8種多糖的單糖組成、活性及其相關(guān)性分析

倪力軍，王媛媛，何婉瑛，張立國

(華東理工大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院，上海 200237)

多糖廣泛存在于較多植物與中藥材中，研究表明多糖是由 10個(gè)以上單糖通過糖苷鍵連接而成的聚糖，其具有免疫調(diào)節(jié)[1]，抗氧化、抗病毒、抗炎等多種生物活性[2]．多糖中的單糖組成分析是研究多糖的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)及構(gòu)效關(guān)系的一項(xiàng)基本內(nèi)容．PMP柱前衍生化-高效液相色譜法反應(yīng)條件溫和，操作簡便，重現(xiàn)性良好[3]，被廣泛應(yīng)用于多糖的單糖組成測(cè)定．目前對(duì)多糖的結(jié)構(gòu)及生物活性研究通常是就某種單一中藥多糖獨(dú)立展開[4-6]，鮮見將不同中藥多糖進(jìn)行系列研究與比較的報(bào)道，故難以發(fā)現(xiàn)其中的規(guī)律與多糖產(chǎn)生功效的作用機(jī)制．多糖的活性與其化學(xué)結(jié)構(gòu)有著密切的關(guān)系[7]，對(duì)不同中藥材中多糖的單糖組成進(jìn)行分析并研究其與多糖活性間的關(guān)系對(duì)多糖的構(gòu)效關(guān)系研究具有重要意義．為此，筆者選取 8種中藥材，提取其水溶性多糖，并進(jìn)行其多糖含量、單糖組成分析及清除 DPPH自由基能力的測(cè)定，利用多元統(tǒng)計(jì)方法分析多糖樣品的差異性、不同多糖樣品中各單糖之間及單糖與體外抗氧化活性間的相關(guān)性，探究單糖組成對(duì)體外抗氧化活性的影響，為不同中藥材中多糖的功效評(píng)價(jià)及多糖結(jié)構(gòu)與活性間的關(guān)系研究提供基礎(chǔ).

1 材料、試劑與儀器

中藥材包括：黃芪Astragali Radix，批號(hào)YT2011080802，上海余天成中藥飲片有限公司；三七Notoginseng Radix Et Rhizoma，購于上海華宇藥業(yè)集團(tuán)有限公司；麻黃Ephedrae Herba、蒼術(shù)Atractylodis Rhizoma、甘草Glycyrrhizae Radix Rhizoma、川牛膝Cyathulae Radix，批號(hào)分別為 y412-100601-12、y002-101001-2、y013-1103-1、y012-110401-1，由承德頸復(fù)康藥業(yè)集團(tuán)有限公司提供；桑寄生Taxilli Herba，由承德頸復(fù)康藥業(yè)集團(tuán)有限公司提供；淫羊藿Epimedii Folium，購于安徽亳州．

試劑包括：D-甘露糖(Man)、D-核糖(Rib)、鼠李糖(Rha)、D-葡萄糖醛酸(GlcU)、D-半乳糖醛酸(GalU)、D-無水葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、D-木糖(Xyl)、阿拉伯糖(Ara)標(biāo)準(zhǔn)品，中國藥品生物制品檢定所)；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)，AR，阿拉丁化學(xué)試劑有限公司；乙腈，GR，德國默克公司；1,1-二苯基-2-苦基肼DPPH，AR，阿拉丁化學(xué)試劑有限公司；NaOH、HCl等試劑均為分析純．

儀器包括：LC-20AD XR型高效液相色譜儀(HPLC，PDA檢測(cè)器，日本島津國際貿(mào)易有限公司)；T6新世紀(jì)型紫外分光光度計(jì)(UV，北京普析通用儀器有限公司)；DZF-6050型真空干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；TDL-5-A 型離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠).

