sgf73+在裂殖酵母中的大規(guī)模遺傳篩選

郭雨辰, 雷秉坤, 鄧小龍, 余垚, 呂紅

復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 遺傳工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 200433

sgf73+在裂殖酵母中的大規(guī)模遺傳篩選

郭雨辰, 雷秉坤, 鄧小龍, 余垚, 呂紅

復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 遺傳工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 200433

遺傳相互作用(Genetic interaction, GI)直接提示了生物體內(nèi)各個(gè)基因在功能上的關(guān)聯(lián)性, 為研究一個(gè)基因的潛在功能提供了線索。遺傳篩選是研究基因遺傳相互作用的重要方法。文章以 SAGA(Spt-Ada-Gcn5 acetyltransferase)復(fù)合物去泛素化模塊亞基基因sgf73+為查詢(xún)基因, 在裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)中進(jìn)行了大規(guī)模遺傳篩選。結(jié)果顯示, 164個(gè)基因與 sgf73+具有負(fù)遺傳相互作用, 42個(gè)基因具有正遺傳相互作用。GO(Gene ontology)分析結(jié)果表明, 這些基因富集于染色質(zhì)修飾、DNA損傷修復(fù)、壓力應(yīng)答、RNA轉(zhuǎn)錄等生物過(guò)程。通過(guò)組蛋白修飾檢測(cè)實(shí)驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn), sgf73+的缺失導(dǎo)致組蛋白H3K9、H4K16位點(diǎn)乙?；较陆? H3K4位點(diǎn)甲基化修飾水平上升。此外, 系列稀釋實(shí)驗(yàn)顯示sgf73Δ菌株對(duì)DNA損傷試劑HU和CPT的敏感性提高, 并且Sgf73參與高氧脅迫應(yīng)答。這些結(jié)果顯示sgf73+參與了染色質(zhì)修飾、DNA損傷修復(fù)和高氧壓力應(yīng)答過(guò)程。

遺傳相互作用; 裂殖酵母; sgf73+; 組蛋白修飾; DNA損傷修復(fù); 壓力應(yīng)答

遺傳相互作用(Genetic interaction, GI)是研究生物基因型和表型關(guān)系之間的橋梁[1,2], 在揭示生物網(wǎng)絡(luò)的基因冗余性、理解人類(lèi)重大疾病的分子機(jī)制中發(fā)揮重要作用[3,4]。遺傳篩選是探究基因間遺傳相互作用的重要方法。近年來(lái)隨著高通量篩選技術(shù)的快速發(fā)展, 使得遺傳相互作用的大規(guī)模篩選得以實(shí)現(xiàn), 從而為解讀生物體中各個(gè)基因之間的遺傳關(guān)系網(wǎng)絡(luò)、挖掘重要基因的多功能性提供了很好的研究方法。2001年, Tong等[5]在Science上提出合成遺傳陣列(Synthetic genetic array, SGA)分析, 為酵母的大規(guī)模遺傳篩選提供了理論基礎(chǔ)。根據(jù)酵母細(xì)胞生長(zhǎng)表型的不同, 遺傳相互作用可以分為以下三類(lèi): (1)表型加劇(負(fù)遺傳相互作用), 即雙突變體表型強(qiáng)于預(yù)期的與之相關(guān)的兩個(gè)單突變體表型, 提示相互作用基因位于平行通路中發(fā)揮同一生物學(xué)功能; (2)表型減弱(正遺傳相互作用), 即雙突變體表型弱于預(yù)期的與之相關(guān)的兩個(gè)單突變體表型, 提示相互作用基因位于同一通路共同發(fā)揮作用; (3)表型不變,即雙突變體表型與預(yù)期的與之相關(guān)的兩個(gè)單突變體表型一致, 提示基因間沒(méi)有遺傳關(guān)聯(lián)性[6,7]。裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)具有基因組小、生長(zhǎng)周期短、易培養(yǎng)等特點(diǎn), 在進(jìn)行大規(guī)模遺傳篩選上具有很大的優(yōu)勢(shì)。2002年, 裂殖酵母的全基因組測(cè)序完成后, 各種必需基因與非必需基因突變體文庫(kù)的成功構(gòu)建也是大規(guī)模遺傳篩選研究得以順利進(jìn)行的主要原因。

