馬鈴薯Y病毒福建分離物P1基因的分子變異和結(jié)構(gòu)特征

史鳳陽,高芳鑾,沈建國,常飛,詹家綏

1.福建農(nóng)林大學植物病毒研究所,福建省植物病毒學重點實驗室,福州 350002;2.福建出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心,福州 350001

病原物群體遺傳變異及其演化機制直接影響植物病害的發(fā)生、發(fā)展及控制。在寄主、病原和環(huán)境的病害三角中,病原物承受著來自寄主和環(huán)境的雙重選擇。為了增加對新的抗病寄主和新環(huán)境的適應(yīng)性,病原物通過突變、基因流和基因重組不斷引進和產(chǎn)生新的變異。在自然選擇下,有益變異得到積累,有害變異則被淘汰[1]。由于寄主和病原物本身都是由復雜的、動態(tài)結(jié)構(gòu)的個體組成的,隨著病原物群體結(jié)構(gòu)的時空變化,這種特定的寄主——病原物關(guān)系也隨之發(fā)生改變。馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)是目前感染馬鈴薯并造成最嚴重經(jīng)濟損失的病毒之一。PVY寄主范圍廣,在全球馬鈴薯種植區(qū)廣泛流行,在我國馬鈴薯種植區(qū)及亞洲地區(qū)周邊國家也普遍發(fā)生,并呈上升發(fā)展趨勢[2,3]。PVY是馬鈴薯Y病毒科(Potyviridae)馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus)的重要成員之一[4],其基因組由正單鏈RNA分子組成,大小約 10 kb,包含一個大的開放閱讀框(Open reading frame,ORF)。PVY基因組采用多聚蛋白切割(Polyprotein cleavage)和移碼翻譯(Read frame shift)方式最終生成 11個成熟的多功能蛋白[5,6],使該病毒呈現(xiàn)不同程度的遺傳多樣性。根據(jù)是否發(fā)生基因重組,PVY株系分為兩大類：一類是非重組株系,包括PVYO、PVYC和 PVYN株系; 另一類是PVYO和PVYN在不同基因區(qū)段發(fā)生重組的株系,即 N×O重組株系,如：PVYNTN、PVYN-Wi(北美稱 PVYN:O)、PVYNTN-NW[7,8]。由于N×O重組株系具備了非重組株系的其他適應(yīng)性優(yōu)勢,表現(xiàn)出比PVYO株系和PVYN株系更強的致病力,如：PVYNTN株系侵染馬鈴薯后,可以引發(fā)馬鈴薯塊莖環(huán)斑壞死病(Potato tuber necrotic ringspot disease,PTNRD),導致馬鈴薯種質(zhì)退化、產(chǎn)量降低。目前,PVY重組株系已在全球的不同地區(qū)蔓延[9]。由于 PVY群體遺傳多樣性高,株系分化嚴重,具有相對強的生存和進化優(yōu)勢,可以快速適應(yīng)新寄主(或生存環(huán)境)。隨著近年來農(nóng)產(chǎn)品貿(mào)易的全球化,PVY變異頻繁,不斷有新的重組株系產(chǎn)生,對馬鈴薯生產(chǎn)造成極大損失[10],嚴重時減產(chǎn)高達80%以上[11]。因此,開展PVY功能基因的分子多樣性研究有利于探索變異、重組等遺傳機制在PVY進化中的作用,也有助于了解植物病毒的發(fā)生、流行和防控特點,具有重要的理論和現(xiàn)實意義。

對于P1基因的研究側(cè)重于蛋白質(zhì)組學、生物化學和系統(tǒng)發(fā)育學方面[12],在群體遺傳學領(lǐng)域,P1基因的研究多局限于對遺傳多樣性的描述,對該基因分子變異、P1蛋白3D結(jié)構(gòu)的影響及遺傳多樣性形成的遺傳機制研究較少。如：吳興泉等[13]比較了 1個福建分離物與其他已發(fā)表的33個分離物的P1蛋白氨基酸序列同源性,發(fā)現(xiàn)氨基酸序列在不同分離物之間存在明顯差異; Hu 等[14]研究表明,PVY全基因組存在5個顯著的重組熱點,其中P1基因可能是重組的熱點區(qū)之一; Wang等[15]通過分析煙草上的兩個山東PVY分離物AQ4和FZ10的分子特征,發(fā)現(xiàn)兩個分離物的P1基因均為N×O重組型; 張俊祺等[16]對煙草上一個貴州PVY分離物的P1基因進行了克隆和序列分析,表明該分離物的變異來自堿基位點的突變而非基因重組。以上發(fā)現(xiàn)雖然為了解PVY進化奠定了基礎(chǔ),但許多結(jié)果還沒有得到其他數(shù)據(jù)的有效驗證。

