大豆查爾酮還原酶基因CHR1的功能研究

吳楠,王丕武,李丹,代力強(qiáng),鄭成忠,盧實(shí),才源,張卓,曲靜,夏海豐,2

1. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,長春 130118;

2. 通化市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院,梅河口 135000

大豆苷元是大豆異黃酮(Soybean Isoflavone)的主要成分之一[1],在大豆(Glycine max)苗期胚軸中含量最高,可達(dá)到異黃酮含量的 30%; 同時也是大豆中重要的生理活性物質(zhì),可以提高大豆對致病菌類微生物的抗性[2,3]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明,大豆苷元同樣可以調(diào)節(jié)人體的多項(xiàng)生理功能,具有預(yù)防和治療心腦血管疾病、預(yù)防乳腺癌和激素依賴性腫瘤[4]以及骨質(zhì)疏松[5]和雌激素樣[6]等。因此,利用分子生物學(xué)手段研究大豆苷元合成及調(diào)控具有重要的意義。

查爾酮還原酶 (Chalcone reductase,CHR)是大豆苷元合成的關(guān)鍵酶之一。CHR能與查爾酮合成酶(Chalcone synthesis,CHS)聯(lián)合作用催化合成異甘草素[7],其是合成大豆苷元必要的前體化合物。劉江等[8]從栽培大豆中克隆得到第14號染色體上一個編碼大豆查爾酮還原酶的 GmCHR,并通過與豆科中其他查爾酮還原酶基因相比可知,CHR在豆科植物基因組中以多基因形式共同存在,并能夠聯(lián)合調(diào)節(jié)合成異甘草素,因此,對不同類型的 CHR進(jìn)行分析有助于明確其在催化過程中的效率及相互調(diào)控關(guān)系。

RNA干擾(RNA interference,RNAi)是指利用小的雙鏈RNA高效特異阻斷特定基因的表達(dá),使其在轉(zhuǎn)錄后水平上促使mRNA降解,達(dá)到基因沉默的效果,進(jìn)而確定該基因的功能。本文構(gòu)建了大豆查爾酮還原酶基因1(CHR1)的RNAi植物表達(dá)載體[9]并轉(zhuǎn)化大豆,通過對轉(zhuǎn)基因大豆中 CHR1的表達(dá)量及其催化產(chǎn)物的檢測,分析 CHR1對大豆苷元合成的影響,初步驗(yàn)證 CHR1的催化功能與效率,為利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高大豆苷元含量、改良大豆的抗病性[10]提供了理論依據(jù),并為 CHR1在基因工程中的高效利用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

大豆種子吉農(nóng)28、大腸桿菌DH5α菌株、農(nóng)桿菌EHA105菌株、克隆重組載體pMD18-T-CHR1、表達(dá)載體pCPB、克隆載體 pMD18-T均由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)植物生物技術(shù)中心提供與保存。

1.2 方法

1.2.1 目的片段的獲得

以已知CHR1(GenBank登錄號：X55730.1)的重組克隆載體pMD18-T-CHR1質(zhì)粒為模板,利用特異性引物CZS/CZAS和CFS/CFAS(序列見表1,由北京三博遠(yuǎn)志生物公司合成)擴(kuò)增得到目的片段,測序后在NCBI上進(jìn)行序列比對,該基因含有兩個內(nèi)含子。本研究選擇該基因帶有內(nèi)含子的序列擴(kuò)增正、反義片段,大小404bp,其中正反義各323bp,內(nèi)含子81bp,用于形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)。

PCR擴(kuò)增體系為 25μL,包括：2.5μL MgCl2,2.5μL Buffer,1μL 特異性引物 CZS/CZAS 或CFS/CFAS(表 1),1μL 模板,0.5μL dNTP,0.2μL Taq聚合酶(PCR擴(kuò)增試劑為TaKaRa公司產(chǎn)品),無菌水補(bǔ)充至25μL。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性10 min; 94℃變性45 s,51℃復(fù)性45 s,72℃延伸45 s,35個循環(huán);最后再72℃延伸10 min,4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳,回收(DNA凝膠回收試劑盒為TaKaRa公司產(chǎn)品)后與 pMD18-T載體連接,獲得重組克隆載體pMD18-T-CHR1并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞 DH5α,挑取單克隆菌落,提取質(zhì)粒后由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)公司進(jìn)行測序。