SAGA(Spt-Ada-Gcn5 acetyltransferase)復(fù)合物是真核生物中高度保守的染色質(zhì)重塑復(fù)合物, 在染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄、DNA損傷修復(fù)、mRNA轉(zhuǎn)運(yùn)等過(guò)程中發(fā)揮作用。SAGA復(fù)合物由21種保守蛋白組成,包括組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶模塊、組蛋白去泛素化模塊、TATA結(jié)構(gòu)域結(jié)合蛋白作用模塊、募集模塊和結(jié)構(gòu)模塊5部分[8]。Sgf73是較晚發(fā)現(xiàn)的一個(gè)SAGA復(fù)合物亞基, 與Sus1、Sgf11以及酶學(xué)活性亞基Ubp8共同組成了 SAGA復(fù)合物的去泛素化模塊(Deubiquitination module, DUBm)。Sgf73的缺失直接引起去泛素化模塊的解離[9], 導(dǎo)致組蛋白H2B泛素化水平整體上調(diào)[10]。Shukla等[11]報(bào)道在釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中Sgf73可以幫助SAGA復(fù)合物募集到GAL1啟動(dòng)子上, 促進(jìn)轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成;釀酒酵母中Sgf73的缺失影響Sus1與mRNA輸出復(fù)合物Sac1-Thp1(TREX2)結(jié)合, 造成了mRNA前體在細(xì)胞核內(nèi)大量積累[12]。

裂殖酵母與釀酒酵母同屬子囊菌綱, 但是兩者在 4.2億年前已經(jīng)各自分化[13]。由于裂殖酵母在細(xì)胞周期、rRNA生物合成、RNAi途徑以及基因的表達(dá)調(diào)控等方面與哺乳動(dòng)物細(xì)胞具有一定的相似性,因此, 近年來(lái)在裂殖酵母中開(kāi)展的研究備受關(guān)注。Ryan等[1]選擇 876個(gè)目的基因, 分別與裂殖酵母中2000個(gè)基因進(jìn)行遺傳篩選。通過(guò)對(duì)160萬(wàn)個(gè)雙突變體的生長(zhǎng)值進(jìn)行測(cè)量, 將獲得的遺傳關(guān)聯(lián)劃分為297個(gè)功能模塊, 發(fā)現(xiàn)了144個(gè)參與mRNA剪切、DNA損傷修復(fù)等過(guò)程的新基因。據(jù)此, 作者提出遺傳關(guān)系在生物進(jìn)化過(guò)程中是保守的, 其保守性在蛋白復(fù)合物中最高, 在相關(guān)的生物過(guò)程中其次, 在無(wú)關(guān)聯(lián)的生物過(guò)程中最低。裂殖酵母含有5123個(gè)基因,其中非必需基因3683個(gè)。已有的篩選報(bào)道僅覆蓋了裂殖酵母非必需基因的 60%, 同時(shí)對(duì)獲得的具有遺傳關(guān)聯(lián)的基因缺少深入的功能研究。本研究利用sgf73+作為查詢(xún)基因, 對(duì)3256個(gè)非必需基因(覆蓋了裂殖酵母非必需基因的88.4%)進(jìn)行了大規(guī)模遺傳篩選, 并在組蛋白修飾、DNA損傷以及氧壓力應(yīng)答等方面進(jìn)一步分析了sgf73+的生物功能。

1 材料和方法

1.1 材料

裂殖酵母基因缺失突變體文庫(kù)購(gòu)于 Bioneer公司(S pombe Haploid Mutants Set ver1 0)。該文庫(kù)共有3256個(gè)裂殖酵母基因缺失突變體, 覆蓋了裂殖酵母非必需基因總數(shù)的 88.4%。這些突變體都是在 h+野生型菌株ED666(h+ade6-M210 ura4-D18 leu1-32)或ED668(h+ade6-M216 ura4-D18 leu1-32)中構(gòu)建得到的, 篩選標(biāo)記是G418抗性。構(gòu)建方法及各突變體基因型參見(jiàn)http://pombe.bioneer.co.kr/網(wǎng)站。

為了進(jìn)行雜交篩選, 本研究利用同源重組的方法[14], 在 h-野生型菌株(h-ade6-M210 leu1-32 ura4-D18)中, 缺失 sgf73+基因, 獲得 sgf73+缺失突變體(h-sgf73::Hyg ade6-M210 leu1-32 ura4-D18), 篩選標(biāo)記是HYG抗性, 命名為sgf73Δ。

