb)[7],再利用ESS單克隆抗體可以建立一種快速、靈敏、特異的檢測孕馬尿中ESS的方法,用于孕馬尿中結(jié)合雌激素含量的快速檢測,將有重要的應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 動物 6～8周齡雌性Balb/c小鼠,購自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。SPF級;動物許可證號:SCXK (新)2011-0004。

1.2 試藥 雌酮硫酸鈉免疫用完全抗原[雌酮硫酸鈉-牛血清清蛋白(sodium estrone sulfate-bovine serum albumin,ESS-BSA)]:由本課題組合成提供;雌酮硫酸鈉包被抗原[(雌酮硫酸鈉-卵清蛋白(sodium estrone sulfate-ovalbumin,ESS-OVA)]:由本課題組合成提供;牛血清清蛋白:美國BBI公司;卵清蛋白:Sigma分裝;達(dá)爾伯克改良必需基本培養(yǎng)基(Dulbecco's modified minimal essential medium,DMEM)粉劑:美國GIBCO公司;胎牛血清:美國GIBCO公司;L-谷氨酰胺:上海生工生物工程股份有限公司;聚乙二醇1450(polyethlene glycol1450,PEG1450):美國Sigma公司;8-氮鳥嘌呤:美國Sigma公司;酶穩(wěn)定劑:連云港貝爾化學(xué)試劑有限公司;四甲基聯(lián)苯胺(tetramethyl benzidin,TMB ):美國BBI公司;二甲亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO):上海生工生物工程股份有限公司;弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑:美國Sigma公司;辣根過氧化物酶-山羊抗小鼠IgG抗體:美國Sigma公司;次黃嘌呤、氨蝶呤與胸苷培養(yǎng)基(hypoxanthine,aminopterin and thymidine,HAT):美國Sigma公司;次黃嘌呤和胸苷培養(yǎng)基(hypoxanthine and thymidine,HT):美國Sigma公司。

1.3 儀器 AE250型分析天平(梅特勒-托利儀器有限公司);二氧化碳(CO2)恒溫培養(yǎng)箱(Thermo公司);倒置顯微鏡(Thermo公司);X-mark型酶標(biāo)儀(BIORAD公司);KDC-220HR高速冷凍離心機(jī)(科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司);DHP-9160B電熱恒溫干燥箱(上?，槴\實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

1.4 細(xì)胞 骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0細(xì)胞),購自上海細(xì)胞庫。

1.5 小鼠免疫方法 選擇健康的6～8周齡的雌性Balb/c小鼠12只。免疫前尾靜脈采血,作為陰性對照血清。初次免疫分別將100和200 μg的ESS-BSA免疫抗原與等量的弗式完全佐劑混合,完全乳化后,分別采用背部皮下多點(diǎn)注射或腹腔注射(每只0.2 mL);20 d后分別用50和100 μg的ESS-BSA免疫抗原與弗式不完全佐劑混合后同法進(jìn)行第2次免疫。以后每10 d免疫1次,3次免疫第4天血后采血,檢測血清效價。

1.6 間接非競爭酶聯(lián)免疫吸附檢測法(enzyme-linked immuno-sorbent assay,ELISA)的建立及檢測

1.6.1 包被抗原使用濃度的確定 包被抗原ESSOVA使用濃度的確定采用方陣滴定法,用系列濃度(1,5,10,15 μg·mL-1)的包被抗原包被96孔酶標(biāo)板,將抗血清做倍比稀釋(1∶500,1∶1 000,1∶2 000, 1∶4 000,1∶8 000,1∶16 000),采用間接非競爭ELISA法測定包被抗原的最佳使用濃度。檢測結(jié)果以抗體稀釋度對吸光度(A陽性-A陰性)作圖選擇A值差值較高者所對應(yīng)的包被濃度為最佳包被濃度[8-11]。

1.6.2 免疫方法和免疫劑量對免疫效價的影響 采用間接ELISA經(jīng)免疫的12只小鼠多抗血清效價。包被原濃度為10 μg·mL-1?？寡逍r的結(jié)果判定方法用酶聯(lián)免疫檢測儀記波長450 nm讀數(shù)。一抗為3免后抗血清稀釋2 000倍。以空白小鼠血清作為陰性對照,每個樣品設(shè)定兩個平行[8-11]。