1.2.2 RNA干擾表達(dá)載體的構(gòu)建

PCR擴(kuò)增帶有內(nèi)含子的正反義片段,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) 1%的瓊脂糖凝膠電泳,回收純化目的片段并將正義片段與基礎(chǔ)表達(dá)載體 pCPB同時用 XbaI和BamHⅠ(限制性內(nèi)切酶為TaKaRa公司產(chǎn)品)進(jìn)行雙酶切,回收載體和正義片段,按體積比為 1:3進(jìn)行連接,連接體系如下：12μL目的片段,4μL載體,1μL T4 連接酶,2μL T4 Buffer,1μL ddH2O。22℃反應(yīng)過夜。此時得到的載體命名為pCPB-Z。

表1 引物信息

圖1 RNA干擾載體結(jié)構(gòu)圖

采用同樣的方法,用 SacⅠ和 BamHⅠ雙酶切,將反義片段連接入 pCPB-Z載體中,得到以抗除草劑 Bar基因?yàn)楹Y選標(biāo)記的 RNA干擾表達(dá)載體pCPB-CHR1-RNAi。對該載體進(jìn)行PCR檢測及雙酶切鑒定。載體構(gòu)建圖如圖1所示。

1.2.3 大豆的遺傳轉(zhuǎn)化

本文采用農(nóng)桿菌侵染大豆子葉節(jié)方法[11,12]將構(gòu)建好的pCPB-CHR1-RNAi的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入受體大豆品種“吉農(nóng)28”中,并獲得轉(zhuǎn)化植株。

1.2.4 轉(zhuǎn)基因植株的后代檢測

1.2.4.1 PCR檢測 按抗除草劑基因Bar(552bp)、啟動子35S(500bp)的基因序列分別用primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物BarS/BarAS和35S/35AS(表1)。取幼嫩轉(zhuǎn)化大豆植株葉片,用 CTAB法[13,14]提取基因組并進(jìn)行PCR檢測,并以未轉(zhuǎn)化的受體大豆葉片基因組作為陰性對照。Bar基因的PCR擴(kuò)增體系為25μL,擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5 min; 94℃變性40 s,60℃復(fù)性40 s,72℃延伸40 s,30個循環(huán); 最后72℃再延伸8 min,4℃保存。35S基因的PCR擴(kuò)增體系為25μL,擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5 min; 94℃變性30 s,55℃復(fù)性30 s,72℃延伸30 s,40個循環(huán); 最后72℃再延伸8 min,4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后,將目的片段回收并測序。

1.2.4.2 轉(zhuǎn)基因植株的Southern blotting檢測 提取 PCR檢測為陽性的 T1代轉(zhuǎn)化植株葉片的基因組DNA,用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ 酶切,以純化的 35S作為探針,使用 DIG DNA Labeling and Detection Kit I試劑盒(羅氏公司產(chǎn)品),按照說明書標(biāo)記探針,制備樣品、轉(zhuǎn)膜、雜交、洗膜、染色顯影等程序,進(jìn)行Southern blotting檢測。

1.2.4.3 轉(zhuǎn)基因植株的熒光定量PCR檢測 提取經(jīng) Southern blotting檢測出現(xiàn)陽性信號的轉(zhuǎn)基因植株的葉片RNA,反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,5倍稀釋后待用。設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物QCHR1和QACHR1(表1)。選擇大豆肌動蛋白 β-actin基因(GenBank登錄號:NM_001252731.2)為內(nèi)參基因,設(shè)計(jì)定量 PCR引物QFACT和QRACT(表1)。利用Mx 3000P熒光定量PCR儀(吉泰生物科技公司產(chǎn)品)對大豆葉片組織總RNA進(jìn)行分析[15,16]。按照SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒說明操作(TaKaRa公司產(chǎn)品),PCR擴(kuò)增體系為 25μL：2×SYBR Premix Ex Taq 聚合酶 12.5μL,QCHR1 引物 1μL,QACHR2 引物 1μL,模板 2μL,無菌水補(bǔ)至25μL。兩步法PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性3 min; 95℃變性10 s,60℃反應(yīng)35 s,40個循環(huán)。根據(jù)公式計(jì)算:

分析目的基因的相對表達(dá)量。

1.2.5 CHR1基因表達(dá)產(chǎn)物異甘草素的測定

利用高效液相(HPLC)對異甘草素的含量進(jìn)行測定,高溫干燥處理轉(zhuǎn)化的大豆葉片組織并選擇同品種未轉(zhuǎn)化的大豆植株葉片作為對照,各稱取干重0.5 g,用液氮研磨至細(xì)小粉末狀并溶于的甲醇溶液中(4:1,體積比),超聲波處理進(jìn)一步破壞葉片組織(40℃,50 min,功率顯示70%)之后浸泡過夜。過濾除去不溶的雜質(zhì),蒸發(fā)脫去萃取溶液中的溶劑,再加入乙醋酸鹽緩沖液充分溶解提取物,使溶液 pH值穩(wěn)定在5,同時加入適量的纖維素酶,37℃條件下反應(yīng)過夜,確保除去所有修飾異甘草素糖苷的糖基。然后采用乙酸乙酯進(jìn)行萃取酶水解液中的配基異甘草素,再將乙酸乙酯萃取。樣品溶解于甲醇溶液中,用0.22μm有機(jī)濾膜抽濾,上樣量為20μL,進(jìn)行高效液相色譜定量分析[19,20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆查爾酮還原酶基因CHR1正反義片段的克隆和RNA干擾表達(dá)載體構(gòu)建

以本實(shí)驗(yàn)室已克隆的pMD18-T-CHR1質(zhì)粒為模板,利用其特異性引物 CZS/CZAS和 CFS/CFAS(表1)分別擴(kuò)增帶有內(nèi)含子的正反義片段,擴(kuò)增片段長度為404bp,其中正反義片段各323bp,內(nèi)含子81bp; 將擴(kuò)增片段重組到pCPB,構(gòu)建成干擾表達(dá)載體pCPB-CHR1-RNAi。XbaⅠ/BamHⅠ雙酶切鑒定得到404bp帶有內(nèi)含子的正義片段,BamHⅠ/SacⅠ雙酶切得到404bp帶有內(nèi)含子的反義片段。

2.2 T1代轉(zhuǎn)基因植株的獲得及檢測

2.2.1 T1代植株的PCR檢測

將pCPB-CHR1-RNAi干擾載體轉(zhuǎn)入受體大豆品種“吉農(nóng) 28”中,經(jīng) PCR檢測得到 4株 T0代陽性植株。收獲 T0代種子37粒,室內(nèi)種植后得到T1代植株,提取基因組DNA,利用抗除草劑 Bar基因和35S基因的特異性引物進(jìn)行 PCR檢測,以重組表達(dá)載體 pCPB-CHR1-RNAi的質(zhì)粒 DNA為陽性對照,未轉(zhuǎn)化的受體大豆植株作為陰性對照,檢測結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知,從T1代轉(zhuǎn)基因植株中擴(kuò)增出的條帶與目標(biāo)基因大小一致(552bp,500bp),初步證明外源基因已整合進(jìn)大豆基因組中,PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示T1代共獲得13株轉(zhuǎn)基因陽性植株。

2.2.2 T1代陽性植株的Southern blotting檢測

圖2 T1代陽性植株抗除草劑Bar及35S的檢測

分別提取PCR陽性植株的基因組DNA,用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ酶切,以35S為探針,進(jìn)行Southern blotting檢測。如圖 3所示,未轉(zhuǎn)化植株沒有出現(xiàn)雜交信號,檢測的轉(zhuǎn)基因植株中有 3株出現(xiàn)明顯的雜交信號,共獲得7株經(jīng)Southern blotting檢測為陽性的植株。表明功能元件以單拷貝的形式整合到受體大豆基因組中,但整合位點(diǎn)不相同。