裂殖酵母培養(yǎng)條件及所需培養(yǎng)基參見(jiàn)文獻(xiàn)[15]。

1.2 方法

1.2.1 遺傳相互作用篩選

利用雜交的方法[16]進(jìn)行遺傳相互作用篩選, 構(gòu)建 sgf73+與其他非必需基因的雙基因缺失突變體菌株。具體過(guò)程: 將突變體庫(kù)菌株與 sgf73Δ菌株分別接種于96孔板YES液體培養(yǎng)基中, 32℃培養(yǎng)3 d。先將各突變體菌液分別點(diǎn)種在 SPAS平板上, 再在同一位置覆蓋點(diǎn)種sgf73Δ菌液, 25℃培養(yǎng)3 d。確認(rèn)產(chǎn)孢后, 將SPAS平板移至45℃培養(yǎng)2 d, 殺死營(yíng)養(yǎng)體。將孢子轉(zhuǎn)接到96孔板YES液體中, 32℃培養(yǎng)3 d,點(diǎn)種到Y(jié)ES+G418+HYG抗性平板上, 32℃培養(yǎng)3～5 d, 獲得雙突變體。

SPAS培養(yǎng)基配方: 10 g/L葡萄糖, 1 g/L KH2PO4, 1 mL維生素原液, 45 mg/L腺嘌呤, 45 mg/L組氨酸, 45 mg/L亮氨酸, 45 mg/L尿嘧啶, 45 mg/L賴(lài)氨酸(1000×維生素原液: 1 g/L泛酸, 10 g/L煙酸, 10 g/L肌糖, 10 mg/L生物素)。

1.2.2 遺傳互作關(guān)聯(lián)分析

將通過(guò)雜交獲得的雙突變體菌株接種于 96孔板YES液體中, 32℃培養(yǎng)4 d。培養(yǎng)液稀釋50倍, 取4 μL接種于YES+G418+HYG抗性平板上, 32℃培養(yǎng)2 d。掃描菌斑, 利用 ImageJ軟件(ImageJ2.1.4.7, National Institutes of Health)對(duì)菌斑灰度進(jìn)行分析[17]。同時(shí), 將突變體庫(kù)中的所有單缺失突變體、sgf73Δ菌株、以及野生型菌株進(jìn)行培養(yǎng)、稀釋、點(diǎn)種于各自對(duì)應(yīng)的抗性平板(單缺失突變體為 YES+ G418平板, sgf73Δ菌株為 YES+HYG平板, 野生型菌株為YES平板), 并進(jìn)行菌斑灰度分析。將突變體庫(kù)中的單突菌株灰度值與野生型相比, 得到單突菌株生長(zhǎng)數(shù)值, 記作FxΔ; sgf73Δ菌株與野生型菌株的灰度值之比記作 Fsgf73Δ; 雙突菌株與與野生型菌株的灰度值之比記作FxΔsgf73Δ, 根據(jù)遺傳關(guān)系計(jì)算公式,為了進(jìn)一步消除誤差, 將所有突變體的G值用log2函數(shù)處理后, 將G值小于-0.5定義為負(fù)遺傳相互作用, G值大于0.5定義為正遺傳相互作用, G值介于正負(fù)0.5之間定義為沒(méi)有遺傳相互作用。

為了對(duì)篩選結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證, 按照上述方法,將所有G值小于-0.5和G值大于0.5基因的單、雙突變體以及 sgf73Δ和野生型菌株重新培養(yǎng)、稀釋、點(diǎn)種于YES平板上, 32℃培養(yǎng)2 d, 掃描菌斑, 利用Image J軟件進(jìn)行定量灰度分析, 計(jì)算遺傳關(guān)系。

1.2.3 GO分析

根據(jù) http://amigo.geneontology.org以及 Gene Database網(wǎng)站上關(guān)于裂殖酵母各基因的基因信息數(shù)據(jù)庫(kù), 按照所參與的生物過(guò)程對(duì)篩選得到與 sgf73+具有遺傳關(guān)系的基因進(jìn)行了GO分類(lèi), 選取的GO不少于3個(gè)基因, 并且P≤0.05。

1.2.4 蛋白免疫印跡檢測(cè)(Western blot)

裂殖酵母組蛋白抽提方法及蛋白免疫印跡檢測(cè)方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[19]。用H3K9ac(ab10812)、H4K16ac (07-329)抗體檢測(cè)組蛋白乙?；揎? 用 H3K4mm (ab8895)、H3K4dm(ab7766)、H3K4tm (ab8580)抗體檢測(cè)組蛋白甲基化修飾, 用H3CTPAN (07-690)抗體檢測(cè)組蛋白H3作為內(nèi)參, 利用Image J軟件進(jìn)行條帶灰度分析。以上所有抗體均購(gòu)自 Abcam 和Millipore公司。

1.2.5 系列稀釋實(shí)驗(yàn)