1.6.3 免疫次數(shù)對免疫效價的影響 每次免疫后第4天眼眶采血,分別測定兩只小鼠的3免、4免、5免、6免抗血清效價[8-11]。

1.7 細(xì)胞融合及陽性克隆的篩選 用乳化完全的ESS-BSA以所篩選出的免疫方法免疫的Balb/c小鼠6只,用間接ELISA法以ESS-OVA作為包被抗原測定小鼠血清抗體效價,血清達(dá)到1∶10 000以上時,即可進(jìn)行細(xì)胞融合。融合前3 d用未乳化的ESS-BSA對效價最高的Balb/c小鼠進(jìn)行沖擊免疫。

1.7.1 飼養(yǎng)細(xì)胞,SP2/0細(xì)胞,免疫小鼠脾細(xì)胞的準(zhǔn)備 在融合前一天,取Balb/c小鼠腹腔巨噬細(xì)胞,并懸于HAT選擇培養(yǎng)基里,每孔100 μL鋪置飼養(yǎng)細(xì)胞于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,每孔細(xì)胞約105個,置于37℃,含5%CO2培養(yǎng)箱里;SP2/0細(xì)胞復(fù)蘇并培養(yǎng)至對數(shù)生長期,供融合用;融合當(dāng)天處死經(jīng)沖擊免疫的小鼠,制備脾細(xì)胞懸液用于融合。

1.7.2 細(xì)胞融合及培養(yǎng) 分別吸取含脾細(xì)胞1×108個和SP2/0細(xì)胞懸液2×107～3×107個,加入到離心管,補(bǔ)加不完全培養(yǎng)液至40mL,充分混勻。以1 000 r·min-1,離心7 min,棄去上清液。輕輕彈動離心管管底,使沉淀細(xì)胞均勻松散至糊狀。于37℃水浴中,一手均勻地轉(zhuǎn)動離心管,另一手用吸管吸取預(yù)熱至37℃,50%的PEG1450溶液0.8 mL,沿轉(zhuǎn)動的管壁加入,加入PEG1450的時間控制在60 s,靜置30 s。在5 min內(nèi)加入不完全培養(yǎng)液25 mL,使PEG1450稀釋而失去促融合作用。800 r·min-1,離心7 min后棄上清液。加入適量HAT培養(yǎng)液,輕輕吹吸沉淀細(xì)胞,使其懸浮并混勻。將細(xì)胞懸液加入已鋪有飼養(yǎng)細(xì)胞層的96孔培養(yǎng)板中,每孔0.1 mL,并置于37℃,含5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。融合培養(yǎng)24 h后,每隔24 h觀察1次。培養(yǎng)至6 d,先棄掉培養(yǎng)孔1/2的上清液,加入與棄掉的培養(yǎng)上清液等量(約100 μL)的含HAT的完全培養(yǎng)液。7～10 d后用HT培養(yǎng)基換出HAT培養(yǎng)基。待其長至孔底面積1/10以上時吸出上清液供抗體檢測[12-15]。

1.7.3 陽性雜交瘤細(xì)胞的篩選 融合12 d后,酶標(biāo)板包被ESS-OVA,測定有雜交瘤生長孔細(xì)胞上清液。檢測到有陽性雜交瘤生長的孔,再用有限稀釋法將強(qiáng)陽性的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆化,直到找到穩(wěn)定分泌抗ESS抗體的細(xì)胞單克隆[13,16-18]。

2 結(jié)果

2.1 包被抗原使用濃度的確定 由表1可見,隨著抗血清稀釋倍數(shù)的增加,板孔溶液的A值減小。取A值最接近1.0的孔為ELISA最佳包被濃度,根據(jù)測定結(jié)果在包被原10 μg·mL-1,抗血清1∶2 000時的A值接近1.0,故選擇10 μg·mL-1為最佳包被濃度。

2.2 免疫方法及免疫劑量對免疫效價的影響 4種不同處理方式分別為:①200/100 μg免疫劑量腹腔注射(每只100 μg為首次免疫劑量,每只50 μg為加強(qiáng)免疫劑量);②200/100 μg免疫劑量背部皮下多點(diǎn)注射(每只200 μg是首次免疫劑量,每只100 μg是加強(qiáng)免疫劑量);③100/50 μg免疫劑量的腹腔注射(每只100 μg是首次免疫劑量,每只50 μg是加強(qiáng)免疫劑量);④100/ 50 μg免疫劑量的背部皮下多點(diǎn)注射(每只200 μg是首次免疫劑量,每只100 μg是加強(qiáng)免疫劑量)。結(jié)果顯示,背部皮下多點(diǎn)注射比腹腔注射的免疫效價高;免疫劑量的提高也能引起較高的免疫效價。