圖3 T1代轉(zhuǎn)基因植株Southern雜交檢測

2.2.3 T1代轉(zhuǎn)基因植株熒光定量PCR檢測

以SYBR Green I為染料,經(jīng)Southern blotting檢測為陽性的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行qRT-PCR檢測。如圖4所示,轉(zhuǎn)基因大豆植株中CHR1基因mRNA的相對表達(dá)量與受體植株相比有明顯的差異,且不同轉(zhuǎn)化植株間CHR1基因的表達(dá)變化量差異也較大。2～8號轉(zhuǎn)基因植株的干擾效率分別為：97.88%、98.09%、78.02%、98.33%、65.78%、56.98%、91.76%,其中5號植株干擾效率最高。

2.3 T1代轉(zhuǎn)基因植株異甘草素含量的測定

對 CHR1調(diào)控的代謝產(chǎn)物異甘草素的含量進(jìn)行檢測,通過 HPLC檢測 5號轉(zhuǎn)化大豆植株異甘草素的含量。如圖 5所示,轉(zhuǎn)化植株葉片組織中異甘草素的含量為 0.979μmol/g,未轉(zhuǎn)化植株異甘草素的含量為1.597μmol/g,其含量降低了38.7%。

圖4 CHR1基因相對表達(dá)量

2.4 CHR1基因編碼蛋白的預(yù)測

根據(jù) EsPASy和 InterPro的分析結(jié)果,預(yù)測CHR1基因編碼含有315個氨基酸殘基的蛋白產(chǎn)物,分子量為 35489.8 Da,理論等電點(diǎn) pI=6.32。根據(jù)CHR1的氨基酸序列分析可知,在49～66和152～169處含有兩個阿爾多/酮(AIdo/keto)還原酶家族的特征性催化位點(diǎn)(Aldo/keto reductase family signature 1 and Aldo/keto reductase family signature 2),在262～277處含有一個阿爾多/酮(AIdo/keto)還原酶家族可能的特征性活性結(jié)合位點(diǎn)(Aldo/keto reductase family putative active site signature),預(yù)示該蛋白可能屬于阿爾多/酮(AIdo/keto)還原酶蛋白。同時構(gòu)建CHR1基因表達(dá)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)圖(圖6),含有典型的特征性的阿爾多/酮(AIdo/keto)還原酶催化位點(diǎn)的折疊結(jié)構(gòu),進(jìn)一步證明了CHR1基因表達(dá)產(chǎn)物的催化功能。

圖5 異甘草素HPLC檢測圖

3 討 論

研究顯示,查爾酮還原酶是由多基因家族組成的[21,22],對于不同的CHR基因的功能和效率、相互之間的關(guān)系,需要進(jìn)一步深入的研究。Shimada等[23]從百脈根中克隆出與查爾酮還原酶同源的聚酮還原酶基因,在牽?；ㄖ羞^表達(dá),證明其促進(jìn)異甘草素的形成。Xu等[23]對蒙古黃芪AmCHR進(jìn)行克隆,結(jié)果表明AmCHR在根、莖、葉中均有表達(dá),在根中優(yōu)勢表達(dá)。劉江等[23]從栽培大豆南農(nóng)1138-2中克隆出GmCHR序列,構(gòu)建過表達(dá)載體并對大豆進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化,通過組織表達(dá)分析結(jié)果顯示,GmCHR在大豆葉片中表達(dá)量最高。本研究結(jié)果顯示,CHR1基因在大豆的葉片部位的表達(dá)量最高,其次為根部。

圖6 CHR1基因表達(dá)產(chǎn)物的3D立體結(jié)構(gòu)預(yù)測圖

利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將功能元件轉(zhuǎn)入受體大豆基因組中,Southern blotting檢測說明功能元件以單拷貝形式整合到大豆基因組當(dāng)中,熒光定量PCR檢測CHR1基因 mRNA的表達(dá)量,最高下降98.33%,而HPLC檢測 CHR1調(diào)控的代謝產(chǎn)物異甘草素的含量僅下降38.7%,可能的原因有待進(jìn)一步研究。

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