挑取菌株單克隆接種于3 mL YES液體培養(yǎng)基中, 32℃過(guò)夜培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中期(OD600=1-2.5),用分光光度計(jì)測(cè)量菌液 OD600值, 并用無(wú)菌水稀釋菌液至起始OD600值為1.0, 再按5倍梯度進(jìn)行系列稀釋。將稀釋好的菌液依次取2 μL點(diǎn)種于實(shí)驗(yàn)所需固體平板上, 32℃培養(yǎng)2～3 d, 掃描菌斑。本研究中所用各種藥物濃度分別為 5 μmol/L CPT、5 mmol/L HU和3 mmol/L H2O2。

2 結(jié)果與分析

2.1 sgf73+基因遺傳篩選與遺傳相互作用分析

圖1 sgf73+在裂殖酵母全基因組遺傳篩選分析A: 與sgf73+存在負(fù)遺傳相互作用的基因和正遺傳相互作用的基因占據(jù)裂殖酵母非必需基因的比例; B: 與sgf73+具有遺傳相互作用基因的GO分布(縱軸顯示GO中相應(yīng)的生物學(xué)過(guò)程, 橫軸顯示參與到各自生物學(xué)過(guò)程中的基因數(shù)目); C: 與sgf73+遺傳互作基因和對(duì)應(yīng)的遺傳關(guān)系強(qiáng)度(黑線代表負(fù)遺傳相互作用, 橘紅色線代表正遺傳相互作用。線段越粗, 表示遺傳互作關(guān)系越強(qiáng), 反之亦然。紅色圓圈代表新發(fā)現(xiàn)的遺傳相互作用)。

本研究利用在 h-野生型菌株中構(gòu)建的 sgf73+缺失突變體sgf73Δ和在h+野生型菌株中構(gòu)建的裂殖酵母突變體庫(kù)進(jìn)行雜交篩選。共得到 206個(gè)與 sgf73+具有遺傳相互作用的基因, 占非必需基因總數(shù)的5.59%, 其中負(fù)遺傳相互作用基因164個(gè), 占非必需基因總數(shù)的4.45%, 正遺傳相互作用基因 42個(gè), 占非必需基因總數(shù)的 1.14%(圖 1A)。與已報(bào)道的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比, 發(fā)現(xiàn)其中 134個(gè)與 sgf73+具有遺傳關(guān)系的基因已有報(bào)道[1], 包括 SAGA復(fù)合物其他成員gcn5+、ngg1+和sgf29+等, 證明了篩選的可靠性。進(jìn)一步對(duì)與sgf73+遺傳相互作用的基因進(jìn)行GO分析,選取P≤0.05的GO進(jìn)行歸類(lèi)。結(jié)果表明, 這些基因主要?dú)w屬于生物代謝、染色質(zhì)修飾、細(xì)胞周期、壓力應(yīng)答、轉(zhuǎn)錄、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、DNA損傷修復(fù)等生命過(guò)程(圖1B)。選取染色質(zhì)修飾、細(xì)胞周期調(diào)控、DNA損傷修復(fù)和壓力應(yīng)答 4個(gè)生物過(guò)程中的基因, 根據(jù)它們與sgf73+遺傳關(guān)系強(qiáng)弱程度繪制遺傳網(wǎng)絡(luò)圖(圖1C)。結(jié)果顯示, 染色質(zhì)修飾與細(xì)胞周期過(guò)程各有26個(gè)基因與 sgf73+存在遺傳關(guān)聯(lián), 其中, 染色質(zhì)修飾基因多參與組蛋白乙?；⑷ヒ阴；约凹谆揎椷^(guò)程(圖 1C, 染色質(zhì)修飾); 而細(xì)胞周期相關(guān)基因涉及微管形成、紡錘體組裝、DNA復(fù)制、核分裂等多個(gè)過(guò)程的調(diào)控(圖1C, 細(xì)胞周期)。此外, 在壓力應(yīng)答模塊中, 共有 23個(gè)基因與 sgf73+存在遺傳互作,其中14個(gè)基因的遺傳關(guān)系是本研究首次發(fā)現(xiàn)的, 參與氧壓力應(yīng)答、MAP、離子運(yùn)輸?shù)壬锿緩?圖1C,壓力應(yīng)答)。與染色質(zhì)修飾、細(xì)胞周期調(diào)控、壓力應(yīng)答模塊相比, 與sgf73+存在遺傳關(guān)聯(lián)的DNA損傷修復(fù)基因有13個(gè), 包括rhp41+、cds1+、rad24+、rad51+、rhp26+和 cdm1+等多個(gè)經(jīng)典 DNA損傷修復(fù)蛋白(圖1C, DNA損傷修復(fù)), 以上分析結(jié)果提示sgf73+可能參與上述生物學(xué)過(guò)程。

