商陸皂苷甲急性毒性與利尿作用研究*

崔楠楠,孟祥龍,馬俊楠,李坤,張朔生

(1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,武漢 430065;2.山西中醫(yī)學(xué)院中藥學(xué)院,太原 030024)

·藥物研究·

商陸皂苷甲急性毒性與利尿作用研究*

崔楠楠1,2,孟祥龍1,2,馬俊楠2,李坤2,張朔生2

(1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,武漢 430065;2.山西中醫(yī)學(xué)院中藥學(xué)院,太原 030024)

目的 了解商陸皂苷甲對小鼠急性毒性特點(diǎn),觀察其對大鼠的利尿作用。方法向小鼠腹腔注射不同濃度的商陸皂苷甲,觀察給藥后小鼠毒性反應(yīng),測定急性毒性的相關(guān)參數(shù)。向水負(fù)荷狀態(tài)大鼠腹腔注射不同劑量商陸皂苷甲,測定給藥后連續(xù)6 h總尿量。結(jié)果Bliss法計(jì)算商陸皂苷甲LD50為26.19 mg·kg-1,95%可信區(qū)間為23.11～29.85 mg·kg-1。隨著商陸皂苷甲濃度的增加,小鼠的毒性反應(yīng)表現(xiàn)越明顯,且小鼠的死亡數(shù)隨之增加,空白對照組小鼠無異常反應(yīng)。高劑量組大鼠尿量與陰性對照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而中、低劑量組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論商陸皂苷甲單次腹腔注射對小鼠有一定的毒性且商陸皂苷甲高劑量對大鼠有利尿作用。

商陸皂苷甲;毒性,急性;利尿作用

商陸為商陸科植物商陸Phytolacca acinosaRoxb.或垂序商陸P.americanaL.的干燥根。該藥味苦性寒,有毒,歸肺、脾、腎、大腸經(jīng),具有逐水消腫、通利二便、解毒散結(jié)等功能[1]。商陸皂苷甲(esculentoside A, EsA)是從商陸中提取的一種三萜類皂苷,是商陸中含量最高的皂苷[2]。關(guān)于商陸主要毒性成分的研究,目前尚無統(tǒng)一結(jié)論,主要有以下幾個(gè)觀點(diǎn):有報(bào)道稱EsA和組胺是商陸中的主要毒性成分[3],EsA又被稱為商陸毒素;孫紅祥等[4]通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)商陸中毒性成分可能不限于已知的商陸毒素和組胺,認(rèn)為其毒性成分尚待研究;馬杰等[5]根據(jù)商陸醋炙后EsA含量大幅增加的結(jié)果,進(jìn)一步推測EsA不能等同于商陸毒素,它并不是一種引起商陸毒性反應(yīng)的主要成分。同時(shí)EsA作為商陸皂苷的主要成分,與商陸皂苷活性相似,具有顯著的抗炎、免疫抑制、誘生γ-干擾素、增強(qiáng)白細(xì)胞吞噬功能、提高DNA合成率等作用[6],是商陸扶正固本作用的有效成分之一[7]。但是對商陸逐水消腫、通利二便作用的研究,目前僅限于對商陸總提物(水煎劑、醇浸膏)或活性部位的簡單利尿?qū)嶒?yàn)研究,對于其主要成分EsA是否具有利尿作用的研究筆者尚未見文獻(xiàn)報(bào)道?；诖?很有必要對EsA的毒性及利尿作用進(jìn)行研究,這將有助于了解商陸的毒性,探明商陸利尿作用的物質(zhì)基礎(chǔ),為EsA“量-效-毒”關(guān)系的建立以及商陸臨床安全有效使用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動物 昆明種健康小鼠,SPF級,雌雄各半,體質(zhì)量18～22 g,由山西省腫瘤研究所提供,動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(晉)2012-0001;SD健康雄性大鼠,SPF級,體質(zhì)量180～220 g,由中國食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動物資源中心提供,動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(京) 2009-0017。

1.2 受試藥物 EsA粉劑(成都曼思特生物科技有限公司,純度:90%,批號:MUST-12091702);氫氯噻嗪片(山西利豐華瑞制藥有限責(zé)任公司,批號:20120202); 0.9%氯化鈉溶液(石家莊四藥有限公司,批號: 130311710);EsA粉劑及氫氯噻嗪均用0.9%氯化鈉注射液配制成各給藥濃度。

1.3 儀器 美國奧豪斯(OHAUS)ARB120電子天平;德國LEICA EG 1150H自動石蠟包埋機(jī);德國LEICA RM 2235半自動輪轉(zhuǎn)切片機(jī);日本OLYMPUS BX51型顯微鏡。