福建省是中國最早種植馬鈴薯的地區(qū)之一,也是南方馬鈴薯冬種的優(yōu)勢區(qū)和主產(chǎn)區(qū)。對于福建省PVYP1基因遺傳多樣性及其形成的遺傳機制與我國乃至世界其他地區(qū)PVYP1基因的異同性尚未有系統(tǒng)的報道。為此,本文在前期檢測的53份福建省PVY陽性樣品中[3],對采自福州、寧德、龍巖、漳州4個地區(qū)各3個樣品,通過克隆獲得的12個PVY分離物P1基因的全長 cDNA序列,并應(yīng)用生物信息學方法對其核苷酸序列、氨基酸序列的分子變異及結(jié)構(gòu)特征等開展系列分析,旨在探索福建PVYP1基因的遺傳變異特征以及明確突變和重組等遺傳機制在該基因進化的作用,為PVY病毒病的流行、變異趨勢及其有效防控奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

馬鈴薯病株于2011年～2012年之間采自福建省馬鈴薯主要種植區(qū),在前期研究共檢測到的 53份PVY陽性樣品中[3],分別從福州、寧德、龍巖、漳州 4個地區(qū)采用隨機抽樣法各抽取 3個樣品,共計12個福建分離物用于本研究。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取及P1基因克隆

采用 Trizol 試劑法從感染 PVY的馬鈴薯病葉中提取總 RNA,提取方法參照 RNA Simple Total RNA 試劑盒(TianGen)說明書進行。取2 μL 總RNA用 oligo(dT)18為引物按照操作說明書進行反轉(zhuǎn)錄,獲得 PVY全長的 cDNA。根據(jù) GenBank已報道的PVY常見株系P1基因序列保守區(qū),設(shè)計一對用于擴增該基因的簡并引物 P1-F(5′-CVATGGCAAYYTACAYGTCAAC-3′)和 P1-R(5′-AGGRTATCTCADYHGTGCCC-3′),預期片段大小為 915 bp,引物由南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司合成。

PCR 擴增采用 25 μL 反應(yīng)體系:10×TransTaqHiFi Buffer II 2.5 μL,dNTPs(2.5 mmol/L) 2 μL,P1-F(10 μmol/L)1 μL,P1-R(10 μmol/L)1 μL,ddH2O 34.5 μL,TransTaqHiFi Polymerase(5 U/μL) 0.5 μL,cDNA 2 μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃預變性4 min;94℃變性30 s,53℃復性30 s,72℃延伸1 min,共30個循環(huán); 最后一輪循環(huán)后72℃延伸5 min。

PCR反應(yīng)結(jié)束后,取產(chǎn)物5 μL用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒純化后與 pEASY-T5 Zero 克隆載體連接,并轉(zhuǎn)化到Trans1-T1感受態(tài)細胞中。篩選得到陽性克隆子,隨機選擇其中3～6個由南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司測序列,并根據(jù)測序峰圖及序列比對分析排除由PCR擴增引起的突變。

1.2.2P1基因的分子變異

測序獲得的序列使用 DNAMAN等軟件進行處理,P1基因的核苷酸使用 MEGA軟件中的 Muscle(Codons) 子程序進行多重比對,并根據(jù)對應(yīng)的編碼氨基酸序列進行校正。序列同源性使用BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)工具在線比對,分子變異通過DnaSP、MEGA5等軟件進行分析。

1.2.3P1基因的重組分析

以文獻報道的PVY 分離物 Oz(EF026074) 和Mont(AY884983)作為參考親本株系[14],并以分離物N-605 作為備選參考株系[2]。使用SimPlot 3.5進行潛在重組事件的相似性作圖(Similarity plot)和Bootscanning分析[17]。使用遺傳算法重組檢測法(Genetic Algorithm Recombination Detection,GARD)進行重組位點的檢測并評估重組點的可靠性[18]。

