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    TBA-Pb2+-hemin模擬酶催化顯色法測定水中痕量鉛

    2014-05-10 00:46:58劉珊渡楊雪蔚周武雄王永生
    應(yīng)用化工 2014年3期
    關(guān)鍵詞:結(jié)果表明緩沖液水樣

    劉珊渡,楊雪蔚,周武雄,王永生

    (南華大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,湖南衡陽 421001)

    鉛是一種環(huán)境中普遍存在的重金屬污染物,有蓄積毒性,能造成人體多器官、多系統(tǒng)的損害[1]。因此,環(huán)境中鉛的檢測尤為重要。目前,鉛的檢測方法主要有原子吸收法[2]、分光光度法[3]、電化學(xué)方法[4]等。但要實(shí)現(xiàn)快速、低成本、穩(wěn)定、靈敏的檢測,仍然是一個(gè)具有挑戰(zhàn)性的課題。

    近年來,適體由于其特異性和穩(wěn)定性好而被廣泛應(yīng)用于生物傳感領(lǐng)域。凝血酶適體(TBA)(序列為 5'-GGT TGG TGT GGT TGG-3')[5],能特異性地結(jié)合 Pb2+,形成 G-四聚體結(jié)構(gòu)[6]。

    本文基于該G-四聚體與氯化血紅素(hemin)結(jié)合后,形成辣根過氧化物模擬酶[7],可催化H2O2氧化 2,2'-連氮-雙(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS),生成藍(lán)綠色自由基產(chǎn)物,導(dǎo)致體系在416 nm處的吸光度增加的原理,建立測定Pb2+的比色新方法,并應(yīng)用于環(huán)境水樣測定。

    1 實(shí)驗(yàn)部分

    1.1 試劑與儀器

    硝酸鉛、Tris-HCl緩沖液等均為分析純;TBA,色譜純;實(shí)驗(yàn)用水為滅菌二次蒸餾水。

    UV2550型紫外-可見分光光度計(jì);AB204-S型電子分析天平;HH-W21-600型電熱恒溫水浴箱;PB-21精密酸度計(jì)。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    于1.5 mL EP 中,依次加入 0.1 mol/L pH 7.4的 Tris-HCl緩沖液 200 μL,1.0 × 10-6mol/L TBA溶液50 μL,1.0 ×10-7mol/L 鉛標(biāo)準(zhǔn)溶液適量,室溫反應(yīng)40 min。加入2.0×10-5mol/L hemin溶液50 μL,放置 60 min。加入 5.0 × 10-3mol/L ABTS溶液 50 μL 和 1.2 ×10-2mol/L H2O2溶液 50 μL,用蒸餾水稀釋至500 μL,避光放置10 min。在紫外-可見分光光度計(jì)上200~700 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描,得到吸收光譜。取最大吸收波長415 nm處的吸光度值A(chǔ)和試劑空白A0,得到△A=A-A0。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 吸收光譜

    由圖1可知,TBA-hemin-ABTS-H2O2體系在415 nm處的吸光度值很低,加入Pb2+后,體系在415 nm的吸光度增強(qiáng)(圖1A)??赡艿睦碛墒牵琍b2+能夠促進(jìn)富G序列的凝血酶適體(TBA)生成G-四聚體結(jié)構(gòu),G-四聚體和氯化血紅素復(fù)合物具有過氧化物模擬酶活性,能夠催化H2O2氧化2,2'-連氮-雙(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS),生成藍(lán)綠色自由基產(chǎn)物,導(dǎo)致體系在416 nm處的吸光度增加。隨著體系Pb2+濃度的增加,體系的吸光度值相應(yīng)增加,并在一定范圍內(nèi)與Pb2+濃度具有良好的線性關(guān)系(圖1B)。據(jù)此,建立了DNA模擬酶催化顯色法測定Pb2+的新方法。

    圖1 Pb2+測定體系吸收光譜Fig.1 Absorption spectra of Pb2+systemA:cPb2+=2.0 ×10-9mol/L,cTBA=1.0 ×10-7mol/L;B:cPb2+:(1 ~7)/(×10-9mol/L)=0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.5,2.0

    2.2 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

    2.2.1 緩沖體系的選擇 實(shí)驗(yàn)了 Tris-HCl、Tris-CH3COOH和HEPES三種緩沖液對體系的影響。結(jié)果表明,體系在Tris-HCl緩沖溶液中△A最大,線性關(guān)系最好;進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)不同pH的影響,結(jié)果表明,pH 在6.8~7.4之間△A 逐漸增大,7.4 ~7.6 之間△A較大且穩(wěn)定,7.6~8.0之間△A逐漸減小,因此,實(shí)驗(yàn)選擇pH 7.5的Tris-HCl緩沖溶液。