2 方 法

2.1 多糖樣品的制備

利用水提醇沉法提取 8種藥材中的多糖，Sevag法除蛋白，大孔樹脂法脫色，超濾法除去小分子雜質(zhì)，真空干燥．

2.2 樣品中多糖含量的測(cè)定

稱取各多糖樣品 10,mg，去離子水定容到100,mL，配制 0.1,g/L的樣品溶液．量取 600,μL進(jìn)行苯酚-硫酸法顯色反應(yīng)[8]，以去離子水顯色作為空白，在 490,nm 波長處測(cè)量吸光度值，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其多糖含量．

2.3 單糖組成的測(cè)定

2.3.1 色譜條件

色譜柱為Inertsil ODS-SP C18柱(日本島津國際貿(mào)易有限公司)，流動(dòng)相為 KH2,PO4-三乙胺緩沖溶液(pH＝6.90)-乙腈(體積比 80∶20)，流速 1,mL/min，檢測(cè)波長250,nm，進(jìn)樣體積10,μL，柱溫30,℃．

2.3.2 多糖的水解

稱取各多糖樣品 30,mg，分別溶于 2,mL,2,mol/L的 H2SO4溶液中，110,℃烘箱中水解 2,h．用 4,mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為中性，用純水稀釋到5,mL，離心，上清液待衍生化．

2.3.3 單糖標(biāo)準(zhǔn)品的衍生化

稱取 D-甘露糖 4.6,mg、D-核糖 4.3,mg、鼠李糖4.5,mg、D-葡萄糖醛酸 4.6,mg、D-半乳糖醛酸4.5,mg、D-無水葡萄糖 4.3,mg、半乳糖 4.2,mg、D-木糖 4.6,mg、阿拉伯糖 4.1,mg，用純水定容到 5,mL，配制混合單糖標(biāo)準(zhǔn)溶液．量取混合單糖標(biāo)準(zhǔn)溶液50,μL，加 0.3,mol/L NaOH 溶液 100,μL、0.5,mol/L PMP 溶液 100,μL，混勻，70,℃水浴 100,min，取出，冷卻 10,min．加入 100,μL 0.3,mol/L HCl溶液中和，用純水補(bǔ)至 500,μL，加 500,μL 氯仿萃取，渦旋振蕩5,min，離心 5,min，棄去下層有機(jī)相，重復(fù)萃取 3次．上清液用純水補(bǔ)至1,mL，用0.22,μm微孔濾膜過濾，取10,μL進(jìn)行HPLC分析．

2.3.4 樣品的衍生化

取各水解后的多糖樣品 50,μL，進(jìn)行衍生化操作，步驟同第2.3.3節(jié)，取10,uL進(jìn)行HPLC分析．

2.4 多糖樣品清除DPPH自由基能力的測(cè)定

配制各多糖溶液 5.0,mg/mL，并分別稀釋到0.5,mg/mL、1.0,mg/mL、2.0,mg/mL、3.0,mg/mL、4.0,mg/mL，備用．取各質(zhì)量濃度多糖溶液 2.0,mL作為樣品管，加入 0.04,g/L的 DPPH 溶液 2.0,mL，混勻，靜置30,min，離心．以去離子水清零，測(cè)量上清液在 517,nm波長處的吸光度值．以去離子水代替多糖溶液作為空白管，無水乙醇代替 DPPH溶液作為本底管．對(duì)質(zhì)量濃度-清除率曲線進(jìn)行擬合并計(jì)算各樣品清除DPPH自由基能力的IC50值[9]．

清除率計(jì)算式為

式中：E(DPPH)為DPPH 自由基清除率；Ai為樣品管吸光度值；Aj為本底管吸光度值；A0為空白管吸光度值．

2.5 數(shù)據(jù)分析及單糖-抗氧化活性的相關(guān)性分析2.5.1 數(shù)據(jù)預(yù)處理

對(duì)各多糖樣品的色譜峰進(jìn)行定性，確定單糖組成，利用單糖混合標(biāo)準(zhǔn)品制定的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各樣品中單糖的質(zhì)量濃度，除以樣品中多糖含量，換算成多糖含量為 100%時(shí)各多糖樣品中的單糖含量．以單糖混合標(biāo)準(zhǔn)品作為樣品匹配庫，對(duì)各多糖樣品的 HPLC譜圖進(jìn)行匹配，以保留時(shí)間為橫坐標(biāo)，單糖質(zhì)量濃度作為縱坐標(biāo)，將橫坐標(biāo)不匹配的點(diǎn)對(duì)應(yīng)的縱坐標(biāo)賦值為零，處理后所有譜圖有統(tǒng)一的橫坐標(biāo)．為消除單糖含量量級(jí)差異的影響，對(duì)其進(jìn)行開 4次方預(yù)處理；將各樣品清除 DPPH自由基的 IC50值乘以對(duì)應(yīng)的多糖含量，換算成多糖含量為 100%時(shí)各樣品清除 DPPH自由基的IC50值．