1.4 小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn) 正式試驗(yàn)前以少量小鼠進(jìn)行EsA毒性的預(yù)試驗(yàn),得到EsA的LD0及LD100。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,將小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為7組,每組10只,雌雄各半。除空白對照組給予等量的0.9%氯化鈉溶液外,其余6組給予不同濃度受試藥物,組間比為1∶0.80,給藥劑量分別為42.00,33.60,26.88,21.50,17.20, 13.76 mg·kg-1。試驗(yàn)前禁食不禁水14 h,給藥體積為0.2 mL·(10 g)-1,腹腔注射1次。動物給藥后即刻進(jìn)食,給藥當(dāng)天連續(xù)多次觀察,尤其是給藥后4 h密切觀察動物的毒性反應(yīng)(一般表現(xiàn)、呼吸、活動及有無驚厥),中毒癥狀發(fā)生的時(shí)間、持續(xù)時(shí)間,恢復(fù)情況,逐日記錄動物死亡時(shí)間,連續(xù)觀察14 d,并在給藥第1天,第3天,第7天,第14天稱量小鼠體質(zhì)量。對死亡動物進(jìn)行大體解剖,對EsA最高劑量組死亡動物取腦、肝、腎、胃、大腸、小腸等主要臟器進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。觀察周期結(jié)束后,根據(jù)各組死亡情況,采用Bliss法計(jì)算LD50。

1.5 對水負(fù)荷狀態(tài)下大鼠的利尿作用 實(shí)驗(yàn)前24 h,大鼠禁食不禁水,按25 mL·kg-1劑量灌胃純化水,收集2 h內(nèi)尿量,選取2 h內(nèi)排尿量達(dá)到灌胃量的40%以上的大鼠作為利尿?qū)嶒?yàn)對象。將通過篩選的大鼠50只,隨機(jī)分為5組,分別為:陰性對照組、氫氯噻嗪對照組(氫氯噻嗪0.4 mg·kg-1[8])、EsA高劑量組(5.2 mg·kg-1)、EsA中劑量組(2.6 mg·kg-1)、EsA低劑量組(1.3 mg·kg-1),每組10只。將篩選出的大鼠按25 mL·kg-1劑量灌胃純化水,手輕壓大鼠下腹部使其排盡余尿。30 min后,陰性對照組腹腔注射0. 9%氯化鈉溶液,其他4組腹腔注射各受試藥物,給藥體積均為20 mL·kg-1。立即放入代謝籠內(nèi)(每籠1只)。每2 h收集尿液1次,連續(xù)收集6 h。記錄每2 h動物的尿量,計(jì)算6 h總排尿量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用PEMS 3.0對半數(shù)致死量數(shù)據(jù)進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì),計(jì)算LD50(Bliss法)。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用SPSS17.0版統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 一般癥狀觀察 空白對照組動物給藥后無明顯異常變化,最高劑量組動物死亡多發(fā)生在給藥后1～4 h內(nèi),次高劑量組動物死亡多發(fā)生在給藥后3～8 h內(nèi),其余各組死亡多發(fā)生在給藥后5～12 h內(nèi)。劑量較高組的動物在給藥后立即表現(xiàn)出狂躁不安,互相撕咬,隨即腹部貼地式搖擺前進(jìn),行動遲緩,最后行為轉(zhuǎn)為怠動,低劑量組動物給藥后不出現(xiàn)狂躁等現(xiàn)象,僅表現(xiàn)為怠動。所有組動物死亡時(shí)均呈趴狀,口鼻及尾巴青紫。給藥后第3天動物行為活動基本恢復(fù)正常。

2.1.2 藥物對體質(zhì)量的影響 由于42.00, 33.60 mg·kg-1劑量組小鼠給藥第1天時(shí),已全部死亡和僅存活1只,無法考察這一劑量對體質(zhì)量的影響,因此僅考察其余劑量組藥物對體質(zhì)量的影響。給藥第3天,除EsA 26.88 mg·kg-1組的小鼠體質(zhì)量略有下降之外,其余組小鼠體質(zhì)量均升高,但升高的速率有一定差別,升高速率從大到小依次為:空白對照組＞EsA 13.76 mg·kg-1組＞EsA 17.20 mg·kg-1組＞EsA 21.50 mg·kg-1組＞EsA 26.88 mg·kg-1組。給藥第14天,各組小鼠體質(zhì)量均有所增長。各組小鼠在觀察期結(jié)束時(shí)平均體質(zhì)量從大到小依次為:空白對照組＞EsA 13.76 mg·kg-組＞EsA 17.20 mg·kg-1組＞EsA 21.50 mg·kg-1組＞EsA 26.88 mg·kg-1組。體質(zhì)量增加的具體情況見圖1。