本研究新發(fā)現(xiàn)74個(gè)基因與sgf73+之間具有遺傳相互作用, 其中負(fù)遺傳相互作用基因 51個(gè), 正遺傳相互作用基因23個(gè)。新發(fā)現(xiàn)的遺傳互作基因包括染色質(zhì)重塑相關(guān)基因jmj4+、hat1+和rik1+, DNA損傷修復(fù)基因rad51+、rad24+和mag2+, 細(xì)胞周期調(diào)控基因mad2+、klp3+和csk1+等, 這些基因的發(fā)現(xiàn)豐富了sgf73+的遺傳關(guān)系網(wǎng)絡(luò), 為揭示sgf73+在上述生物過(guò)程中的作用機(jī)制提供幫助。此外, 本研究還篩選到14個(gè)參與壓力應(yīng)答的基因、15個(gè)參與生物代謝過(guò)程的基因、5個(gè)參與物質(zhì)運(yùn)輸?shù)幕蛞约?5個(gè)參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因。sgf73+遺傳互作基因在上述生物過(guò)程中的富集提示其能夠參與這些過(guò)程的調(diào)控, 但目前尚沒(méi)有報(bào)道證實(shí) sgf73+具有相關(guān)生物功能, 這一結(jié)果對(duì)探究sgf73+的新功能具有很好地指示作用。

2.2 sgf73+的缺失影響組蛋白乙?；图谆揎?/p>

遺傳篩選表明sgf73+與26個(gè)染色質(zhì)修飾基因具有遺傳相互作用(圖 1C, 染色質(zhì)修飾)。本文對(duì)乙?；揎椣嚓P(guān)基因gcn5+和hat1+、去乙?；揎椣嚓P(guān)基因prw1+、甲基化修飾相關(guān)基因ash2+與sgf73+的遺傳關(guān)系進(jìn)一步分析(圖 2A)。將野生型、sgf73Δ、單突菌株以及對(duì)應(yīng)的雙突菌株等量接種于YES平板上, 培養(yǎng)相同時(shí)間。以野生型的菌斑灰度值作為對(duì)照(設(shè)為 1.0), 發(fā)現(xiàn) sgf73Δ與其他單突菌斑灰度值介于 0.9～1.0, 對(duì)正常生長(zhǎng)沒(méi)有顯著影響, 而當(dāng) sgf73+與其他基因同時(shí)缺失后, 對(duì)應(yīng)的雙突菌株生長(zhǎng)值低于預(yù)期生長(zhǎng)值, 說(shuō)明 sgf73+與上述基因具有遺傳相互作用。

因此, 本文推測(cè) sgf73+除了能夠調(diào)控組蛋白H2B去泛素化外還參與組蛋白乙?；?、甲基化等修飾過(guò)程。為了在功能上驗(yàn)證 sgf73+是否參與組蛋白修飾, 本文首先檢測(cè)WT、sgf73Δ在SAGA復(fù)合物乙?；揎椢稽c(diǎn)H3K9、H4K16位點(diǎn)處的乙?；?并以SAGA復(fù)合物酶學(xué)活性亞基gcn5Δ、ubp8Δ作為對(duì)照(圖2B)。通過(guò)ImageJ對(duì)條帶灰度定量分析發(fā)現(xiàn),與野生型相比, sgf73+的缺失能夠引起H3K9、H4K16位點(diǎn)處的乙酰化水平下降, 在 H3K9位點(diǎn)處乙?；抡{(diào)水平約為20%, 而在H4K16位點(diǎn)處乙酰化下調(diào)水平達(dá)到30%。gcn5Δ和ubp8Δ中這兩個(gè)位點(diǎn)處的乙酰化也有一定程度下降, 但是相對(duì)于 sgf73Δ, gcn5Δ中乙?；陆蹈鼊×? 而 ubp8Δ中乙?；陆党潭扰csgf73Δ基本相同。因此, sgf73+可能依賴(lài)SAGA酶學(xué)活性的來(lái)調(diào)控H3、H4乙?；揎椷^(guò)程。

Western blot檢測(cè)H3K4甲基化結(jié)果顯示(圖2C), sgf73+缺失后, H3K4甲基化上升, 而在sgf73Δash2Δ雙缺失的菌株中, 甲基化從基本喪失恢復(fù)至野生型水平, 這也提示了sgf73Δash2Δ菌株生長(zhǎng)變差可能與H3K4甲基化變化沒(méi)有直接關(guān)聯(lián), sgf73+與ash2+之間可能還存在其他功能關(guān)聯(lián)。通過(guò)gcn5Δ和ubp8Δ對(duì)照發(fā)現(xiàn), ubp8+缺失后, 甲基化水平較野生型上調(diào); gcn5+缺失后, 甲基化水平較野生型不變。