    2.2.2 TBA用量的選擇 研究了TBA濃度對于體系的影響,結(jié)果表明,TBA 濃度在 0.2×10-7~1.0×10-7mol/L逐漸升高,當(dāng)濃度 達(dá)到 1.0 ×10-7mol/L時(shí)趨于穩(wěn)定。因此,體系TBA濃度選擇1.0 ×10-7mol/L。

    2.2.3 Hemin用量的選擇 研究了hemin的用量對反應(yīng)體系的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明hemin用量在10~40 μL 范圍內(nèi),ΔA 逐漸增大,40~60 μL 范圍內(nèi)趨于穩(wěn)定,>60 μL后,ΔA逐漸減小。所以實(shí)驗(yàn)選擇2.0 ×10-5mol/L hemin 用量為50 μL。

    2.2.4 c(ABTS):c(H2O2)的選擇 結(jié)果顯示,當(dāng)c(ABTS)∶c(H2O2)為1∶2.4時(shí),ΔA最大且基本恒定,而當(dāng)ABTS的量過多或過少時(shí),ΔA均減小。故實(shí)驗(yàn)選擇 c(ABTS):c(H2O2)=1∶2.4。

    2.2.5 反應(yīng)溫度及時(shí)間的影響 實(shí)驗(yàn)了20~100℃以及10~100 min內(nèi),反應(yīng)體系吸光度的變化,結(jié)果表明,選擇20~25℃下,反應(yīng)40~60 min時(shí),體系ΔA最大且基本穩(wěn)定。

    2.2.6 試劑加入順序的影響 在以上優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件,設(shè)計(jì)不同試劑加入順序,分別測定其吸光度變化值。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),以Tris-HCl→TBA→Pb2+→ Hemin→ABTS→H2O2→H2O的加入順序所得體系的△A最大。

    2.2.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢測限與精密度 按以上優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件,分別測定吸光度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,線性范圍為 1.07 ×10-10~6.01 ×10-7mol/L,線性回歸方程為 ΔA=0.409c(×10-9mol/L)+40.7,相關(guān)系數(shù) r=0.996 6;對 Pb2+為1.5 ×10-8,6.0 ×10-8,1.5 ×10-7mol/L 的 3 種標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行7次平行測定,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.67%,1.25%和 3.45%;經(jīng) 11 次空白平行測定,按照 CL=3Sb/k公式計(jì)算,檢出限為 3.21×10-11mol/L。

    2.3 共存物質(zhì)的影響

    根據(jù)可能共存的實(shí)際情況,考察了多種干擾物質(zhì)對測定結(jié)果的影響,結(jié)果表明,當(dāng)相對誤差控制在±5% 以內(nèi)時(shí):500 倍量的 Fe3+、Cu2+、Ca2+、Mg2+、Mn2+、Al3+、Zn2+、Ba2+、Fe2+、Ni+、Co2+、Cr3+、Cd2+、Cl-、NO3-;10 倍量的 Na+、Hg+、K+均不干擾測定。

    2.4 樣品分析

    采集了2份分別來自湘江不同水域的水樣。按本實(shí)驗(yàn)方法對每份樣品做6次平行測定,并進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn),結(jié)果見表1。

    表1 環(huán)境水樣測定結(jié)果(n=6)Table 1 The determination results of Pb2+in environmental water samples

    3 結(jié)論

    在pH 7.5 Tris-HCl緩沖溶液中,以TBA為識別元件,ABTS為顯色劑,建立了基于過氧化物模擬酶的鉛離子比色檢測新方法。方法線性范圍為1.07×10-10~ 6.01 × 10-7mol/L,檢出 限 為 3.21 ×10-11mol/L,方法靈敏度高、特異性好,結(jié)果滿意。

    [1]金海麗.鉛毒性的研究進(jìn)展[J].廣東微量元素科學(xué),2004,11(10):9-14.

    [2]Chen J,Teo K C.Determination of cadmium,copper,lead and zinc in water samples by flame atomic absorption spectrometry after cloud point extraction[J].Analytica Chimica Acta,2001,450(1):215-222.

    [3]Ahmed M J,Mamun M A.Spectrophotometric determination of lead in industrial,environmental,biological and soil samples using 2,5-dimercapto-1,3,4-thiadiazole[J].Talanta,2001,55(1):43-54.

    [4]Huang M R,Gu G L,Shi F Y,et al.Development of potentiometric lead ion sensors based on ionophores bearing oxygen/sulfur-containing functional groups[J].Chinese Journal of Analytical Chemistry,2012,40(1):50-58.

    [5]白金,燕淤搖,馬福祥,等.水樣中鉛離子含量的測定[J].大學(xué)化學(xué),2013,28(1):37-39

    [6]付曉蓓.共振瑞利散射測定孔雀石綠,鉛和凝血酶的新方法研究[D].重慶:西南大學(xué),2012.

    [7]李旺.金屬納米粒子與DNAzyme在電化學(xué)與比色傳感中的研究與應(yīng)用[D].長沙:湖南大學(xué),2011.

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