1.2.4P1基因的系統(tǒng)發(fā)育分析

為進一步了解 PVYP1基因的分子進化,從GenBank中選取20個已知株系的PVYP1基因序列作為參考(表1),使用貝葉斯法(Bayesian inference,BI)進行PVYP1基因的系統(tǒng)發(fā)育分析。建樹前,使用 MAFFT[19]軟件對建樹的 32條P1基因序列進行多重序列比對,利用Mrmodeltest[20]選擇最優(yōu)化的進化模型—GTR+I模型。使用 Mrbayes3.04 b[21]進行BI法分析時,根據(jù) Mrmodeltest的 AIC(akaike information criterion)標準,替換模型為nst = 6,位點間變異速率設(shè)置為rates = propinv,建立4個馬爾可夫鏈,以隨機樹為起始樹,共運行2 000 000代。每100代抽樣1次,舍棄25%老化樣本后,根據(jù)剩余的樣本構(gòu)建一致樹,并計算后驗概率(Posterior probability)。

1.2.5 P1蛋白的序列特征

通過 ExPASy的 ProSITE數(shù)據(jù)庫(http:// prosite.expasy.org/)搜索P1蛋白中可能存在的Motif。為確保重要信息不被遺漏,避免發(fā)生單一數(shù)據(jù)庫中不能被檢測到的錯誤,Motif搜索時,聯(lián)網(wǎng)至Profile數(shù)據(jù)庫(http://www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/dbbrowser/jj/pfscan2.html)進行蛋白質(zhì)序列輪廓搜索(Profile Search); 通過 COILS Server(http://www.ch.embnet.org/software/COILS_form.html)分析P1蛋白是否含有卷曲螺旋(Coiled-coil,CC)結(jié)構(gòu); P1蛋白的結(jié)構(gòu)功能域通過SMART4.0服務(wù)器搜索; P1蛋白的三級結(jié)構(gòu)及功能位點通過 I-TASSER在線服務(wù)器(http://zhanglab.ccmb.med.umich.edu)進行預測。

表1 PVY參考序列及其GenBank登錄號

2 結(jié)果與分析

2.1 P1基因的序列分析

使用簡并引物P1-F/P1-R擴增到P1基因的PCR產(chǎn)物與預計的目的片段大小一致,約 915 bp(圖1),12個分離物及陽性對照均擴增到目的片段,陰性(健康馬鈴薯葉片)和空白對照均未擴增到相應(yīng)的片段。

RT-PCR擴增到的目的片段克隆、測序后經(jīng)DNAMAN、BLAST等分析,確定目的基因片段大小為 915 bp,其中1～825 bp為PVY P1蛋白(First protein)的編碼基因序列(GenBank登錄號分別為 KF722800、KF722802、KF722806、KF722808、KF722809、KF722811、KF722814、KF722819、KF722826、KF722828、KF722831和KF722833),編碼275個氨基酸的P1蛋白。序列同源性分析顯示,福建 12個 PVY分離物P1基因與8個PVY不同株系參考核苷酸序列一致性為 73%～99%(表 2),其中分離物 XT04、LH14、LH21、LY08、LY35、XQ04、ZL02與Oz的序列一致性最低(73%～74%),與 Mont、HN1、Mb112、Wilga5、HN2的序列一致性最高(98%～99%); 分離物 QK44、XT02、XT08、LH05與 Wilga5的序列一致性最高(95%～99%),而與其他分離物的一致性為77%～90%;分離物LY30與Oz的序列一致性最高(99%),而與其他分離物序列一致性均不高(74%～84%)。通過DNAMAN分析可知,福建分離物P1序列之間核苷酸序列一致性為 73%～99%。一致性分析結(jié)果表明,P1基因在福建不同分離物之間存在較大差異。

圖1 福建分離物P1基因RT-PCR擴增

翻譯后的 P1蛋白存在 85個(占 31%)變異的氨基酸位點,其中 LY08、LY35、XT02和 XT08分離物各有一個特異性的氨基酸變異位點,ZL02分離物含有兩個特異性的氨基酸變異位點,LH05分離物有4個特異性的氨基酸變異位點,而LY30分離物則有30個特異性的氨基酸變異位點,顯示出與其他分離物顯著的差異(表3)。

表2 PVY不同分離物P1基因核苷酸序列一致性(%)

表3 福建省PVY分離物P1基因特異氨基酸突變位點

2.2 P1基因的重組分析

通過Simplot軟件分析(圖2:A和B),發(fā)現(xiàn)分離物 QK44、XT02、XT08、LH05中均檢測一個潛在的重組信號,表明分離物QK44、XT02、XT08、LH05的P1基因序列可能是PVYN和 PVYO的重組而成。進一步通過GARD 確認這4個分離物存在兩個重組位點(圖2C)：(1)309位核苷酸的重組位點平均模型支持率達99.32%,且KH檢驗顯示P= 0.0040 < 0.01;(2)423位核苷酸的重組位點的平均模型支持率為36.52%,且KH檢驗顯示P= 0.0040 < 0.01。