通過(guò)對(duì)遺傳關(guān)聯(lián)的深入研究, 本文用實(shí)驗(yàn)方法證明了sgf73+的缺失下調(diào)了裂殖酵母組蛋白H3K9、H4K16乙酰化, 上調(diào)了H3K4甲基化。

2.3 sgf73+基因參與 DNA損傷試劑和高氧壓力的應(yīng)答

圖2 sgf73+缺失對(duì)組蛋白乙?；图谆揎椀挠绊慉: sgf73+與染色質(zhì)修飾基因gcn5+、hat1+、prw1+和ash2+的遺傳分析。各菌株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后, 取等量的菌體點(diǎn)種于YES上, 32℃培養(yǎng) 2 d后掃描; 柱狀圖為菌斑的平均灰度值。B: sgf73+缺失對(duì)組蛋白 H3K9、H4K16乙?；降挠绊憽３樘峋曛械慕M蛋白進(jìn)行Western blot檢測(cè); 柱狀圖為條帶的灰度值。C: sgf73+缺失對(duì)組蛋白H3K4甲基化水平的影響。

遺傳篩選結(jié)果顯示sgf73+與DNA損傷修復(fù)、壓力應(yīng)答相關(guān)基因具有遺傳互作(圖 1C), 提示其可能參與上述生物過(guò)程。利用系列稀釋實(shí)驗(yàn)研究 sgf73+基因缺失對(duì)DNA損傷試劑HU、CPT以及高氧壓力脅迫的影響, 并以gcn5Δ和ubp8Δ作為對(duì)照。結(jié)果顯示(圖3A), 在高氧條件下, sgf73Δ菌株生長(zhǎng)變慢, 說(shuō)明 sgf73+對(duì)細(xì)胞應(yīng)對(duì)高氧環(huán)境壓力是必需的。而gcn5Δ和 ubp8Δ生長(zhǎng)情況無(wú)明顯變化, 提示 sgf73+參與氧壓力應(yīng)答這一功能不依賴(lài)于SAGA酶學(xué)活性。此外, sgf73Δ菌株對(duì) HU、CPT的敏感度提高, 且gcn5Δ和ubp8Δ也具有相應(yīng)表型, 表明了Sgf73乃至SAGA復(fù)合物可能在DNA損傷應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

通過(guò)對(duì)氧壓力應(yīng)答基因 ubr1+、rhp6+與 sgf73+的遺傳關(guān)系進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn), 當(dāng) sgf73+與 ubr1+、rhp6+同時(shí)缺失后, 對(duì)應(yīng)的雙突菌斑灰度值與野生型和單突相比明顯降低, 說(shuō)明 sgf73+與 ubr1+、rhp6+具有遺傳相互作用, 且當(dāng)sgf73+分別與rhp6+、ubr1+雙缺失后, 雙突菌株在高氧條件下生長(zhǎng)更為緩慢,提示 sgf73+與 rhp6+、ubr1+位于不同通路應(yīng)對(duì)高氧壓力(圖3B)。sgf73+與14個(gè)DNA損傷修復(fù)基因具有遺傳關(guān)聯(lián), 其中9個(gè)是已經(jīng)報(bào)道的, 5個(gè)是本文新發(fā)現(xiàn)的(圖1C, DNA損傷修復(fù))。進(jìn)一步挑選已報(bào)道的cds1+和新發(fā)現(xiàn)的rad51+作為代表, 分別用遺傳方法分析了 sgf73+與兩者之間的關(guān)系。發(fā)現(xiàn)用 5 mmol/L HU處理后, sgf73+與 rad51+雙缺失菌株與sgf73Δ表型一致, 而 sgf73+與 cds1+雙缺失菌株對(duì)HU更敏感(圖3C), 提示sgf73+與rad51+位于同一遺傳通路, 而與cds1+處于不同遺傳通路。

圖3 sgf73+缺失對(duì)DNA損傷試劑和H2O2的影響A: sgf73Δ對(duì)DNA損傷試劑敏感性檢測(cè)。各菌株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后, 取等量的菌體點(diǎn)種于YES或含有藥物的平板上, 32℃培養(yǎng)2～3 d后掃描。B: sgf73+與氧壓力應(yīng)答基因rhp6+、ubr1+的遺傳分析。培養(yǎng)與掃描方式同圖A; 柱狀圖為菌斑的平均灰度值。C: sgf73+與DNA損傷修復(fù)基因rad51+、cds1+的遺傳分析。