2.5.2 數(shù)據(jù)分析方法

對(duì)8個(gè)樣品 HPLC圖譜進(jìn)行主成分分析后在前3個(gè)主成分空間進(jìn)行投影，觀察樣品投影圖的分布以判斷樣品間的差異性；以開4次方的各樣品中單糖含量為自變量 X，活性數(shù)據(jù)(1/IC50)為因變量 Y，進(jìn)行各單糖組成之間、各單糖與體外抗氧化活性之間的簡單相關(guān)分析，探究各單糖間是否相關(guān)及各單糖與體外抗氧化活性是否相關(guān)；對(duì)開4次方的各樣品單糖含量進(jìn)行自標(biāo)度化預(yù)處理[10]后進(jìn)行主成分分析，取前 6個(gè)主成分與 Y進(jìn)行典型相關(guān)分析[10]，根據(jù)典型相關(guān)系數(shù)判斷單糖組成與抗氧化活性的整體相關(guān)性．

3 結(jié)果與討論

3.1 多糖含量

表 1為各多糖收率及含量．由表1可知，8個(gè)樣品的各多糖含量差異較大，川牛膝、三七、黃芪、蒼術(shù)多糖的含量高達(dá)50%以上；其他4種多糖的含量低于40%．多糖收率(%)和含量(%)的計(jì)算式分別為

表1 各多糖收率及含量Tab.1 Yield and content of polysaccharides

3.2 單糖組成及含量

圖1和圖2表明本文建立的PMP柱前衍生化-高效液相色譜方法對(duì)各樣品有良好的分離效果，并且水解后的 8個(gè)多糖樣品主要由 Man、Rib、Rha、GlcU、GalU、Glc、Gal、Xyl、Ara或其中的部分單糖組成.

圖1 單糖標(biāo)準(zhǔn)品PMP-衍生物的色譜圖Fig.1 Chromatograms of 1-phenyl-3-methyl 5-pyrazolone (PMP)-derivatives of monosaccharides

圖2 8種多糖水解后的PMP-衍生物的色譜圖Fig.2 Chromatograms of PMP-derivatives of acid hydrolyzates of eight polysaccharides

3.3 多糖清除DPPH自由基能力

由表2可知，8種多糖清除DPPH自由基的能力順序?yàn)椋阂蜣蕉嗵牵旧＜纳嗵牵韭辄S多糖＞甘草多糖＞黃芪多糖＞三七多糖＞蒼術(shù)多糖＞川牛膝多糖．將表2與表1結(jié)合可見，清除DPPH自由基能力較強(qiáng)的淫羊藿多糖、桑寄生多糖、麻黃多糖與甘草多糖中的多糖含量并不高(均低于40%)，但多糖含量最高的川牛膝多糖的抗氧化活性反而最低．這一結(jié)果表明植物多糖的活性不取決于多糖含量，而是與其微觀結(jié)構(gòu)性質(zhì)相關(guān)．

表2 8種多糖清除DPPH自由基的IC50值Tab.2 IC50value of cleaning DPPH free radical of eight polysaccharides

3.4 HPLC譜圖匹配與主成分分析

表 3表明 8個(gè)多糖提取物的單糖組成不盡相同．其中甘草多糖與麻黃多糖，淫羊藿多糖與桑寄生多糖，三七多糖、蒼術(shù)多糖與川牛膝多糖提取物中的單糖組成相同，黃芪多糖的單糖組成與其他多糖均不同．Man、GalU、Glc、Gal與 Ara為 8個(gè)多糖樣品中的共有單糖；而 GlcU僅存在于麻黃與甘草多糖中；Xyl僅存在于麻黃、甘草、桑寄生與淫羊藿多糖中．從圖 3可知，單糖組成相同的淫羊藿多糖與桑寄生多糖、麻黃多糖與甘草多糖在主成分空間分布比較接近；黃芪多糖的單糖組分與其他 7種多糖不同，相距其他樣品很遠(yuǎn)；單糖組成相同的蒼術(shù)多糖、三七多糖及川牛膝多糖在主成分空間分布較為分散，說明本文制備的多糖樣品差異較大，具有一定的代表性．