2.3 P1基因的系統(tǒng)發(fā)育分析

重建的系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示(圖3A),在PVY基因組的P1基因區(qū)段上,相同株系型的分離物以較高的置信值優(yōu)先相聚成簇,福建分離物12個分離物形成3個簇,LY30分離物與O株系型(O Clade)的Oz、SASA110分離物聚為一簇(Cluster 3),QK44、XT02、XT08、LH05分離物與 N×O 重組型(N×O Clade)的SYR-II-2-8、3401、Wilga5等分離物聚為一簇(Cluster 2),而其他的7個分離物與N株系型(N Clade)的分離物聚為一簇(Cluster 1)。

2.4 P1蛋白的結(jié)構(gòu)特征

COILS Server分析結(jié)果顯示,12個PVY福建分離物中,XT04、LH14、LH21、LY08、LY35、XQ04、ZL02分離物P1蛋白的70～98位氨基酸之間均檢測到一個明顯的卷曲螺旋 CC domain(圖 3B),而其他分離物也在相似位置檢測到 CC domain,但置信值不高。

通過 SMART服務(wù)器搜索,發(fā)現(xiàn) P1蛋白第41～275氨基酸是一個高度保守的結(jié)構(gòu)功能域—Peptidase_S30,為PotyvirusP1 protease家族成員共有的典型結(jié)構(gòu)域。P1蛋白的C′端區(qū)域是一類催化裂解 P1/HC-pro蛋白的絲氨酸蛋白酶(Serine-type protease),Petpidase_S30主要由多個Potyvirus的P1蛋白的C′端區(qū)域組成。雖然PVY不同分離物的P1蛋白氨基酸序列差異較大,進一步通過 Motif搜索發(fā)現(xiàn) P1蛋白內(nèi)存在 7個保守的 Motif：I-x-F-G、V-E-L-I、I-S-I-x-G-G、F-L-x-G、H-x(8)-D/E、G-x-S-G和R-G,其中Motif H-x(8)-D/E和G-x-S-G包含絲氨酸蛋白酶Peptidase_S30的3個活性位點(H192、D201、S235)(圖 4:A 和 C)。

圖2 重組的檢測和驗證

圖3 分支間的P1基因的特征比較

圖4 P1蛋白結(jié)構(gòu)預測

I-TASSER服務(wù)器返回 P1蛋白三級結(jié)構(gòu),結(jié)果顯示12個福建分離物的P1蛋白存在3種不同的空間結(jié)構(gòu),經(jīng)PyMOL渲染后如圖3C所示,其中分離物 XT04、LH14、LH21、LY08、LY35、XQ04、ZL02的P1蛋白三級結(jié)構(gòu)為N Clade型; 分離物QK44、XT02、XT08、LH05的P1蛋白三級結(jié)構(gòu)為N×O Clade型; LY30分離物的P1蛋白三級結(jié)構(gòu)為O Clade型。N Clade型和O Clade 型的P1蛋白三級結(jié)構(gòu)較為接近,但是N×O Clade型的P1蛋白三級結(jié)構(gòu)與前兩者差別大(圖4B),且P1蛋白的3個活性位點(H192、D201和S235)在空間上相距較遠。

3 討 論

3.1 P1基因的遺傳變異及分子進化

高度變異性是RNA病毒的典型特征之一,主要由于依賴 RNA 的 RNA 聚合酶(RdRp)或復制酶缺乏校正功能,使得 RNA病毒具有非常高的突變率(約為 10-4個核苷酸/復制循環(huán)),這也是 RNA 病毒的一種進化策略[22,23]。前人研究表明,P1蛋白不論在長度及氨基酸序列上是所有Potyvirus中分化最明顯的一個蛋白[24]。ICTV報告規(guī)定同一種病毒的全基因組核苷酸序列的同源性不低于85%,3′端非編碼區(qū)序列同源性不低于75%,CP蛋白的氨基酸序列同源性不低于80%[4]。PVY福建分離物P1基因具有高度的變異性,12個不同分離物P1基因之間以及與已知株系的其他分離物核苷酸序列一致性均在 73%～99%之間(表 2),已跨越了Potyvirus劃分種的序列一致性閾值[4],Valli等[24]認為PotyvirusP1基因的高度變異性與其適應(yīng)不同的寄主密切相關(guān)。