2.1.3 靶器官鑒定 對EsA 42.00 mg·kg-1組死亡的動物取腦、肝、腎、胃、大腸、小腸等主要臟器進(jìn)行組織病理學(xué)檢查,見圖2。由圖2可見,EsA造成小鼠腎臟腎髓質(zhì)處小管上皮細(xì)胞核濃縮、瘀血性出血(圖2A, 2B);對肝臟的影響表現(xiàn)為肝竇擴(kuò)張、瘀血(圖2C, 2D),肝細(xì)胞腫脹、輕度水樣變性(圖2E)以及彌散性肝細(xì)胞核損傷(圖2F)。其余臟器未見明顯病理變化。圖2G,2H分別為空白對照組小鼠的正常腎臟和肝臟顯微圖。

2.1.4 LD50結(jié)果 給藥后觀察14 d,記錄小鼠死亡情況,結(jié)果見表1。結(jié)果為:LD50=26.19 mg·kg-1,95%可信區(qū)間為23.11～29.85 mg·kg-1。

1.給藥第3天;2.給藥第5天;3.給藥第7天;4.給藥第14天圖1 不同給藥濃度對小鼠體質(zhì)量增加量的影響1.3 d after treatment;2.5 d after treatment;3.7 d after treatment;4.14 d after treatmentFig.1 Effect of different dose on the increase of body weight of mice

2.2 對水負(fù)荷狀態(tài)下大鼠的利尿作用 測量給藥后大鼠連續(xù)6 h的尿量,比較各組總尿量:EsA高劑量組與陰性對照組及EsA中、低劑量組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,與氫氯噻嗪對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;EsA中、低劑量組均與陰性對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,且EsA中、低劑量組之間也差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。比較不同時(shí)間段的尿量發(fā)現(xiàn):EsA高劑量組在0～2 h及～4 h的尿量均與陰性對照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,氫氯噻嗪對照組僅在0～2 h與其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,EsA中、低劑量組在3個(gè)時(shí)段與其均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

3 討論

3.1 小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn) EsA小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)臟器病理切片示,EsA主要對肝、腎產(chǎn)生不同程度損傷。此結(jié)論與張茜等[9]研究認(rèn)為大劑量EsA可能對肝腎具有一定毒性作用的觀點(diǎn)相吻合。

從EsA 42.0 mg·kg-1組小鼠給藥后表現(xiàn)出的狂躁、互相撕咬等行為推測EsA可能對小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)有影響。有報(bào)道稱商陸臨床中毒癥狀主要表現(xiàn)為胃腸道反應(yīng),如惡心嘔吐、腹痛腹瀉,嚴(yán)重者可出現(xiàn)胃腸道黏膜糜爛、潰瘍及出血等[10]。EsA作為商陸主要成分之一,小鼠在給予EsA后體質(zhì)量較空白對照組增長緩慢,推測EsA可能會影響胃腸功能。從各組小鼠在觀察期結(jié)束時(shí)平均體質(zhì)量的排序可見,EsA劑量越大,對小鼠體質(zhì)量的抑制作用越大,呈現(xiàn)一定量效關(guān)系。

3.2 對水負(fù)荷狀態(tài)下大鼠的利尿?qū)嶒?yàn) 本項(xiàng)利尿?qū)嶒?yàn)中EsA高劑量組的劑量定為LD50的1/5,中劑量組為LD50的1/10,低劑量組為LD50的1/20。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明EsA高劑量有明顯的利尿作用,且利尿作用與中效利尿藥氫氯噻嗪作用相當(dāng);中、低劑量無利尿作用。同時(shí)通過比較不同時(shí)段的尿量,得出高劑量組發(fā)揮藥效主要在給藥后4 h內(nèi),而陽性對照藥氫氯噻嗪主要在給藥后2 h內(nèi)發(fā)揮藥效。說明高劑量EsA較氫氯噻嗪利尿作用時(shí)間更長。

EsA 42.00 mg·kg-1劑量組:A.腎(×100),B.腎(×200),C.肝(×100),D.肝(×200),E.肝(×400),F.肝(×400);空白對照組: G.正常腎(×100),H.正常肝(×100)圖2 EsA 42.00 mg·kg-1組和空白對照組小鼠腎臟、肝臟組織病理損傷HE染色Group 42.00 mg·kg-1EsA,A.kidney(×100),B.kidney(×200),C.liver(×100),D.liver(×200),E.liver(×400),F.liver(×400); blank control group:G.normal kidney(×100),H.normal liver(×100)Fig.2 HE staining on pathological injure in group 42.00 mg·kg-1EsA and blank control group of kidney and liver of mice