2.3 免疫次數(shù)對免疫效價的影響 由表2可以看出, 2,3,4次免疫的效價數(shù)據(jù)有增高,5次免疫效價跟4次免疫相當(dāng),6次免疫效價有降低趨勢。故進(jìn)行5次免疫為恰當(dāng)。

2.4 細(xì)胞融合及陽性雜交瘤篩選結(jié)果

2.4.1 各免疫小鼠效價測定 經(jīng)所篩選的ESS-BSA免疫小鼠方法免疫的Balb/c小鼠6只抗血清效價均在12 800以上(表3)。其中4號小鼠效價最低,為12 800;其余5只小鼠效價均51 200以上,說明免疫效果較好,可進(jìn)行細(xì)胞融合。

表1 方陣滴定法確定包被原工作濃度的吸光度Tab.1 Absorbance of working concentration on coating antigen by ELISA chess-board assay

表2 免疫次數(shù)對免疫效價吸光度的影響Tab.2 Effects of absorbance of immunity times on antiserum titer

表3 各免疫小鼠經(jīng)ESS-BSA免疫后抗血清效價Tab.3 Antibody titers in the serum of mice immunized with ESS-BSA

2.4.2 細(xì)胞融合 圖1為復(fù)蘇后處于對數(shù)生長期的SP2/0細(xì)胞。由圖2可看出,失敗的融合實(shí)驗(yàn)所有細(xì)胞遮光性差,而成功的融合實(shí)驗(yàn)?zāi)芸吹酱笥至恋募?xì)胞存在。

圖1 復(fù)蘇后的SP2/0細(xì)胞(×40)Fig.1 SP2/0 cells after recovering from freezing(×40)

2.4.3 雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng) 圖3為細(xì)胞融合后觀察各孔于HAT選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)2,3,4,7 d后的雜交瘤生長情況?？煽闯龀穗s交瘤細(xì)胞,其他細(xì)胞都會逐漸凋亡,雜交瘤細(xì)胞會逐漸長成集落,集落逐漸變大。

2.4.4 采用ELISA法篩選陽性雜交瘤細(xì)胞 表4為融合10 d后,根據(jù)觀察記錄雜交瘤生長情況及陽性雜交瘤檢測結(jié)果所統(tǒng)計(jì)的表格。本實(shí)驗(yàn)用50%的 PEG1450作融合劑,融合效率較高,融合率90.25%,陽性率4.4%。

圖2 融合0 h,成功的融合實(shí)驗(yàn)(A)和失敗的融合實(shí)驗(yàn)(B)對比圖譜(×40)Fig.2 Comparison of successful(A)and failed(B)cell fusion 0 h after fusion(×40)

細(xì)胞融合第10天,對有雜交瘤生長的細(xì)胞上清進(jìn)行ELISA檢測,篩選出雜交瘤生長數(shù)較少(盡量挑單個雜交瘤克隆孔),并且A值1.5以上的34個孔及A值。根據(jù)每孔雜交瘤集落生長情況和ELISA檢測結(jié)果,挑取A值大于1.5且雜交瘤集落數(shù)較少的陽性孔4個(1E5,2C8,5G6,8D3)和單個雜交瘤細(xì)胞生長陽性孔3個(3G9,4F2,8A7)。采用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆。計(jì)數(shù),根據(jù)細(xì)胞數(shù)目確定亞克隆鋪板孔數(shù)目。

A.2 d;B.3 d;C.4 d;D.7 d圖3 融合2,3,4,7 d后的雜交瘤細(xì)胞生長情況(×40)A.2 d;B.3 d;C.4 d;D.7 dFig.3 Growth of hybridoma cells at 2,3,4,7 d after cell fusion(×40)

2.4.5 陽性雜交瘤細(xì)胞克隆化 表5為亞克隆陽性率統(tǒng)計(jì)結(jié)果,最終得到三株克隆株,分別為2C8,5G6, 8A7。再對較穩(wěn)定的2C8,8A7細(xì)胞株進(jìn)行第4次亞克隆,得到了兩株穩(wěn)定分泌ESS單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。