3 討 論

SAGA復(fù)合物是真核生物中高度保守的染色質(zhì)重塑復(fù)合物, 在染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄、DNA損傷修復(fù)、mRNA轉(zhuǎn)運(yùn)等過(guò)程中發(fā)揮作用。Sgf73是SAGA復(fù)合物的去泛素化模塊成員, 負(fù)責(zé)將去泛素化模塊錨定在SAGA主體結(jié)構(gòu)上, 與SAGA復(fù)合物一起發(fā)揮作用。但是, 越來(lái)越多的研究表明, 復(fù)合物的成員除了參與復(fù)合物自身功能之外, 還以不依賴(lài)復(fù)合物的方式在其他途徑中發(fā)揮獨(dú)特作用, 例如 Spt3調(diào)控Ccr4-not Complex基因轉(zhuǎn)錄[20]。大規(guī)模遺傳篩選技術(shù)已經(jīng)在釀酒酵母、線蟲(chóng)(Caenorhabditis elegans)等模式生物中得到了廣泛的應(yīng)用, 為深入揭示基因功能提供了可靠的指導(dǎo)作用。本研究利用裂殖酵母全基因組篩選的方法, 獲得了與 sgf73+具有負(fù)遺傳相互作用的基因164個(gè), 正遺傳相互作用的基因42個(gè),這些基因分屬于生物代謝、壓力應(yīng)答、DNA損傷修復(fù)、染色質(zhì)修飾、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期調(diào)控以及轉(zhuǎn)錄等過(guò)程。

組蛋白共價(jià)修飾是一種可逆的翻譯后修飾作用[21], 各修飾之間相互影響、相互協(xié)調(diào), 形成一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò), 是表觀遺傳學(xué)研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域。在前期篩選中, 發(fā)現(xiàn)sgf73+基因與組蛋白甲基化、乙?；^(guò)程相關(guān)基因具有遺傳相互作用。通過(guò)檢測(cè)組蛋白修飾水平發(fā)現(xiàn), 在裂殖酵母中 sgf73+缺失致使H3K9、H4K16位點(diǎn)乙酰化下調(diào), 且這一影響依賴(lài)于SAGA復(fù)合物酶學(xué)活性。本研究首次在裂殖酵母中發(fā)現(xiàn) sgf73+參與組蛋白乙?；揎椷^(guò)程。本研究還發(fā)現(xiàn), sgf73+參與調(diào)控組蛋白 H3K4甲基化過(guò)程。sgf73+缺失后組蛋白H3K4位點(diǎn)一甲、二甲和三甲甲基化修飾水平均有上調(diào), ubp8+缺失后對(duì)H3K4甲基化的影響與sgf73+相同, 而gcn5+對(duì)H3K4甲基化無(wú)明顯影響, 提示 sgf73+對(duì) H3K4甲基化的調(diào)控依賴(lài)SAGA復(fù)合物去泛素化模塊的去泛素化功能。研究表明, 組蛋白 H2BK123位點(diǎn)的泛素化修飾位于H3K4位點(diǎn)甲基化的上游, 對(duì)H3K4甲基化修飾是必需的[22]。Rad6直接負(fù)責(zé)該位點(diǎn)的泛素化, 而SAGA復(fù)合物Ubp8負(fù)責(zé)該位點(diǎn)的去泛素化, Rad6與Ubp8通過(guò)組蛋白crosstalk的形式間接調(diào)控H3K4甲基化。Sgf73作為 SAGA復(fù)合物去泛素化模塊的成員, 它的缺失能夠引起H2B整體水平的泛素化上調(diào)。因此本研究推測(cè), 在野生型情況下, sgf73+負(fù)責(zé)協(xié)助ubp8+完成對(duì)H2BK123的去泛素化修飾, 抑制H3K4甲基化; 而在sgf73+或ubp8+缺失時(shí), H2BK123的泛素化水平上調(diào), 從而激發(fā)H3K4甲基化, 因此sgf73+對(duì)H3K4甲基化的影響依賴(lài)于SAGA復(fù)合物DUB模塊。