表1 7組小鼠死亡數(shù)量及死亡率比較Tab.1 Comparison of deaths and mortality in seven groups of mice

《中華人民共和國藥典》2010年版中規(guī)定成人一天服用的商陸用量為3～9 g[1]。根據(jù)王鐵軍等[11]測定的不同地區(qū)的商品商陸藥材中EsA的含量在0.32%～1.11%,計(jì)算得出成人一天服用的商陸中含有EsA量為9.6～99.9 mg,成人按體質(zhì)量70 kg計(jì)算,一天服用的商陸中含有EsA的量0.137～1.427 mg·kg-1。本實(shí)驗(yàn)中有明顯利尿作用的EsA給藥量為5.2 mg·kg-1,按體表面積折算大鼠與人的等效劑量,這一劑量在臨床有效劑量范圍之內(nèi)。這就表明,EsA可能是商陸中起利尿作用的主要成分之一。

表2 5組大鼠水負(fù)荷狀態(tài)下尿量比較Tab.2 Comparison of urine volume with water load in five groups of rats ±s

表2 5組大鼠水負(fù)荷狀態(tài)下尿量比較Tab.2 Comparison of urine volume with water load in five groups of rats ±s

與陰性對照組比較,*1P＜0.05Compared with negative control group,*1P＜0.05

組別劑量/ (mg·kg-1)尿量/[mL·(100 g)-1] 0～2 h～4 h～6 h0～6 h陰性對照組…0.774±0.390.449±0.310.349±0.161.569±0.67氫氯噻嗪對照組8.01.867±0.39*10.548±0.230.452±0.282.868±0.67*1EsA高劑量組5.21.190±0.17*10.975±0.31*10.549±0.502.715±0.62*1中劑量組2.60.522±0.270.514±0.330.485±0.261.522±0.65低劑量組1.30.498±0.210.338±0.140.365±0.161.202±0.29 F 37.9647.8970.70014.556

綜上所述,本研究提示EsA可能是商陸中起利尿作用的主要成分之一,故《中華人民共和國藥典》2010年版通過測定藥材中EsA的含量進(jìn)行商陸質(zhì)量控制,具有一定的科學(xué)性。比較EsA對大鼠利尿作用的有效劑量(5.2 mg·kg-1)與其小鼠LD50(26.19 mg·kg-1),同時(shí)考慮大、小鼠的種屬差異,EsA利尿作用的有效劑量大于其LD50的1/5。EsA能否作為臨床安全使用的利尿藥尚待進(jìn)一步研究。

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DOI 10.3870/yydb.2014.08.001

Acute Toxicity Test and Diuresis Effect of Esculentoside A

CUI Nan-nan1,2,MENG Xiang-long1,2,MA Jun-nan2,LI Kun2,ZHANG Shuo-sheng2
(1.College of Pharmacy, Hubei University of Chinese Medicine,Wuhan 430065,China;2.School of Traditional Chinese Medicine,Shanxi University of Traditional Chinese Medicine,Taiyuan 030024,China)

Objective To understand the intensity and characteristics of acute toxicity of esculentoside A on mice and measure relevant parameters and observe its diuresis effect on rat.MethodsAfter intraperitoneal injection of different concentrations of esculentoside A to mice,toxic reactions were observed.Rats with water load were intraperitoneally injected with different doses of esculentoside A.Total urine volume in six consecutive hours after the injection was determined.ResultsThe LD50of esculentoside A calculated by Bliss method was 26.19 mg·kg-1,and the 95%confidence interval was 23.11-29.85 mg·kg-1.The mortality and acute toxicity of esculentoside A appeared to be dose-dependent while the blank control group had no abnormal reaction.The urine volume was significantly different between high dose group and the negative control group.No significant difference in urine volume was found between middle and the negative control group,and between low dose group and the negative control group.ConclusionEsculentoside A is poisonous to mice when single dose was intraperitoneally injected, and high dose of esculentoside A has diuresis effect on rat.

Esculentoside A;Toxicity,acute;Diuresis effect

R286;R285.5

A

1004-0781(2014)08-0981-04

2013-07-26

2014-02-13

*國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81173555)

崔楠楠(1987-),女,山西運(yùn)城人,在讀碩士,研究方向:中藥炮制現(xiàn)代研究。電話:(0)18635172585,E-mail: zhe2nan@126.com。

張朔生(1965-),男,山西朔州人,教授,碩士生導(dǎo)師,碩士,研究方向:中藥炮制現(xiàn)代研究。電話:0351-2272652, E-mail:zhangshuosheng@aliyun.com。