表4 細(xì)胞融合率及陽性率結(jié)果Tab.4 Results of the fusion rates and positive rates

表5 亞克隆陽性孔率結(jié)果Tab.5 Results of positive rates after cloning %

3 討論

單克隆抗體制備技術(shù),試驗(yàn)周期較長,技術(shù)繁瑣,需要科研工作的連續(xù)性,因此得到一能夠穩(wěn)定分泌高效價、高特異性的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株是較復(fù)雜艱巨的工程。免疫程序、免疫途徑、免疫劑量、免疫周期等對機(jī)體免疫應(yīng)答及其抗體效價和親和性有重要的影響[19]。免疫效價的考察需要建立穩(wěn)定有效的ELISA法等檢測方法。在研制ESS單抗的過程中發(fā)現(xiàn)免疫原的制備,免疫原與佐劑乳化程度對免疫效果及后續(xù)的雜交瘤制備都起著重要的作用。本課題所采用的將一注射器(規(guī)格5 mL)用長約3 cm的塑料細(xì)管(一次性輸液管剪一截)與另一相同規(guī)格的注射器連接,反復(fù)地均勻用力推拉兩個注射器約1 h的方法為操作簡便,可有效節(jié)省抗原和佐劑,并可將抗原與佐劑乳化完全。此外,融合操作技術(shù)對融合效率的影響大。應(yīng)把握好PEG1450的滴加速度和用基礎(chǔ)培養(yǎng)基終止融合實(shí)驗(yàn)的速度,每一步需嚴(yán)格計(jì)時。雜交瘤細(xì)胞選擇性培養(yǎng)時,應(yīng)避免細(xì)胞污染,定期查培養(yǎng)箱的CO2濃度及培養(yǎng)箱濕度。細(xì)胞上清液變黃時,應(yīng)及時換培養(yǎng)液。培養(yǎng)板應(yīng)逐個進(jìn)行換液。由于雜交瘤生長至一定面積后需進(jìn)行雜交瘤陽性篩選,因此在雜交瘤篩選實(shí)驗(yàn)前應(yīng)建立好穩(wěn)定的檢測方法。應(yīng)進(jìn)行多次陽篩,以避免假陽性及漏篩等情況。

甾體激素類化合物中的一種雌性激素,其作為孕馬尿中結(jié)合雌激素主要成分,可從孕馬尿中提取ESS供其補(bǔ)充制劑的研發(fā)。作為雌激素原料的孕馬尿收集是該項(xiàng)研發(fā)首要且關(guān)鍵的步驟,而合格孕馬尿的采集則需要一檢測手段。孕馬尿雌激素單克隆抗體可運(yùn)用膠體金層析技術(shù)等免疫檢測手段開發(fā)成快速,操作簡便,低成本,可應(yīng)用于野外操作的雌激素檢測方法。雌激素單克隆抗體的研發(fā)有廣闊的應(yīng)用前景。

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DOI 10.3870/yydb.2014.08.004

Preparation of Monoclonal Antibody of Sodium Estrone Sulfate from Pregnant Mare’s Urine

AMANGULI·Tuohongerbieke1,FENG Xiao-hui2,GONG Yue-hong2,QI Xin-wei2,AERZIGULI·Tuerxun2, GAO Xiao-li1
(1.School of Pharmacy;2.the First Hospital Affiliated with Xinjiang Medical Univesity,Urimqi 830054,China)

Objective To establish a method to prepare anti-sodium estrone sulfate monoclonal antibody(ESS-Mab).MethodsBalb/c mice were immunized by ESS.Immune methods were screened.The blood serum potencies were measured by indirect ELISA and the best consistence of antigen and the first antibody were confirmed with method of titration.Cell fusion was carried by using PEG method and McAb hybridoma was screened with the indirect ELISA.ResultsThe best immunization method of mice was subcutaneously multi-point injection in mouse back with the dose of 200/100 μg ESS antigen five times.The fusion rate was 90.2%.Hybridoma positive rate of ELISA screening was 4.4%.Finally two cell lines 2C8 and 8A7 with good specificity and sensitivity were obtained.ConclusionThe best immunization way is selected and indirect ELISA is set up effectively and reliably for screening and presenting ESS McAb.the hybridoma technique is able to prepare monoclonal antibody of anti-ESS successfully.

Sodium estrone sulfate;Monoclonal antibody;Assay,enzyme-linked immuno-sorbent;Hybridoma

R977.1;R965

A

1004-0781(2014)08-0991-06

2013-12-09

2014-03-06

*新疆維吾爾自治區(qū)科技廳高技術(shù)發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(200910108);新疆維吾爾自治區(qū)重大科技專項(xiàng)課題(201130101-4)

阿曼古力·托洪爾別克(1986-),女,新疆阿勒泰人,碩士,研究方向:新疆地產(chǎn)資源新藥研究與開發(fā)。電話: (0)13659999801,E-mail:amangul2008@126.com。

高曉黎(1962-),女,河南新野人,教授,博士生導(dǎo)師,博士,研究方向:新疆地產(chǎn)資源新藥研究與開發(fā)。電話: 0991-4312411,E-mail:gxli@tefeng.com。