表3 基于圖2中8個(gè)樣品的HPLC數(shù)據(jù)匹配結(jié)果Tab.3 Matching results of HPLC chromatograms of the eight polysaccharides based on Fig.2 mg/L

圖3 基于表3的8個(gè)多糖樣品的主成分投影Fig.3 Principal component projection of the eight poly saccharides based on Tab.3

3.5 單糖組成與體外抗氧化活性相關(guān)性分析

由表 4可以看出，單糖 Man與 Rha、Xyl、Ara間以及GlcU與GalU、Ara間的相關(guān)系數(shù)均大于0.8，說明這幾個(gè)單糖含量有強(qiáng)的正相關(guān)性，除 Glc外，各單糖之間的相關(guān)系數(shù)最小也在 0.5之上，表明這些單糖間有較強(qiáng)的正相關(guān)．除 Glc外，其余單糖與 1/IC50間的相關(guān)系數(shù)均為正(＞0.4)，說明樣品中這 7個(gè)單糖與抗氧化活性間具有一定的正相關(guān)，其中 Man、Xyl與 1/IC50的相關(guān)系數(shù)分別為0.814,5與0.969,2，表明這兩種單糖與抗氧化活性有強(qiáng)相關(guān)性．Glc與其他單糖及 1/IC50的相關(guān)系數(shù)很小甚至為負(fù)，表明該單糖的存在對(duì)清除 DPPH自由基能力沒有多大貢獻(xiàn)，甚至不利于該活性．

典型相關(guān)分析中，第一典型相關(guān)系數(shù)為 0.844,4，表明樣品的單糖組成與抗氧化活性有良好的整體相關(guān)性．

結(jié)合表 2與表 3，發(fā)現(xiàn)抗氧化活性強(qiáng)的淫羊藿、桑寄生、麻黃與甘草多糖的單糖組成中均含有 Xyl，而川牛膝、三七、黃芪、蒼術(shù) 4個(gè)抗氧化活性較弱的多糖樣品的單糖組成中不含 Xyl，另外唯有麻黃與甘草多糖的單糖組成含有 GlcU．鑒于 Xyl與 1/IC50相關(guān)系數(shù)較高，可推斷Xyl與GlcU有助于提高淫羊藿等 4個(gè)多糖的抗氧化活性．抗氧化活性較弱的川牛膝多糖、蒼術(shù)多糖與三七多糖，其單糖組成相同但含量不同，其活性弱于以淫羊藿為代表的 4個(gè)多糖，原因可能在于沒有彼組的兩個(gè)特有單糖 Xyl和 GlcU.黃芪多糖單糖組成及含量不同于上述兩組多糖樣品，其抗氧化活性居于中游．

表4 各單糖之間、各單糖與1/IC50簡單相關(guān)關(guān)系分析結(jié)果Tab.4 Results of simple correlation analysis between monosaccharides，each monosaccharide and 1/IC50

4 結(jié) 語

8種中藥材多糖的單糖組成及含量具有較大差異，且其清除 DPPH自由基的活性強(qiáng)度不同；單糖組成類似的多糖樣品，其體外抗氧化活性大小也較為相近；除 Glc外的 7個(gè)單糖之間、7種單糖與多糖樣品的體外抗氧化活性均有較強(qiáng)的正相關(guān)；單糖組成與體外抗氧化活性之間存在較強(qiáng)的整體相關(guān)性，含有GlcU、Xyl的多糖樣品抗氧化活性明顯高于沒有這兩種單糖的樣品．單糖組成對(duì)多糖抗氧化活性的具體影響方式與強(qiáng)度有待通過制備更多的代表性樣品進(jìn)行研究．

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