在Potyvirus中,基因重組是病毒進化的一個重要機制[25],通過基因重組可以產(chǎn)生大量的遺傳變異,這遠比僅僅由突變造成的變異來得更快[26]。除了高突變率外,基因重組在 PVY 基因組中也頻繁發(fā)生。Simplot和 GARD重組分析結(jié)果,顯示福建分離物QK44、XT02、XT08、LH05分離物的P1基因存在明顯的基因重組現(xiàn)象,即由PVYN和PVYO株系在P1基因區(qū)段不同位置發(fā)生重組(圖2)。在4個分離物中,GARD檢測到兩個重組位點(309 nt和423 nt),其中 309 nt的重組位點平均模型支持率達99.32%,經(jīng)KH檢驗極其顯著(P< 0.01),表明該位點為福建分離物P1基因重組位點的置信度非常高。綜合P1基因的分子變異分析結(jié)果,表明福建分離物P1基因的變異主要源自堿基位點的突變和基因重組,說明兩者在 PVY進化中起著重要的作用,是 PVY新株系不斷形成的主要因素。

系統(tǒng)發(fā)育分析顯示(圖3A),PVYP1基因分化明顯,12個福建分離物形成3種不同的大簇,故而單獨使用P1基因序列為分子標記進行系統(tǒng)發(fā)育分析,無法對 PVY 重組株系進行準確鑒定,如圖 3A 中HN1分離物(PVYNTN株系)和 HN2分離物(PVYNTN-NW株系),兩者分屬不同的株系,但因在P1基因區(qū)段上均為 N株系型(N Clade)而聚為一簇(Cluster 1)。當筆者聯(lián)合P1和CP基因分析顯示,12個福建分離物中僅 LY30為 PVYO株系,而其他11個福建分離物均為 N×O重組株系(未發(fā)表數(shù)據(jù)),表明重組株系已成為福建PVY的主流。因此,生產(chǎn)中需要密切關(guān)注這些分離物的發(fā)展動態(tài)。

3.2 P1蛋白的結(jié)構(gòu)特征

CC domain是蛋白質(zhì)中一類特殊的α螺旋鏈互相纏繞形成的平行或反平行同寡聚體或異寡聚體結(jié)構(gòu)的總稱,是控制蛋白質(zhì)寡聚化的元件[27]。前人研究表明,CC domain 在病毒復制、致病性以及增強病毒RNA沉默抑制子(Viral suppressor of RNA silencing,VSR)活性中起著重要的作用[28～30]。P1基因位于PVY基因組的起始位置,編碼絲氨酸蛋白酶(P1 peptidase),是病毒基因復制中的一個輔助因子,在致病性和增強VSR等方面也起著重要的作用[31～33]。通過Coiled-coil server分析結(jié)果顯示,N Clade型的分離物含有典型的CC domain,而O Clade型和N×O Clade型分離物的CC domain則不明顯,這可能是不同株系侵染寄主時產(chǎn)生表現(xiàn)不同病癥的原因。

雖然 P1蛋白在氨基酸序列上存在高度的變異性(表3),但還是存在多個保守的 Motif(圖 4A),且行使P1蛋白功能密切相關(guān)的3個活性位點所在的氨基酸殘基均保持不變(圖 4A),從而保證該蛋白酶發(fā)揮正常的功能。比較N Clade、N×O Clade和O Clade 3種類型的P1蛋白活性位點空間位置(圖4B),顯示3個活性位點在空間位置相距較遠,可能影響P1蛋白酶的活性強弱。蛋白質(zhì)的生物學功能在很大程度上取決于蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu),三級結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預的最終目的[34]。弄清PVY P1蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征,對于了解P1蛋白結(jié)構(gòu)與其功能的關(guān)系具有重要的意義。

本文通過擴增、克隆12個PVY福建分離物P1基因的cDNA全長序列,并通過系列分析表明PVYP1基因的變異源主要來自堿基突變,但部分分離物也存在明顯的基因重組現(xiàn)象。同時,重組株系已成為福建馬鈴薯主栽區(qū)的主流。雖然P1基因高度變異,但行使 P1 proteinase 活性位點所在的 3個氨基酸(H192、D201和 V235)卻高度保守,從而保證該蛋白酶發(fā)揮正常的功能。

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