DNA損傷應(yīng)答和壓力應(yīng)答是生物抵抗外界環(huán)境刺激、維持正常生命活動(dòng)所必需的[23,24]。SAGA復(fù)合物主要調(diào)控壓力誘導(dǎo)型基因的表達(dá), 且其主要亞基Gcn5、Spt7、Spt20參與DNA損傷應(yīng)答[25]。系列稀釋實(shí)驗(yàn)表明sgf73+基因?qū)NA損傷試劑及高氧脅迫產(chǎn)生應(yīng)答, 提示sgf73+能夠參與DNA損傷和壓力應(yīng)答過(guò)程。Rad51是參與DNA同源重組(HR)修復(fù)的重要蛋白, 它能夠與受損的單鏈DNA結(jié)合形成復(fù)合物, 從而募集下游損傷修復(fù)蛋白, 啟動(dòng)同源重組修復(fù)過(guò)程[26]。遺傳分析結(jié)果顯示, sgf73+與rad51+位于同一遺傳通路, 推測(cè)sgf73+可能參與了DNA同源重組修復(fù)過(guò)程。

組蛋白修飾在 DNA損傷修復(fù)和染色質(zhì)重塑過(guò)程中發(fā)揮直接或間接作用。已有報(bào)道表明, 在DNA重組修復(fù)過(guò)程中, 乙酰轉(zhuǎn)移酶Gcn5、Hat1和H4K16特異性去乙?；窼ir2能夠募集到DNA損傷處, 直接參與損傷修復(fù)后的染色質(zhì)重塑過(guò)程[27,28]。SAGA復(fù)合物對(duì)組蛋白H2B的去泛素化是H3K79三甲基化所必需的[29], H3K79甲基化能夠募集DNA損傷修復(fù)蛋白53PB1/Rad9至DNA雙鏈斷裂處幫助修復(fù)損傷, 因此H2B去泛素化可以通過(guò)影響甲基化修飾過(guò)程間接參與DNA損傷修復(fù)。本研究發(fā)現(xiàn), sgf73+缺失既影響組蛋白H3K9、H4K16乙?；胶虷3K4甲基化水平, 又能夠應(yīng)答DNA損傷試劑HU、CPT,提示sgf73+可能通過(guò)調(diào)控組蛋白修飾水平參與DNA損傷修復(fù)和壓力應(yīng)答過(guò)程。

綜上所述, 本文通過(guò)對(duì) sgf73+的大規(guī)模遺傳篩選研究, 發(fā)現(xiàn)并鑒定了多個(gè)與 sgf73+發(fā)生遺傳相互作用的新基因, 這一系列的結(jié)果為 sgf73+的作用機(jī)制的研究提供了新的線索。此外, 通過(guò)SMART蛋白結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn), Sgf73蛋白含有SCA7結(jié)構(gòu)域, 該結(jié)構(gòu)域從酵母到人中高度保守, 提示 sgf73+基因功能在真核生物中存在進(jìn)化關(guān)聯(lián)性。因此, 本研究結(jié)果為其他真核生物中 sgf73+的功能研究提供了借鑒。

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(責(zé)任編委: 何 群)

Large scale screening of genetic interaction with sgf73+in fission yeast

Yuchen Guo, Bingkun Lei, Xiaolong Deng, Yao Yu, Hong LV

State Key Laboratory of Genetic Engineering, School of Life Sciences, Fudan University, Shanghai 200433, China

Genetic interaction (GI) not only suggests functional correlations between different genes in vivo, but also provides clues for understanding the potential biological function of a specific gene. Screening of GI is an important method for understanding GI between different genes. In this study, we selected sgf73+as a query, which encodes a subunit of SAGA (Spt-Ada-Gcn5 acetyltransferase) complex deubiquitination module, to perform a large scale screening of GI in fission yeast. Our data showed that 164 genes had negative GIs whereas 42 genes had positive GIs with sgf73+. GO (Gene ontology) analysis indicated that these genes were enriched in several important biological processes, including chromatin modification, DNA damage repair, cellular response to stress, RNA transcription and so on. By using histone modification detection, we showed for the first time that loss of sgf73+led to a decreased level of histone acetylation at H3K9 and H4K16 and an increased level of histone H3K4 methylation. Furthermore, the spot assay results showed that the sgf73Δ cells exhibited increased sensitivity to DNA damage agents, HU and CPT, and sgf73+was involved in responses to hyperoxia stress.All these results suggested that sgf73+plays important roles in chromatin modification, DNA damage repair and hyperoxia responses.

genetic interaction; fission yeast; sgf73+; histone modification; DNA damage repair; response to stress

2014-01-26;

2014-04-16

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)項(xiàng)目(編號(hào)：2009CB825601)和國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：31200961)資助

郭雨辰，碩士研究生，專(zhuān)業(yè)方向：微生物遺傳學(xué)。E-mail: 11210700149@fudan.edu.cn

呂紅，教授，研究方向：微生物遺傳學(xué)。E-mail: honglv@fudan.edu.cn

10.3724/SP.J.1005.2014.0723

時(shí)間: 2014-5-6 15:12:41

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20140506.1512.002.html